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    基于惰性基質(zhì)固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)物聚谷氨酸的分離純化研究

    2020-07-16 00:55:26洪康進(jìn)臧毅鵬王夢(mèng)夢(mèng)聶光軍
    關(guān)鍵詞:粗品惰性脫色

    王 利,劉 寧,周 斌,洪康進(jìn),臧毅鵬,王夢(mèng)夢(mèng),聶光軍

    (安徽工程大學(xué) 生物與化學(xué)工程學(xué)院,安徽 蕪湖 241000)

    γ-聚谷氨酸(γ-PGA)是由谷氨酸單體通過(guò)α-氨基與γ-羧基形成γ-酰胺鍵而聚合成的氨基酸均聚物,熔點(diǎn)為223.5 ℃,熱分解溫度為253.9 ℃,具有可食性、吸水性與保水性、可生物降解、無(wú)毒和環(huán)境友好等特性,已被廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、食品、環(huán)境和護(hù)膚品等領(lǐng)域[1-4]。目前,困擾γ-PGA開(kāi)發(fā)應(yīng)用的主要問(wèn)題之一是分離純化[3],其分離純化成本與發(fā)酵液的復(fù)雜程度有著密切的聯(lián)系。液體發(fā)酵生產(chǎn)γ-PGA的主要問(wèn)題有:發(fā)酵液黏度較高,發(fā)酵液傳質(zhì)擴(kuò)散慢和溶氧量低下;液體發(fā)酵液成分復(fù)雜,副產(chǎn)物積累多,導(dǎo)致γ-PGA純化成本高[5]。固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)γ-PGA的常用基質(zhì)大多為農(nóng)業(yè)固體廢棄物,如稻殼、農(nóng)林業(yè)秸稈和下腳料等,這在一定程度上降低了生產(chǎn)成本,但因其可溶物的溶出作用導(dǎo)致發(fā)酵液顏色加深和副產(chǎn)物增加,從而導(dǎo)致γ-PGA的分離純化成本也相應(yīng)提高[6]。基于惰性固體基質(zhì)的發(fā)酵,增加菌絲體與營(yíng)養(yǎng)介質(zhì)接觸的比表面積,增加通氣量,提升γ-PGA產(chǎn)量,不僅可以有效避免液體發(fā)酵的諸多不足,而且可以最大程度降低發(fā)酵基質(zhì)組分的復(fù)雜程度,提升γ-PGA的分離純化效率。

    γ-PGA分離純化的主要內(nèi)容包括除菌、除蛋白和色素。高黏發(fā)酵液常用的除菌方法主要有高速離心法、絮凝法和微孔濾膜法[7-8],高速離心法需要多次離心,處理量??;絮凝法成本高;由于γ-PGA分子量大小與微濾膜孔徑相近,所以微孔濾膜法不易分離。除蛋白和色素的方法主要有有機(jī)溶劑沉淀法、化學(xué)沉淀法和膜分離法[9-10]。在單純應(yīng)用有機(jī)溶劑沉淀和化學(xué)沉淀分離γ-PGA時(shí),隨著發(fā)酵液組分復(fù)雜性的增加,分離步驟會(huì)增加,所用的有機(jī)試劑的量相應(yīng)增加,分離成本隨之增加。而膜分離中,膜成本高,易堵塞,分離效率低下。目前,發(fā)酵液的分離純化方法不針對(duì)于液態(tài)發(fā)酵液或固體發(fā)酵物,因固態(tài)發(fā)酵只需加入生理鹽水,震蕩后過(guò)濾去除固體基質(zhì),即可按液態(tài)發(fā)酵液分離純化。Wang[11]等通過(guò)稀釋發(fā)酵液除細(xì)胞,活性炭脫色和超濾,脫色88%,γ-PGA產(chǎn)量為35 g/L。但活性炭脫色時(shí)間短,脫色效率低;脫色時(shí)間長(zhǎng)會(huì)導(dǎo)致難以與γ-PGA分離。喬長(zhǎng)晟[12]等通過(guò)板框法除菌,酶解法除大分子多糖,活性炭法脫色,超濾法除小分子雜質(zhì),冷凍干燥得γ-PGA成品,γ-PGA純度達(dá)90%。效果較好但流程復(fù)雜,成本較高,耗時(shí)長(zhǎng)。Yuan[13]等用銅離子從發(fā)酵液中回收γ-PGA,后經(jīng)EDTA螯合銅離子,透析,冷凍干燥得γ-PGA,回收率達(dá)90%以上。操作相對(duì)簡(jiǎn)便,但用銅離子會(huì)造成污染,而EDTA價(jià)格昂貴,增加成本。為此,建立一種高效的分離純化方法對(duì)γ-PGA開(kāi)發(fā)應(yīng)用至關(guān)重要。

