響應(yīng)面法優(yōu)化蘋果渣中果膠的檸檬酸提取工藝

傅錫鵬，朱秀靈，戴清源，潘 超，董 勇，盛伊健，賈坤鵬，陳廷然

(安徽工程大學(xué) 生物與化學(xué)工程學(xué)院，安徽 蕪湖 241000)

果膠是植物細(xì)胞壁多糖家族中結(jié)構(gòu)最為復(fù)雜的一種成分，屬于水溶性膳食纖維，不會被小腸消化酶如α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶降解[1]，具有優(yōu)良的膠凝性和乳化性[2]以及降血糖[3]、增強免疫力[4]、抗菌[5]、保護胃腸道[6]等多種特性和生理功能。由于這些功能特性，果膠已經(jīng)成為食品和醫(yī)藥行業(yè)中最受歡迎的原料之一。商品果膠的來源主要是蘋果渣及柑橘皮[2,7]。蘋果渣是蘋果汁加工的主要副產(chǎn)物，蘋果渣水分含量高(約80%)并且富含碳水合化物、有機酸、維生素和礦物質(zhì)，尤其是富含果膠類物質(zhì)[8]。如果不進行處理，大量蘋果渣堆積不僅占用土地，而且由于其富營養(yǎng)化及產(chǎn)生異味，將會嚴(yán)重污染環(huán)境。從蘋果渣中提取果膠是增加經(jīng)濟效益和減少環(huán)境污染的一種有效途徑。

果膠提取方法主要有水提[9-10]、酸提[11-12]、堿提[13-14]、酶法[15]及超聲波或微波輔助提取法[16-18]，其中最常用的方法為酸提法，它是利用稀酸將植物細(xì)胞壁中非水溶性果膠轉(zhuǎn)化為水溶性果膠[19-20]。常用的酸主要為硫酸、鹽酸、硝酸[12,21]，其他還包括酒石酸[1]、蘋果酸[1,21]以及檸檬酸[22]等。與鹽酸及硝酸相比，檸檬酸對果膠的提取效率和產(chǎn)量較高[23]，硫酸可以很好地將原果膠轉(zhuǎn)化為可溶性果膠，但水解后硫酸根離子的去除非常困難[20]，硝酸提取的果膠得率不穩(wěn)定[21]。酶法提取果膠，條件溫和，可避免強酸的腐蝕及污染問題，但是酶法提取果膠價格昂貴[1]；考慮到經(jīng)濟成本，目前工業(yè)上多以價格較低的無機酸如鹽酸作為果膠的提取溶劑。酸法提取果膠，提取液的pH值是關(guān)鍵因素，當(dāng)提取液的pH值相同時，果膠提取得率和酸的種類沒有關(guān)系，降低提取液的pH值可以使更多的水不溶性果膠轉(zhuǎn)化為可溶性果膠從而提高果膠的提取率，但是較低pH值的強酸(如鹽酸和硝酸)，不僅會腐蝕設(shè)備及造成水體污染，而且容易導(dǎo)致果膠水解從而降低果膠的得率[20]。與無機酸相比，有機酸的解離常數(shù)較低，其水解能力也比無機酸低，如果采用有機酸提取果膠可能不會引起質(zhì)子催化的果膠解聚[24]。食品級有機酸如檸檬酸和蘋果酸，已被美國食品藥品監(jiān)督管理局(FDA)批準(zhǔn)為不受任何限制的安全材料，主要用作抑制微生物生長的食品防腐劑[1]。與酒石酸、蘋果酸等有機酸相比，檸檬酸價格較低，并且對環(huán)境友好，以檸檬酸為溶劑提取果膠已引起了眾多研究者的關(guān)注[16,22,24-25]。

響應(yīng)面法是一種應(yīng)用較為廣泛的試驗優(yōu)化方法，采用較為合理的試驗設(shè)計對實驗進行全面研究，可以有效地確定多因素試驗的最佳條件[26]。然而，利用響應(yīng)面法優(yōu)化檸檬酸提取果膠技術(shù)是否能夠有效地提高蘋果渣中果膠的提取率鮮見報道。研究首先以蘋果渣為原料，以食品級檸檬酸為提取溶劑，以果膠得率為指標(biāo)，在單因素試驗的基礎(chǔ)上，利用響應(yīng)面法優(yōu)化果膠提取工藝，確定其最佳提取條件；其次以乳化性和乳化穩(wěn)定性為考察指標(biāo)，評價其乳化特性，旨在為蘋果渣中果膠的環(huán)保制備及性能研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

