燈盞花素與牛血清白蛋白相互作用的光譜學(xué)研究

孫國章 ，何 瑩，尹照瑞 ，黃慶玉 ，李鳳麗

（1.天津天士力現(xiàn)代中藥資源有限公司，天津300193； 2.天津雅昂醫(yī)藥國際化發(fā)展促進(jìn)有限公司天津300193；3.天津市石天藥業(yè)有限責(zé)任公司，天津300193； 4.天津天士力之驕藥業(yè)有限公司，天津300193；5.天津中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，天津300193）

血清白蛋白是血漿中含量最豐富的載體蛋白，能與多種外源性和內(nèi)源性物質(zhì)結(jié)合，發(fā)揮轉(zhuǎn)運(yùn)、存儲(chǔ)等功能，即血清白蛋白調(diào)控著大多數(shù)物質(zhì)在生物體內(nèi)的分配過程［1］。血清白蛋白因其本身能結(jié)合藥物并搬運(yùn)至靶標(biāo)位置的特性，備受化學(xué)醫(yī)學(xué)領(lǐng)域、生物科學(xué)領(lǐng)域等研究者的關(guān)注［2-5］。因此研究藥物與血清白蛋白之間的相互作用，有助于充分認(rèn)識(shí)藥物在體內(nèi)的轉(zhuǎn)運(yùn)、分布、代謝及消除過程，闡明藥物的作用機(jī)制和熱力學(xué)特性，對(duì)藥代動(dòng)力學(xué)及藥物的毒性都有非常重要的意義，也有助于新藥的開發(fā)與優(yōu)化。

牛血清白蛋白（Bovine serum albumin，BSA）和人血清白蛋白（Human serum albumin，HSA）結(jié)構(gòu)極其相似，二者的同源性高達(dá)76.5%［6］，在水中的溶解性和穩(wěn)定性與HSA 相比具有高度的相似性。BSA 簡單易得，成本低，因此常被用作HSA 的可靠替代品。

燈盞花素（Breviscapine，BR）具有抗血小板聚集、擴(kuò)張血管、增加血流量、改善微循環(huán)等藥理作用，在治療心腦血管疾病方面有良好的療效［7］。目前BR 制劑廣泛應(yīng)用于臨床，但在分子水平上研究BR 與生物大分子相互作用的文獻(xiàn)報(bào)道甚少。本研究采用不同的光譜技術(shù)在擬生理（pH=7.4）條件下，研究BR 與BSA 之間的相互作用，一方面有助于了解BR 在人體內(nèi)如何與血清白蛋白進(jìn)行結(jié)合和轉(zhuǎn)運(yùn)；另一方面也為篩選優(yōu)良的天然藥物和藥物分子的設(shè)計(jì)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

日立F-4600 熒光分光光度計(jì)（天美科學(xué)儀器公司）；日立U-2910 紫外-可見分光光度計(jì)（天美科學(xué)儀器公司）；Chirascan Plus 多功能圓二色譜儀（英國應(yīng)用光物理公司）；FA-2004N 電子分析天平（上海菁海儀器有限公司）；HH-501A 數(shù)顯恒溫水浴鍋（常州亞特實(shí)驗(yàn)儀器有限公司），移液槍（上海榮泰生化工程有限公司）。

牛血清白蛋白（北京索萊寶科技有限公司，純度≥ 99.5%，批號(hào)：1211Y054）；BR（湖南恒生制藥有限公司，純度≥ 98%，批號(hào)：HB20171102）；其他試劑均為國產(chǎn)分析純；實(shí)驗(yàn)用水為二次蒸餾水。

1.2 紫外-可見分光光度法

在編號(hào)為 1～10 的10 mL 棕色容量瓶中分別加入 0.1 mol/L 的 Tris-HCl 緩沖溶液 1.00 mL、2.0×10-5mol/L 的 BSA 溶液 1.00 mL，然后再依次加入 4.33×10-4mol/L 的 BR 溶液 0.00、0.10、0.20、0.30、0.40、0.50、0.60、0.70、0.80、0.90 mL，用雙蒸水定容至10 mL，搖勻，靜置30 min。待體系反應(yīng)完全后，按照標(biāo)號(hào)順序依次將溶液加入1 cm 石英比色皿中，以Tris-HCl 緩沖溶液為參比溶液，測(cè)定BR-BSA 體系的紫外吸收光譜。

1.3 熒光光譜法

1.3.1 熒光光譜測(cè)定 溶液的配制方法同“1.2 項(xiàng)”，選擇掃描方式為Emission，固定激發(fā)波長為280 nm，掃描范圍為290 nm～500 nm，分別在293 K、305 K 和310 K 溫度下測(cè)定BR-BSA 體系的熒光光譜。

1.3.2 同步熒光光譜 選擇掃描方式為Synchronous，固定發(fā)射與激發(fā)波長的差值Δλ1=15 nm、Δλ2=60 nm，掃描范圍為240 nm～400 nm，分別測(cè)定BRBSA 體系的同步熒光光譜。