    選擇珍珠巖作為惰性基質(zhì)進(jìn)行固體發(fā)酵,因其化學(xué)穩(wěn)定性好,不參與反應(yīng),且可重復(fù)使用,可增大發(fā)酵基質(zhì)的利用效率和發(fā)酵過(guò)程中氧傳遞效率,有效提高γ-PGA的產(chǎn)量,降低其發(fā)酵液中雜質(zhì)的含量;再組合應(yīng)用醇沉、透析和萃取等方法,建立了一種綜合性純化策略。此法統(tǒng)籌考慮了生產(chǎn)與分離,簡(jiǎn)化了發(fā)酵液的預(yù)處理,降低了有機(jī)試劑的使用量,一定程度上降低了γ-PGA分離純化的成本,為γ-PGA的規(guī)?;a(chǎn)提供了參考依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 材料與儀器

    納豆菌(Bacillus Subtilis Natto)從市售納豆菌粉中分離篩選所得;乙醇、丙酮(分析純,國(guó)藥化學(xué)試劑有限公司);苯酚(分析純,上?;瘜W(xué)試劑廠);氯仿(分析純,阿拉丁試劑有限公司);商用γ-PGA(四川拙誠(chéng)日化科技有限公司)。

    種子培養(yǎng)基:葡萄糖20 g/L,蛋白胨10 g/L,牛肉膏5 g/L,蒸餾水1 L,pH 7.0;斜面培養(yǎng)基:成分同種子培養(yǎng)基,加瓊脂條20 g/L,蒸餾水1 L,pH 7.0;初始固體發(fā)酵培養(yǎng)基:用3倍體積蒸餾水浸泡洗凈的大豆12 h,蒸熟時(shí)間為30 min,后碾碎分裝,蓋上三層紗布,121 ℃滅菌15 min。

    1.2 實(shí)驗(yàn)方法

    (1)培養(yǎng)方法。

    ①種子培養(yǎng)。從斜面取一環(huán)菌種接于種子培養(yǎng)基中,37 ℃,200 r/min,震蕩培養(yǎng)16 h,菌濃約為3×107個(gè)/mL(OD600 nm=6)。

    ②固體惰性基質(zhì)選擇。首先研究惰性載體對(duì)γ-PGA顏色的影響。30 g大豆浸泡、蒸煮后碾磨,分別與3 g稻殼和10 g分子篩(無(wú)固體介質(zhì)為對(duì)照)混勻滅菌,接種量3 mL(10%)菌液,于37 ℃培養(yǎng)36 h,放置4℃冰箱后熟36 h。其次是惰性載體的選擇。以完全碾碎的大豆為營(yíng)養(yǎng)基質(zhì),按質(zhì)量比1∶1添加不同類型的惰性載體(稻殼、分子篩、泡沫、硅膠珠和珍珠巖),在初始pH 7.0,接種量5%,37 ℃的條件下培養(yǎng)36 h,放置4 ℃冰箱后熟36 h。

    ③發(fā)酵液的預(yù)處理。用兩倍體積的生理鹽水溶解固體發(fā)酵基質(zhì),溶液200 r/min震蕩1 h,用4層紗布過(guò)濾,獲得浸提液;再將濾渣以同樣方式處理,獲得二次浸提液。將浸提液混合后10 000 r/min離心15 min,取上清液,放置于4 ℃冰箱備用。用4倍體積的蒸餾水稀釋上清液,充分混勻后,10 000 r/min離心15 min,取上清液;用3倍體積的冰乙醇與上清液充分混勻,4 ℃冰箱中靜置12 h后,10 000 r/min離心15 min,取沉淀,60 ℃烘干至恒重。