蘋果(蕪湖市水果銷售店提供，主要為畸形、碰損且無霉?fàn)€的果實)；食品級檸檬酸(蕪湖市瑞德食品添加劑經(jīng)營部)；無水乙醇、氫氧化鈉(分析純，國藥集團試劑有限公司)；咔唑(化學(xué)純，國藥集團試劑有限公司)；標(biāo)準(zhǔn)品D-半乳糖醛酸、酚酞指示劑(上海瑞永生物科技有限公司)。

1.2 儀器與設(shè)備

QS-100萬能粉碎機(鶴壁市恒鑫儀器儀表有限公司)；JY1002電子天平(上海良平儀表有限公司)；HH-6恒溫水浴鍋(金壇式杰瑞爾電器有限公司)；L-550臺式低速大容量離心機(湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司)；ZFD-A5140鼓風(fēng)干燥箱(上海智城分析儀器制造公司)；RE-85Z旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海青浦滬西儀器廠)；L3S紫外可見分光光度計(上海儀電分析儀器有限公司)。

1.3 實驗方法

(1)原料處理。將外觀畸形或者破損的蘋果切成約3 cm小塊，用打漿機打碎，兩層紗布擠壓去汁，將果渣置于干燥箱中70 ℃干燥至恒重，粉碎、過60目篩。然后按料液比1∶20(g/mL)加入70%(v/v)乙醇，室溫攪拌1 h，離心(4 500 r/min，10 min)，棄上清，沉淀部分按料液比1∶20(g/mL)加入無水乙醇,按相同方法洗滌1次。最后將沉淀物于70 ℃干燥至恒重，冷卻至室溫，即得到蘋果渣，自封袋分裝，4 ℃冰箱存放。

(2)果膠提取單因素試驗。準(zhǔn)確稱取蘋果渣若干份，每份2 g，采用30 g/100 mL檸檬酸溶液將蒸餾水調(diào)至不同的pH值，即為不同pH值的檸檬酸溶液，以不同pH值的檸檬酸溶液為提取劑，分別考察料液比、提取溫度、提取時間及pH值4個因素對蘋果渣果膠得率的影響。具體方法如下：

②提取溫度。稱取4份各2 g蘋果渣，按照料液比1∶25(g/mL)分別加入pH 2.0的檸檬酸溶液，分別置于70 ℃、80 ℃、90 ℃、100 ℃的恒溫水浴浸提90 min。后續(xù)操作同①料液比。

③提取時間。稱取4份各2 g蘋果渣，按照料液比1∶25(g/mL)分別加入pH 2.0的檸檬酸溶液，于90 ℃水浴浸提60 min、90 min、120 min、150 min。后續(xù)操作同①料液比。

④pH。稱取4份各2 g蘋果渣，按照料液比1∶25(g/mL)分別加入pH 1.0、2.0、3.0、4.0的檸檬酸溶液，于90 ℃水浴浸提90 min。后續(xù)操作同①料液比。

上述各濃縮液，分別加入3倍體積無水乙醇，攪拌5 min，室溫靜置過夜，使果膠沉淀析出，離心(4 500 r/min，10 min)，收集沉淀，分別用70%(v/v)乙醇、無水乙醇依次洗滌，每次洗滌時均攪拌20 min，將洗滌后的沉淀熱風(fēng)干燥(60 ℃，2 h)，粉碎即得果膠。

(3)響應(yīng)面法優(yōu)化蘋果渣果膠提取工藝。在單因素試驗基礎(chǔ)上，選擇提取溫度、提取時間和pH值為影響因素，各設(shè)置3個水平(見表1)，料液比為1∶25(g/mL)，運用Deign Expert 8.0.6軟件中的Box-Behnken設(shè)計試驗方案(見表2)，共17個實驗，包括5個中心點，以果膠得率為響應(yīng)值，作響應(yīng)面與等高線圖，優(yōu)化最佳提取工藝條件。

表1 因素水平表

(4)果膠得率的計算。果膠得率[11]以每克蘋果渣提取的果膠的質(zhì)量百分比表示，如式(1)所示：

(1)

