外源抗生素對栽培作物與野生植物的氧化脅迫及其富集轉(zhuǎn)運的差異性

武 劍,Debela Sisay-Abebe,華倩雯,陳欣瑤,張 園

(蘇州科技大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院,江蘇 蘇州 215009)

抗生素在畜禽養(yǎng)殖業(yè)中通常作為添加劑用于提高動物產(chǎn)品產(chǎn)量,但因其過度使用以及難以被動物完全吸收,導(dǎo)致其不斷排放并累積在外部環(huán)境中[1],并已成為頗受關(guān)注的污染物類型[2]. 施用畜禽糞便是耕地土壤中抗生素污染的主要外來源之一[3],據(jù)報道,糞便中的抗生素典型濃度范圍在1 mg/kg～10 mg/kg[4-5],其中豬糞檢測到最高量可達134.2 mg/kg[6]. 在長期施用畜禽糞便的土壤中,各類抗生素同樣有著不同的檢出,其中以四環(huán)素類、磺胺類和喹諾酮類抗生素的檢出率最高[7-8].

外源抗生素從土壤中轉(zhuǎn)移至植物體內(nèi)及其毒理效應(yīng)的研究屢見不鮮,目前已在多種植物中發(fā)現(xiàn)了抗生素,如胡蘿卜、生菜、玉米等[9-11]. Riaz等[12]研究表明高濃度抗生素通過引起氧化應(yīng)激而抑制小麥生長,遲蓀琳等[13]研究發(fā)現(xiàn)四環(huán)素類抗生素濃度超過50 mg/kg就會對蔬菜產(chǎn)生氧化脅迫. 長期生長在污染環(huán)境中的野生植物與初次引入到該環(huán)境中的栽培作物對污染物的響應(yīng)存在一定的差異性,有研究表明野生植物對逆境的脅迫作用更為敏感[14],但關(guān)于野生植物與栽培作物對外源抗生素的氧化脅迫效應(yīng)及富集轉(zhuǎn)運差異性卻少有報道. 在生產(chǎn)活動中,青菜、生菜、玉米和稗草、馬唐、狗尾草分別作為重要經(jīng)濟作物和優(yōu)良牧草,其轉(zhuǎn)運污染物的能力也會對人類和動物健康構(gòu)成威脅.

因此,本研究以養(yǎng)豬場內(nèi)抗生素污染土壤為研究對象,選用養(yǎng)豬場內(nèi)的3種優(yōu)勢野生植物(稗草、馬唐、狗尾草)和3種栽培作物(青菜、生菜、玉米)作為試驗作物,研究豬糞引入的外源抗生素對野生植物和栽培作物抗氧化酶活性的影響及抗生素在植物體內(nèi)的富集和轉(zhuǎn)運特征,比較兩者對外源抗生素的氧化脅迫和富集轉(zhuǎn)運能力的差異性. 以期為抗生素污染土壤中的植物生態(tài)風(fēng)險評價累積資料,特別是集約化養(yǎng)殖場搬遷后的遺留地塊和長期施用糞便的土壤進行安全生產(chǎn)活動,以及短期培養(yǎng)在該環(huán)境下作物的生態(tài)安全性都有著一定的參考價值.

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試野生植物為禾本科的稗草、馬唐及狗尾草,種子采自于蘇州某養(yǎng)豬場內(nèi),為養(yǎng)豬場內(nèi)優(yōu)勢種群植物;供試栽培作物為十字花科的青菜、菊科的生菜及禾本科的玉米,種子購于種子市場. 供試抗生素污染土壤采自蘇州某養(yǎng)豬場內(nèi)長期接受豬糞施用的土壤,供試無抗生素污染土壤采自蘇州市東山鎮(zhèn)未施過有機肥的農(nóng)田土耕層土壤(0 cm～20 cm),其基本理化性質(zhì)見表1.

本實驗選用的3種四環(huán)素類(TCs)抗生素(四環(huán)素(TC)、土霉素(OTC)和強力霉素(DOX)),3種磺胺類(SAs)抗生素(磺胺嘧啶(SD)、磺胺二甲基嘧啶(SM2)和磺胺甲惡唑(SMX)),以及3種喹諾酮類(QNs)抗生素(恩諾沙星(ENR)、環(huán)丙沙星(CIP)和諾氟沙星(NOR)),其純度均大于99.0%. 甲醇、乙腈、正己烷均為色譜級,其他化學(xué)試劑均為分析純. 固相萃取小柱為Oasis HLB(6 mL,200 mg).

表1 土壤的基本理化性質(zhì)Table 1 Basic physical and chemical properties of soil

注:LOD表示低于儀器檢出限.