    (2)γ-PGA的提取。

    ①丙酮沉降。用0.1 g γ-PGA粗品配制質(zhì)量濃度為2 mg/mL的溶液。分別向其中加入1~5倍體積的丙酮,充分混勻后,4 ℃冰箱靜置12 h,10 000 r/min離心10 min,取沉淀,60 ℃烘干至恒重,測(cè)量其提取率與純度。

    ②電驅(qū)透析。由于微生物發(fā)酵產(chǎn)生的γ-PGA分子量一般在100~1 000 kD之間[14],故選用截留分子量在8~12 kD的透析袋透析丙酮沉降后的γ-PGA樣品,以去除色素與小分子蛋白。由于γ-PGA和蛋白所帶電性的差異,在透析袋的兩端加上100 伏特的電壓,透析時(shí)間分別為0~30 h,取透析液測(cè)量其純度。

    ③苯酚處理。用0.1 g透析處理的γ-PGA樣品配制2 mg/mL溶液。量取10 mL溶液,依次添加10 mL苯酚、10 mL氯仿和1 mL異戊醇,混勻后于30 ℃、120 r/min 震蕩30 min,靜置分層后,取上清,加入3倍體積乙醇沉降12 h,10 000 r/min離心10 min,取沉淀,60 ℃烘干至恒重,測(cè)量其純度。

    (3)測(cè)定方法。

    ①紫外-可見(jiàn)光譜分析。將不同處理的樣品配制200 pg/mL后,應(yīng)用北京普析TU-1810PC紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)進(jìn)行紫外掃描。

    ②茚三酮比色法[15]測(cè)定γ-PGA純度。高溫完全水解γ-PGA為谷氨酸后,測(cè)定顯色液在570 nm的OD值,計(jì)算水解后谷氨酸的含量,進(jìn)一步檢測(cè)γ-PGA的純度。谷氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線為:

    Y=0.001X+0.047(R2=0.996)。

    γ-PGA純度計(jì)算如下所示:

    式中,G為通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算的谷氨酸含量(ug);W為樣品水解前的質(zhì)量(ug)。

    ③HPLC含量測(cè)定。用0.05 M Na2HPO4溶液配制同濃度的樣品,經(jīng)0.45 um膜過(guò)濾,應(yīng)用TOSOH TSK-GEL G6000PWXL色譜柱(日本島津LC-2030高效液相色譜儀),流動(dòng)相為磷酸氫二鈉-磷酸二氫鉀緩沖液(pH 7.0),流速為0.5 mL/min,在216 nm檢測(cè)樣品。

    ④紙層析法[15]測(cè)定γ-PGA的單體組成。將0.2 g γ-PGA樣品用10 mL 6 mo1/L的鹽酸110 ℃,水解17 h。調(diào)溶液pH至7.0,定容至100 mL,過(guò)濾后垂直點(diǎn)樣3次。平衡反應(yīng)空間15 min后,在展層劑(正丁醇∶80%甲酸∶水=15∶3∶20)中層析,烘干后用0.1%茚三酮-丙酮溶液顯色。

    ⑤SDS-PAGE電泳[16]測(cè)定γ-PGA的分子量。配制6%的分離膠與5%的濃縮膠,點(diǎn)樣后用80 V低壓進(jìn)行濃縮,至分離膠左右調(diào)至100 V電泳。將凝膠浸入考馬斯亮藍(lán)染色液染色0.5 h,脫色后用阿利新藍(lán)染8-GX染液復(fù)染,脫色至條帶清晰。