2 結(jié)果與討論

2.1 紫外光譜法

BR-BSA 體系的紫外光譜見圖1。由圖可知，隨著BR 濃度的增大，體系在280 nm 附近的吸收峰強(qiáng)度逐漸增大，且最大吸收峰位置從279 nm 藍(lán)移到275 nm。280 nm 處的吸收峰是由BSA 中的酪氨酸（Tyr）殘基和色氨酸（Trp）殘基引起的，280 nm附近吸收峰增強(qiáng)并發(fā)生輕微藍(lán)移，表明BR 與BSA 之間發(fā)生了相互作用并且使BSA 的肽鏈結(jié)構(gòu)發(fā)生了輕微改變，BSA 分子內(nèi)部的Tyr 殘基和Trp 殘基的疏水基團(tuán)暴露出來，由于疏水基團(tuán)之間的疏水作用增強(qiáng)，導(dǎo)致吸收峰發(fā)生藍(lán)移。

圖1 BR-BSA 體系的紫外吸收光譜（T=293 K）

2.2 熒光光譜法

2.2.1 BR 對(duì)BSA 的熒光猝滅作用 熒光猝滅是指熒光物質(zhì)與溶劑分子之間發(fā)生相互作用，從而使物質(zhì)的熒光強(qiáng)度降低的現(xiàn)象。導(dǎo)致熒光物質(zhì)發(fā)生熒光猝滅的原因包括生成新的絡(luò)合物、分子間碰撞、重排和能量轉(zhuǎn)移等［8］。

由于BSA 含有苯丙氨酸殘基、酪氨酸殘基和色氨酸殘基使其具有內(nèi)源性熒光，其中，Trp 殘基熒光強(qiáng)度最大，而苯丙氨酸殘基的量子產(chǎn)率較低，熒光強(qiáng)度可忽略不計(jì)［9］。因此本研究將Tyr 殘基和Trp 殘基作為研究對(duì)象，選擇280 nm 作為激發(fā)波長，使Tyr 殘基和Trp 殘基的熒光同時(shí)被激發(fā)。保持BSA 的濃度不變，不斷增加BR 溶液的濃度，BR-BAS 體系的熒光光譜見圖2。由圖可知，最大發(fā)射波長為350 nm。隨著BR 濃度的增大，體系的熒光峰強(qiáng)度逐漸減弱，表明BR 對(duì)BSA 具有熒光猝滅作用。

圖2 BR-BSA 體系的熒光光譜（T=293 K）

2.2.2 BR 對(duì)BSA 構(gòu)象的影響 同步熒光光譜可進(jìn)一步了解Tyr 殘基和Trp 殘基周圍的微環(huán)境變化和疏水性的變化情況。Δλ=15 nm 的同步熒光光譜只表示酪氨酸殘基的光譜特性，而Δλ=60 nm 的同步熒光光譜僅表現(xiàn)色氨酸殘基的熒光光譜特性。BR-BSA 體系的同步熒光光譜見圖3、圖4，由圖可知，當(dāng)Δλ=15 nm 時(shí)，隨著 BR 濃度的增大，體系的熒光峰強(qiáng)度逐漸減弱，且最大發(fā)射波長λmax發(fā)生了輕微的藍(lán)移，λmax由289.4 nm 移至288.8 nm。當(dāng)Δλ=60 nm 時(shí)，體系的熒光峰強(qiáng)度出現(xiàn)了下降，最大發(fā)射波長λmax未發(fā)生移動(dòng)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果與高平章等［10］研究 BR 與 BSA 相互作用的實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致，進(jìn)一步證明BR 與BSA 相互作用過程中Tyr殘基和Trp 殘基所處微環(huán)境及微環(huán)境的疏水性改變很小，其肽鏈伸展程度變化甚微，即BR 的加入并沒有使BSA 中的Tyr 殘基和Trp 殘基的構(gòu)象發(fā)生明顯變化。

圖 3 BR-BSA 體系的同步熒光光譜（Δλ=15 nm，T=293 K）

圖 4 BR-BSA 體系的同步熒光光譜（Δλ=60 nm，T=293 K）

2.2.3 猝滅類型的確定 根據(jù)熒光猝滅機(jī)制，熒光猝滅類型分為靜態(tài)猝滅和動(dòng)態(tài)猝滅，靜態(tài)猝滅是指猝滅劑與熒光物質(zhì)之間形成了弱熒光或不發(fā)熒光的復(fù)合物；動(dòng)態(tài)猝滅是指猝滅劑與熒光物質(zhì)的激發(fā)態(tài)分子之間相互碰撞而導(dǎo)致熒光強(qiáng)度降低。對(duì)于動(dòng)態(tài)猝滅，隨著溫度的升高，分子的有效碰撞概率增大，電子轉(zhuǎn)移加劇，熒光物質(zhì)的猝滅常數(shù)隨溫度升高而增大；而對(duì)于靜態(tài)猝滅而言，隨溫度的升高，復(fù)合物的穩(wěn)定性會(huì)降低，猝滅常數(shù)減小。