1.2 實驗設(shè)計

盆栽實驗于2019年1月20日至2019年3月21日在溫室大棚中進行. 土壤處理分為外源抗生素污染組和無抗生素污染組,分別種植栽培作物(青菜、生菜、玉米)和野生植物(稗草、馬唐、狗尾),每個處理 3個重復(fù),同時放置3盆不種任何植物的抗生素污染土壤作為空白對照(盆栽實驗的設(shè)計見圖1). 植物種子在0.02%赤霉酸溶液中浸泡24 h以打破休眠,每個塑料盆中裝入不同處理的2 kg風(fēng)干過篩(3 mm)土壤,將植物種子分別撒在不同的塑料盆中,調(diào)節(jié)含水率至田間持水量的70%左右,正常光照條件下,溫度控制在(25±1)℃. 植株于60 d后收獲,收獲后的植物分為地下部分(根)和地上部分(葉),用去離子水洗掉上面殘留的土壤顆粒,一部分凍干測定抗生素含量,一部分立即測定生理指標(biāo);土壤樣品采集于植物根部抖落下來的根際土壤,凍干后用于測定抗生素含量.

1.3 測定項目與方法

1.3.1 植物抗氧化酶活性和丙二醛含量

測定方法參考前人的研究[15]:超氧化物歧化酶(SOD)采用氮藍四唑(NBT)法,SOD活性單位以抑制NBT光化還原50%所需酶量為1個酶活單位;過氧化物酶(POD)采用愈創(chuàng)木酚法,以每分鐘OD值升高1.0為1個酶活性單位;過氧化氫酶(CAT)采用紫外分光光度法,以每分鐘OD值減少0.01為1個酶活性單位;丙二醛(MDA)采用硫代巴比妥酸法(TBA).

1.3.2 土壤和植物中抗生素的測定

樣品的前處理采用固相萃取法(SPE),處理過程主要參考文獻[16-17],有部分改動:準(zhǔn)確稱取凍干的2.0 g土壤和植物樣品(研磨過篩)于50 mL離心管中,加入15 mL萃取劑(0.1 mol/L的Na2EDTA-McllVaine),渦旋混勻后超聲15 min,之后5 000 rpm離心15 min,將上清液轉(zhuǎn)移至新的50 mL離心管中,重復(fù)3次,合并上清液. 植物樣品提取液加入10 mL正己烷脫脂3次,收集下層液體. 上清液于40 ℃ 水浴下氮吹濃縮至10 mL,過0.45 μm濾膜后加純水稀釋至500 mL準(zhǔn)備進行過柱,用10 mL甲醇、10 mL超純水依次活化固相萃取小柱. 將稀釋后的萃取液以5 mL/min的速度通過萃取小柱,之后用10 mL超純水淋洗小柱,繼續(xù)抽真空10 min以除去柱中殘留水分,最后用10 mL甲醇(含1.0%甲酸)洗脫,收集洗脫液,在氮氣濃縮儀上吹至近干,用甲醇定容至1 mL,過0.22 μm有機系濾膜,待測.

1.3.3 HPLC-MS/MS分析與質(zhì)量控制

采用HPLC-MS/MS(Ultimate 3000 型高效液相色譜儀,TSQ Quantum Ultra EMR三重四極桿質(zhì)譜儀)測定. 色譜條件:色譜柱Waters ACQUITY UPLC BEH C18column(1.7 μm,2.1 mm×100 mm). 流動相A為0.1%甲酸水溶液,流動相B為乙腈;進樣體積5 μL;流速0.3 mL/min;柱溫30 ℃. 測定時采用的流動相梯度如表2.

表2 HPLC測定流動相梯度Table 2 Mobile phase for the gradient of HPLC

質(zhì)譜條件:采用加熱電噴霧正離子源(ESI+),選擇反應(yīng)監(jiān)測模式(SRM). 噴霧器電壓為3.5 kV,噴霧器溫度為250 ℃,鞘氣和輔助氣壓力分別為35 psi和5 psi,離子傳輸毛細管溫度為300 ℃,碰撞氣壓力為0.1 Pa,進樣方式為自動進樣.

3類抗生素的檢測限(LOD)分別為TCs:0.030 μg/kg～0.060 μg/kg,SAs:0.006 μg/kg～0.010 μg/kg,QNs:0.014 μg/kg～0.031 μg/kg. 采用加標(biāo)法測定3類抗生素的回收率,其回收率為TCs:71.1%～107.54%,SAs:67.2%～82.6%,QNs:61.4%～72.9%,回收率的標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)均低于8%,表明該方法的準(zhǔn)確度和精密度均符合樣品分析要求.