    2 結(jié)果與討論

    2.1 惰性基質(zhì)的篩選

    以稻殼和分子篩為固體基質(zhì)(大豆為對(duì)照)時(shí),γ-PGA粗品的顏色變化顯著,具體如圖1所示。由圖1可知,根據(jù)固體基質(zhì)類型的不同,γ-PGA粗品的顏色深淺變化:稻殼>大豆>分子篩。這可能由于蒸煮過(guò)程中大豆和稻殼中的色素和可溶物溶出,導(dǎo)致發(fā)酵產(chǎn)品顏色變深,增加產(chǎn)物分離純化的難度。分子篩作為固體支持基質(zhì)時(shí),γ-PGA粗品的顏色最淺,表明惰性載體一定程度上降低了發(fā)酵組分的復(fù)雜性,有利于后續(xù)產(chǎn)品的純化。進(jìn)一步研究不同惰性載體對(duì)γ-PGA產(chǎn)量的影響,結(jié)果如圖2所示。由圖2可知,固體支持物都能顯著增加γ-PGA產(chǎn)量,其中珍珠巖對(duì)γ-PGA產(chǎn)量提升影響最大,達(dá)到了60g/Kgds(Dry Substance, DS),是對(duì)照的兩倍。這是由于固體支持物增加了菌體的表面積,有利于傳質(zhì)擴(kuò)散,增加通氣量,促進(jìn)微生物的增殖與代謝。但是,過(guò)大或過(guò)小尺寸的固體基質(zhì)都不利于微生物發(fā)酵。珍珠巖可能因?yàn)榱竭m中,既利于菌體分散,又不阻礙物質(zhì)傳輸,進(jìn)而促進(jìn)了γ-PGA的生產(chǎn)。更重要的是,珍珠巖在提升γ-PGA產(chǎn)量的同時(shí),γ-PGA粗品的顏色也較淺(見(jiàn)圖5a),其純度達(dá)到了72.62%,有效降低了γ-PGA分離純化的成本。

    圖1 惰性基質(zhì)對(duì)γ-PGA粗品顏色的影響

    圖2 不同惰性支持介質(zhì)對(duì)γ-PGA產(chǎn)量的影響

    2.2 γ-PGA的分離純化

    (1)丙酮處理。分析丙酮用量對(duì)γ-PGA的提取效率的影響。丙酮和透析對(duì)γ-PGA分離純化的影響如圖3所示。由圖3a可知,γ-PGA的提取率隨著丙酮添加量的增加而增加,當(dāng)丙酮添加量為3倍體積(150 mL)時(shí),γ-PGA提取率達(dá)到70.2%;繼續(xù)增加丙酮用量,提取率增加不顯著。為了減少有機(jī)溶劑使用量,丙酮使用比例確定為3倍體積。經(jīng)過(guò)丙酮處理后,γ-PGA樣品色澤變淺(見(jiàn)圖5b)。不同處理的γ-PGA樣品的紫外光譜圖如圖4所示。由圖4可知,γ-PGA在210 nm處的特征吸收峰的峰面積比處理前的增大了。同時(shí),260~280 nm區(qū)間內(nèi)雜蛋白的吸收峰的峰面積變小,表明丙酮處理后的γ-PGA純度有所提升,純度測(cè)定顯示丙酮處理后的γ-PGA樣品純度增加至80.2%,純度提升10.4%。由于色素和蛋白易溶于丙酮,丙酮脫色效果較明顯。且γ-PGA不溶于丙酮,故丙酮可以達(dá)到純化γ-PGA的效果[17]。

    (2)透析。透析不僅可以除去粗品中的小分子色素及雜質(zhì),還可以除去上一步丙酮純化后殘留的丙酮。由圖3b可知,隨著透析時(shí)間的增加,γ-PGA樣品純度逐漸增加,透析18 h后,樣品顏色進(jìn)一步變白(見(jiàn)圖5c),樣品純度達(dá)到83.6%。表明透析過(guò)程中,小分子色素及蛋白不斷滲出。由圖4可以看出,經(jīng)過(guò)透析處理后,γ-PGA透析樣品的最大特征峰值及其峰面積都高于未處理對(duì)照。但是,雜蛋白所形成的吸收峰的峰面積也變大,可能是γ-PGA樣品中隨著小分子色澤及雜質(zhì)的去除,導(dǎo)致截留下來(lái)的大分子蛋白濃度的相對(duì)提升。