式中，M為蘋果渣質(zhì)量(以干基計，g)；m為提取的果膠的質(zhì)量(以干基計，g)。

(5)半乳糖醛酸含量的測定。半乳糖醛酸含量采用氨基磺酸鹽/間羥基二苯基法測定[27]，簡述如下：稱取20 mg果膠樣品，采用蒸餾水溶解并定容至100 mL；量取該溶液400 μL與40 μL 4 M氨基磺酸溶液充分混合，再加入含有75 mM四硼酸鈉的濃硫酸2.4 mL，混勻，100 ℃水浴水解20 min，冰浴冷卻；再加入80 μL 0.15%(w/v)間羥基二苯溶液(由0.05%(w/v)NaOH溶液配制而成)，混勻，于525 nm測定吸光度，以不含間羥基二苯的NaOH溶液作為空白。以標(biāo)準(zhǔn)品D-半乳糖醛酸溶液(0～100 μg/mL)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。則樣品中半乳糖醛酸含量按式(2)計算：

(2)

式中，C為從標(biāo)準(zhǔn)曲線中查得的半乳糖醛酸質(zhì)量濃度(μg/mL)；V為待測液的體積(mL)；N為稀釋倍數(shù)；Mp為果膠樣品質(zhì)量(g)。

(6)果膠酯化度。果膠的酯化度采用滴定法測定，參照文獻[28]并修改如下：稱取0.2 g果膠，加入100 mL蒸餾水，40 ℃水浴溶解果膠，然后加入2～3滴1%酚酞-乙醇溶液，采用0.1 mol/L NaOH溶液滴定，記錄滴定終點時消耗的NaOH溶液體積(V1)；然后繼續(xù)滴加0.5 moL/L NaOH溶液20 mL，室溫下皂化2.5 h；向皂化后的溶液中加入20 mL 0.5 mol/L HCL溶液，再用0.1 mol/L NaOH溶液進行滴定，記錄消耗的NaOH體積為V2。根據(jù)式(3)計算果膠的酯化度：

(3)

式中，DE為果膠酯化度(%)；V1為初次消耗NaOH溶液的體積(mL)；V2為皂化后的溶液消耗NaOH溶液的體積(mL)。

(7)乳化性和乳化穩(wěn)定性。果膠的乳化性和乳化穩(wěn)定性測定參照文獻[29]，方法簡述如下：將3 mL 0.5%(w/w)果膠樣品與3 mL植物油用渦旋混合器以最大速度混合3 min，離心(10 000 r/min，5 min)，分別記錄溶液總體積(VT)和乳化層體積(VE)，則果膠的乳化性(EA，%)由式(4)計算得出:

(4)

采用相同的方法制備乳液，分成等量若干份，取一份乳液，離心(10 000 r/min，5 min)并分別記錄初始乳化層體積(VEi)，剩余的乳液均在23 ℃存放30 d，分別于第1 d和第30 d取樣、離心(10 000 r/min，5 min)、記錄乳化層體積(VEr)。則乳化穩(wěn)定性(ES，%)可由式(5)計算得出:

(5)

1.4 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 蘋果渣中果膠提取單因素試驗

(1)料液比對果膠得率的影響。料液比對檸檬酸提取蘋果渣果膠得率的影響如圖1所示。由圖1可以看出，隨著料液比的增加，果膠得率呈上升趨勢，當(dāng)料液比為1∶25 g/mL時，果膠得率最大為12.5±0.87(%)，再增大料液比，果膠得率幾乎不變。

(2)提取溫度對果膠得率的影響。提取溫度對檸檬酸提取蘋果渣果膠得率的影響如圖2所示。由圖2可知，當(dāng)提取溫度低于90 ℃時，隨著溫度的升高，果膠得率顯著增加，在90 ℃時果膠得率為13.13±0.50(%)；當(dāng)溫度高于90 ℃時，果膠得率增加不顯著。果膠作為一種高分子有機物，萃取溫度過高會導(dǎo)致果膠本身結(jié)構(gòu)的破壞；萃取溫度過低，水解速度又會太慢，故選擇合適的提取溫度為90 ℃。

圖1 料液比對檸檬酸提取蘋果渣果膠得率的影響 圖2 提取溫度對檸檬酸提取蘋果渣果膠得率的影響

(3)提取時間對果膠得率的影響。提取時間對果膠得率的影響如圖3所示，在其他條件固定不變的情況下，隨著提取時間的延長，果膠得率逐漸增大，至提取時間120 min時果膠得率最大為(13.27±0.40)%；當(dāng)提取時間超過120 min，再進一步延長提取時間，果膠得率反而下降，其原因可能是熱酸溶液長時間作用，導(dǎo)致果膠物質(zhì)分子部分降解，故而果膠得率下降。由圖3還可以看出，提取時間在90 min和120 min時，果膠得率差異不顯著，因此，選擇90 min為合適的提取時間。