1.4 數(shù)據(jù)分析

用Excel 2016和SPSS 20對數(shù)據(jù)進行分析,對不同處理數(shù)據(jù)進行單因素方差分析(ANOVA)和Duncan多重比較,數(shù)據(jù)以(平均值±標(biāo)準(zhǔn)差)表示,用Origin 2018進行繪圖. 植物對抗生素的富集和轉(zhuǎn)運能力分別用生物濃縮系數(shù)(BCF)和轉(zhuǎn)運系數(shù)(TF)表示,計算公式:BCF=Cp/Cs,其中Cp:抗生素在植物不同部位的濃度(μg/kg);Cs:抗生素在土壤中的濃度(μg/kg);TF=Ca/Cu,其中Ca:植物地上部分抗生素濃度(μg/kg);Cu:植物地下部分抗生素濃度(μg/kg).

2 結(jié)果與討論

2.1 外源抗生素對栽培作物和野生植物抗氧化酶活性及MDA含量的影響

2.1.1 地下部分的抗氧化酶活性和MDA含量

由圖2可知,在抗生素處理下,栽培作物和野生植物的地下部分抗氧化酶活性和MDA含量變化不同. 如圖2(a)所示,抗生素處理對栽培作物和野生植物地下部分的SOD活性有著不同程度的抑制作用,其中栽培作物較CK降低了64.57%～105.52%,野生植物較CK降低了37.17%～56.91%,這可能是由于植物的抗氧化系統(tǒng)具有一定的限度,當(dāng)超過這個限度時抗氧化酶活性將會迅速降低并受到一定的毒害作用[13,18]. 栽培作物和野生植物地下部分的POD活性在抗生素處理下顯著增加,其中栽培作物的變化較大,栽培作物SC的地下部分較CK增加了414.61%(圖2(b));栽培作物和野生植物地下部分的CAT活性較CK分別增加了121.10%～169.79%和20.46%～29.43%,這說明栽培作物地下部分在抗生素處理下更加敏感(圖2(c)).

植物體內(nèi)MDA的產(chǎn)生表明其正受到外界脅迫作用,此時需要植物產(chǎn)生更多的抗氧化酶來清除過量的活性氧自由基(ROS)[19],并且相關(guān)研究表明外源抗生素是脅迫植物產(chǎn)生MDA的生物指標(biāo)之一[20]. 在抗生素處理下,本研究中栽培作物地下部分的MDA含量顯著增加,是其CK的4.19～5.62倍,而野生植物的地下部分的MDA含量均無顯著變化,這進一步說明外源抗生素對栽培作物地下部分的脅迫作用更大(圖2(d)).

2.1.2 地上部分的抗氧化酶活性和MDA含量

如圖3(a)所示,抗生素處理對栽培作物和野生植物的地上部分SOD活性總體上表現(xiàn)出抑制作用,兩者較CK分別下降了178.24%～260.00%和24.64%～168.14%,栽培作物受到的抑制作用更明顯;栽培作物和野生植物地上部分的POD活性在抗生素處理下均顯著增加,其中栽培作物是其CK的3.56～9.81倍,野生植物是其CK的1.36～3.36倍,這表明外源抗生素對栽培作物的地上部分的POD活性的影響要大于野生植物的地上部分(圖3(b));對于CAT活性,栽培作物地上部分的CAT活性在抗生素處理下較CK提高了20.85%～61.98%,而野生植物的地上部分較CK卻沒有顯著變化(圖3(c));抗生素處理顯著增加了栽培作物地上部分的MDA含量,較CK高374.50%～653.19%,其中栽培作物YM的地上部分MDA含量最高,是其他3種野生植物地上部分的3.68～5.26倍,相比野生植物地上部分的MDA含量較CK的變化,栽培作物地上部分對外源抗生素的脅迫作用則更為敏感(圖3(d)).

以上的分析表明,不論地上部分還是地下部分,栽培作物受到外源抗生素的脅迫作用在一定程度上都要大于野生植物,但由于野生植物在抗生素污染環(huán)境中經(jīng)過自然選擇,可能對抗生素具有一定的耐受性,因此其可能對抗生素有著更好的適應(yīng)性,并且本研究的結(jié)果也印證了這一點,因此關(guān)于抗生素對栽培作物和野生植物抗氧化酶活性的影響及作用機制還需進一步探討.

2.2 抗生素在栽培作物和野生植物中的含量和根際土壤中的殘留量

經(jīng)檢測,種植在無抗生素污染土壤的栽培作物和野生植物中均未檢測到9種目標(biāo)抗生素,因此本文不對其進行討論,重點討論種植在抗生素污染土壤中的栽培作物和野生植物對抗生素的富集轉(zhuǎn)運.