    圖3 丙酮和透析對(duì)γ-PGA分離純化的影響

    (3)苯酚處理。因蛋白具有苯環(huán)結(jié)構(gòu),故應(yīng)用苯酚去除透析所截留下來(lái)的大分子蛋白雜質(zhì)。由圖4可知,經(jīng)過(guò)苯酚處理后,γ-PGA的特征吸收峰值及其面積進(jìn)一步增大,非常接近γ-PGA標(biāo)品的峰形;同時(shí),260~280 nm處的雜蛋白吸收峰進(jìn)一步降低,表明苯酚處理進(jìn)一步提升了γ-PGA的純度。純度測(cè)定顯示γ-PGA樣品的純度升高至89.12%,樣品呈白色粉末狀(見(jiàn)圖5d)。由于γ-PGA是谷氨酸高聚物,其結(jié)構(gòu)與蛋白質(zhì)存在基團(tuán)差異。故基于DNA提取過(guò)程中[18]利用苯酚與蛋白分子相似相溶的原理,實(shí)現(xiàn)除去大分子雜蛋白的目的。此外,應(yīng)用氯仿除去水相中的殘留少量酚,加速有機(jī)相與水相分層,有利于γ-PGA的分離。

    圖4 不同處理的γ-PGA樣品的紫外光譜圖

    圖5 不同處理后γ-PGA樣品的色澤變化

    2.3 γ-PGA樣品的鑒定

    SDS-PAGE電泳分析發(fā)現(xiàn)γ-PGA粗品的條帶較寬且有拖尾與前泳現(xiàn)象,表明粗品含有一定雜質(zhì),且分子量不是很均一(見(jiàn)圖6);但是,其核心位置與純化后樣品的條帶位置一致,說(shuō)明粗品的純度相對(duì)較高,表明以惰性固體基質(zhì)發(fā)酵的γ-PGA粗品的雜質(zhì)含量較低。純化后的γ-PGA樣品條帶位置與γ-PGA的標(biāo)品和商用品的基本一致,且樣品帶寬更窄,表明基于固體惰性基質(zhì)發(fā)酵生產(chǎn)的γ-PGA的分子量約為700kD,且分子量比較均一,說(shuō)明分離純化的效率高。進(jìn)一步應(yīng)用紙層析分析γ-PGA的水解液,不同γ-PGA樣品及其水解液的紙層析結(jié)果如圖7所示。由圖7可知,γ-PGA樣品的水解液與γ-PGA標(biāo)品的水解液和谷氨酸標(biāo)品溶液的展層形貌完全一致,說(shuō)明樣品水解液中只含有谷氨酸,表明其純度較高。進(jìn)一步比較發(fā)現(xiàn),γ-PGA標(biāo)準(zhǔn)品、γ-PGA樣品未出現(xiàn)層析斑點(diǎn),而γ-PGA粗品呈現(xiàn)放射狀層析斑點(diǎn),一方面說(shuō)明γ-PGA粗品中含有雜蛋白和其他氨基酸,需要進(jìn)一步純化;另一方面說(shuō)明γ-PGA粗品經(jīng)純化后不含其他雜質(zhì),表明分離純化效率較高。

    圖6 不同γ-PGA樣品的SDS-PAGE圖7 不同γ-PGA樣品及其水解液的紙層析

    應(yīng)用HPLC分析純化后的γ-PGA樣品與γ-PGA標(biāo)準(zhǔn)品,分析結(jié)果如圖8所示。由圖8可知,兩者的HPLC圖譜非常接近(Rt均為8 min),且與Zeng[19]報(bào)道一致,表明純化后的γ-PGA樣品質(zhì)量很接近γ-PGA標(biāo)準(zhǔn)品。

    圖8 γ-PGA樣品與標(biāo)品的HPLC圖譜

    3 結(jié)論

    綜上,基于惰性基質(zhì)固體發(fā)酵生產(chǎn)的γ-PGA不僅產(chǎn)量提升了兩倍,而且雜質(zhì)含量少,便于后續(xù)分離純化。這為統(tǒng)籌考慮γ-PGA生產(chǎn)與分離純化,提出綜合γ-PGA制備的策略提供了契機(jī)。進(jìn)一步地,組合多種分離純化方法,將γ-PGA粗品的純度提升至89.12%,其分子量均一,樣品質(zhì)量接近γ-PGA標(biāo)品。表明上述制備策略不僅效率高,而且節(jié)省了發(fā)酵液預(yù)處理的時(shí)間和有機(jī)溶劑的使用量,為γ-PGA分離純化方面的研究提供有益參考。

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