(4)pH對果膠得率的影響。pH對檸檬酸提取蘋果渣果膠得率的影響如圖4所示。由圖4可以看出，pH 1.0～2.0范圍內(nèi)，隨著pH值的升高，果膠得率逐漸增大，pH 2.0時果膠得率最大為(13.17±0.61)%；當(dāng)pH值大于2.0時，隨著pH值增大果膠得率反而下降。可能是隨著pH值的升高，溶劑中酸含量不斷減少，蘋果渣中原果膠與細(xì)胞內(nèi)纖維素等結(jié)構(gòu)的連接不易被破壞，果膠物質(zhì)無法有效溶解，果膠得率降低。所以，選擇pH 2.0為合適的pH值。

圖3 提取時間對檸檬酸提取蘋果渣果膠得率的影響 圖4 pH對檸檬酸提取蘋果渣果膠得率的影響

2.2 響應(yīng)面法優(yōu)化果膠提取工藝

在單因素試驗基礎(chǔ)上，采用Box-Behnken設(shè)計方案進一步優(yōu)化果膠提取條件，結(jié)果如表2所示。在設(shè)計實驗條件下，果膠得率范圍為8.25%～14.05%，其最高值出現(xiàn)在中心點實驗條件下，即提取溫度為90 ℃，提取時間為90 min，pH值為2.0。不同的實驗組合，果膠得率之間存在明顯的差異。運用Design-Expert 8.0.6軟件對表2數(shù)據(jù)進行多元回歸分析，得到果膠得率的預(yù)測值(Y)與提取溫度(X1)、提取時間(X2)、pH(X3)之間的二次多元回歸方程：

式中，X1、X2、X3分別是被測變量提取溫度、提取時間及pH的編碼值。

表2 響應(yīng)面試驗設(shè)計方案及結(jié)果

表3 回歸模型方差分析及顯著性檢驗

注：*差異顯著(0.01

為了更直觀地觀察和了解自變量和響應(yīng)值之間關(guān)系以及自變量間的交互作用，運用Deign Expert 8.0.6軟件對實驗結(jié)果繪制響應(yīng)面圖如圖5所示，并優(yōu)化最佳提取工藝條件。

提取溫度和提取時間交互作用對果膠得率的影響如圖5a所示響應(yīng)曲面及等高線均呈圓形，說明提取溫度和提取時間交互作用對結(jié)果影響不顯著。響應(yīng)曲面及等高線均呈橢圓型如圖5b所示，說明提取溫度和pH交互作用對果膠得率影響顯著。響應(yīng)曲面及等高線介于橢圓和圓之間如圖5c所示，說明提取時間和pH交互作用對果膠得率有一定的影響。由圖5可知，響應(yīng)面圖和等高線圖反應(yīng)了自變量之間的交互作用，這與表3方差分析及顯著性檢驗的結(jié)果一致。

圖5 各因素交互作用影響果膠得率的響應(yīng)面圖

此外，運用Design Expert 8.0.6軟件對實驗數(shù)據(jù)進行處理，在各因素水平設(shè)定范圍內(nèi)，得出被測變量的最優(yōu)值，即提取溫度94.78 ℃、提取時間94.61 min、pH 1.5，在此最優(yōu)工藝條件下，果膠得率的預(yù)測值為14.72%。為了便于實際操作，將最優(yōu)提取工藝參數(shù)修訂為提取溫度95 ℃、提取時間95 min、pH 1.5。

為了驗證回歸模型的可靠性，對修訂的提取工藝即提取溫度95 ℃、提取時間95 min、pH 1.5，以及實驗設(shè)計中果膠得率最大的實驗組即提取溫度90 ℃、提取時間90 min、pH 2.0，分別進行3次重復(fù)實驗，結(jié)果以平均值±SD表示。結(jié)果表明，前者果膠得率為14.45±0.20(%)，后者為14.10±0.11(%)，前者中果膠得率明顯高于后者。由此得出，前者即提取溫度95 ℃、提取時間95 min、pH 1.5為果膠的最佳提取工藝。