假設(shè)BR 與BSA 屬于動(dòng)態(tài)猝滅，遵循Stem-Volmer 方程［11］：F0/F=1+Kqλ0[Q]=1+KSV[Q]，其中，F(xiàn)0和F 分別為加入BR 前后體系的熒光強(qiáng)度；[Q]為BR 的濃度，τ0為熒光物質(zhì)的平均壽命，約為10-8s；Kq 是體系的猝滅速率常數(shù)，KSV為 Stern-Volmer猝滅常數(shù)。

根據(jù) Stern-Volmer 方程，以（F0-F）/F 對(duì)[Q]作圖，得不同溫度下BR 對(duì)BSA 的Stern-Volmer 曲線（圖5），計(jì)算得速率常數(shù)和相關(guān)系數(shù)（表1）。

圖5 不同溫度下BR-BSA 體系的Stern-Volmer 曲線

表1 不同溫度下BR 和BSA 的線性方程及相關(guān)參數(shù)

由表1 可知，隨著溫度的升高，猝滅常數(shù)KSV的數(shù)值遞增，KSV 與溫度呈正相關(guān)則為動(dòng)態(tài)態(tài)猝滅；但是各溫度下的Kq 值均遠(yuǎn)大于最大動(dòng)態(tài)猝滅速率常數(shù)2×1010L/（mol·s），證明BR 與BSA 作用的猝滅類型為靜態(tài)-動(dòng)態(tài)聯(lián)合猝滅，其中靜態(tài)猝滅起主導(dǎo)作用。

2.2.4 結(jié)合常數(shù)、結(jié)合位點(diǎn)數(shù)和作用力類型的確定 靜態(tài)猝滅遵循Lineweaver-Bruk 雙倒數(shù)方程［11］：lg［（F0-F）/F］=lgK+nlg［Q］，其中，F(xiàn)0和 F 分別為加入BR 前后體系的熒光強(qiáng)度；[Q] 為BR 的濃度，K為結(jié)合常數(shù)，n 為結(jié)合位點(diǎn)數(shù)。

根據(jù) Lineweaver-Bruk 方程，以 lg［（F0-F）/F］對(duì)lg[Q]作圖，通過斜率和截距計(jì)算得結(jié)合常數(shù)和結(jié)合位點(diǎn)數(shù)，結(jié)果見表2。

表2 不同溫度下BR 與BSA 的表觀結(jié)合常數(shù)K 及結(jié)合位點(diǎn)數(shù)

由表2 可知，BR 與BSA 兩者結(jié)合位點(diǎn)數(shù) n約為1，即BSA 上只有一個(gè)BR 的結(jié)合位點(diǎn)，結(jié)合常數(shù)K 隨溫度的升高不斷減小，進(jìn)一步證明BR與BSA 的作用過程中靜態(tài)猝滅起主導(dǎo)作用。

根據(jù)藥物與蛋白質(zhì)反應(yīng)的熱力學(xué)參數(shù)的變化，可判斷藥物與蛋白質(zhì)之間的主要作用力類型。當(dāng)ΔH>0，ΔS>0 時(shí)，表明 BR-BSA 之間為疏水作用力；當(dāng)ΔH<0，ΔS>0 時(shí)，表明 BR-BSA 之間為靜電引力；當(dāng)ΔH<0，ΔS< 0 時(shí)，表明 BR-BSA 以范德華力或氫鍵作用力結(jié)合［12］。當(dāng)溫度變化不大時(shí)，反應(yīng)的焓變△H 可視為常數(shù)，結(jié)合公式 ln（K2/K1）=ΔH/R×（1/T1-1/T2），求出焓變?chǔ)，由公式ΔG=-RTlnK 求出反應(yīng)的自由能ΔG，再根據(jù)公式ΔG=ΔH-T△S，可求出熵變?chǔ)，見表 3。

表3 不同溫度下BR-BSA 體系的熱力學(xué)參數(shù)

由表 3 可知，ΔG<0，說明 BR 與 BSA 反應(yīng)過程可自發(fā)進(jìn)行。由于ΔH<0，說明該反應(yīng)過程是放熱過程，ΔH<0，ΔS>0，所以兩者之間作用力主要為靜電引力。

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)采用紫光譜法、熒光光譜法對(duì)BR-BSA體系的相互作用機(jī)制、作用力類型進(jìn)行了定性分析。研究結(jié)果表明，BR 對(duì)BSA 的熒光猝滅類型為靜態(tài)-動(dòng)態(tài)聯(lián)合猝滅，其中靜態(tài)猝滅起主導(dǎo)作用。在BSA 中逐步加入燈盞花素溶液后，BSA 的Tyr殘基和Trp 殘基所處的微環(huán)境沒有發(fā)生顯著改變，表明其內(nèi)疏水性并沒有改變，其肽鏈的伸展程度也未改變，所以可推斷出BSA 中Tyr 殘基和Trp 殘基的構(gòu)象在一定程度上沒有發(fā)生變化。由熱力學(xué)參數(shù)ΔH<0，ΔS>0，得出兩者之間的作用力主要是靜電引力，依據(jù)Lineweaver-Bruk 方程計(jì)算出結(jié)合位點(diǎn)數(shù)和不同溫度下的結(jié)合常數(shù)，兩者之間的結(jié)合距離有待進(jìn)一步研究。