通過單因素及響應(yīng)面優(yōu)化實驗，可以得到檸檬酸提取蘋果渣果膠的最優(yōu)工藝為提取溫度95 ℃、提取時間95 min、pH 1.5、料液比1∶25(g/mL)、提取2次，在此條件下，果膠得率為14.45±0.20(%)，與理論預(yù)測值的相對誤差為-1.83%，說明用響應(yīng)面法對蘋果渣中果膠的提取進行工藝優(yōu)化具有實際可操作性。研究采用檸檬酸提取果膠，其得率明顯低于內(nèi)切木聚糖酶和內(nèi)切纖維素酶輔助提取法(19.8%)[15]，但卻顯著高于超聲波輔助提取法(9.183%)[27]。

2.3 蘋果果膠的性質(zhì)分析

(1)果膠的半乳糖醛酸含量和酯化度。在最佳工藝條件下提取的果膠，其半乳糖醛酸含量及酯化度如圖6所示。由圖6可知，半乳糖醛酸含量為73.31±5.14(%)，與文獻[11]報道基本一致。果膠的酯化度是其在工業(yè)中應(yīng)用的重要參數(shù)，它與果膠的溶解度、乳化能力和多糖形成凝膠的能力等技術(shù)特征有關(guān)[27]。研究中提取的果膠酯化度為68.03±7.11(%)，說明提取的果膠為高甲氧基果膠。

圖6 果膠半乳糖醛酸含量及其酯化度

(2)乳化性和乳化穩(wěn)定性。果膠的乳化性受到多種因素的影響，如會降低表面張力的較低的分子量，提取條件如溫度和時間、較高的酯化度、果膠中蛋白質(zhì)及酚類物質(zhì)的親水疏水性等[29]。研究中所提取的果膠乳化性為38.51±6.13(%)，與文獻[29]報道一致。

乳化穩(wěn)定性是由于水合層對聚集體的空間排斥效應(yīng)。果膠分子通過在顆粒周圍形成乳液層來穩(wěn)定界面處的乳液。乳液的穩(wěn)定能力取決于帶電分子(果膠)與蛋白質(zhì)之間的聯(lián)系以及果膠的低分子量[29]。研究提取的果膠，其乳化穩(wěn)定性在23 ℃第1 d為83.55±3.07(%)，第30 d為80.91±6.52(%)，說明檸檬酸提取的蘋果果膠具有較好的乳化穩(wěn)定性。

3 結(jié)論

研究從農(nóng)產(chǎn)品加工副產(chǎn)物的開發(fā)利用及果膠的環(huán)保制備的角度，通過單因素試驗與響應(yīng)面設(shè)計試驗，對檸檬酸提取蘋果渣中果膠的工藝條件進行優(yōu)化，其最佳提取工藝條件為提取溫度95 ℃、提取時間95 min、pH 1.5、料液比1∶25(g/mL)、提取2次，在此條件下果膠平均得率為14.45±0.20(%)，與理論預(yù)測值的相對誤差為-1.83%。由此可知，采用響應(yīng)面法優(yōu)化檸檬酸提取蘋果渣中果膠，果膠得率較高，提取工藝參數(shù)可靠，具有實際可操作性。試驗中采用食品級檸檬酸溶液為提取溶劑，具有環(huán)保、安全等特點[30]。在最佳提取條件下所得的果膠的半乳糖醛酸含量為73.31±5.14(%)，說明果膠純度較高，酯化度為68.03±7.11(%)，說明該果膠屬于高酯果膠；其乳化性為38.51±6.13(%)，乳化穩(wěn)定性在30 d內(nèi)保持在80%以上，表明該果膠具有良好的乳化性和乳化穩(wěn)定性。

試驗中發(fā)現(xiàn)不同批次、不同來源的蘋果渣原料，果膠得率可能有較大差異，說明果膠含量高低與原料品種、原料來源密切相關(guān)。研究僅是對檸檬酸最佳提取條件下得到的蘋果渣果膠的乳化特性做了初步探討，在后期的研究中，還可深入探討不同果膠質(zhì)量濃度、油相體積分?jǐn)?shù)及pH值對蘋果果膠乳化特性的影響規(guī)律。研究未對提取出的果膠進行分離純化、主要結(jié)構(gòu)組成、流變與凝膠特性及其在食品中的應(yīng)用進行研究，后續(xù)試驗中將對其進行探究。