由圖4可知,抗生素在栽培作物和野生植物及其不同部位中的含量不同. 對于地下部分,栽培作物中抗生素的總含量均顯著高于野生植物,其中以栽培作物QC的抗生素含量最高,是野生植物的1.58～2.33倍;對于地上部分,整體上栽培作物中抗生素的總含量高于野生植物(除野生植物BC外). 另外,栽培作物和野生植物的不同部位中均殘留了TCs,而QNs僅在栽培作物QC和SC的地下部分有殘留,這可能是由于土壤中殘留的QNs濃度本來就相對較低,兩者同一部位中抗生素的積累量均為TCs>SAs>QNs,以上分析一定程度上表明栽培作物富集抗生素的能力強于野生植物.

由圖5可知,栽培作物和野生植物對收獲時根際土壤中抗生素的殘留量也有著一定的影響. 與空白對照土壤(60 d)相比,TCs在栽培作物和野生植物的根際土壤中分別下降了9.26%～27.28%和5.51%～14.12%,SAs下降了11.25%～17.68%和8.61%～15.67%,而QNs在根際土壤中則相對穩(wěn)定,無明顯的變化. 所有根際土壤樣品中抗生素的總殘留量均呈顯著下降趨勢,下降了約7.40%～22.19%,這表明栽培作物和野生植物都可以降低土壤中抗生素的殘留量. 整體上,野生植物根際土壤中抗生素的總殘留量要高于栽培作物,并且其體內(nèi)抗生素的含量也低于栽培作物,即植物體內(nèi)抗生素殘留的量越少,土壤中抗生素殘留的量即越多,反之亦然.

2.3 栽培作物和野生植物對抗生素的富集轉(zhuǎn)運特征

由表3可知,栽培作物和野生植物地下部分對TCs的富集系數(shù)分別為0.026～0.035和0.017～0.020,這說明栽培作物地下部分富集TCs的能力要大于野生植物的地下部分;3種栽培作物地下部分都可以富集SAs,而野生植物僅有BC可以富集;QNs僅有栽培作物QC和YM的地下部分可以富集,野生植物均無法富集. 同樣兩者地上部分對TCs的富集能力也表現(xiàn)為栽培作物大于野生植物. 整體上,栽培作物的地下、地上部分富集抗生素的能力都要高于野生植物,且兩者相同部位對不同類型抗生素的富集能力基本一致,為TCs>SAs>QNs.

植物富集污染物的能力與植物對污染物的抵抗能力有關(guān)[21],本研究發(fā)現(xiàn)栽培作物對抗生素的氧化脅迫更為敏感,所以這也可能是導(dǎo)致栽培作物富集抗生素能力較強的原因之一. 雖然影響植物富集土壤中抗生素的因素很多,包括抗生素的種類、濃度以及植物的品種等[13],但這也在一定程度上說明,栽培作物相較于野生植物更容易吸收土壤中的抗生素. 一般來說,土壤中的污染物濃度越高,植物對污染物的吸收量也越大. 本研究中,土壤中抗生素殘留量最大的為TCs,并且栽培作物和野生植物都對TCs的富集能力最高,這也進一步說明植物體內(nèi)抗生素的分布與土壤中抗生素濃度有著顯著的正相關(guān)[22].

表3 抗生素在栽培作物和野生植物不同部位中的生物富集系數(shù)(BCF)Table 3 Bioconcentration factors(BCF)of antibiotics in different parts of cultivated crops and wild plants

注:字母不同代表同一列的顯著差異性(Duncan test;P<0.05);±后代表3個重復(fù)樣品的的標(biāo)準(zhǔn)偏差;-表示抗生素濃度低于檢出限,無法計算相關(guān)系數(shù). 下同.

如表4所示,栽培作物和野生植物對抗生素的轉(zhuǎn)運系數(shù)范圍分別為:0.384～0.460和0.329～0.559,其中野生植物BC對TCs和SAs的轉(zhuǎn)運能力均最強,其轉(zhuǎn)運系數(shù)分別是栽培作物的1.24～1.52倍和1.03～1.31倍. 不論栽培作物還是野生植物,都對TCs有著較強的轉(zhuǎn)運能力,這也可能與土壤中TCs的濃度較高有關(guān). 所有植物地上部分均未檢出QNs,故無法計算其轉(zhuǎn)運系數(shù),這也在一定程度上表明QNs難以被植物轉(zhuǎn)運,栽培作物和野生植物對不同類型抗生素的轉(zhuǎn)運能力均為TCs>SAs>QNs. 整體上,植物轉(zhuǎn)運抗生素的能力為野生植物>栽培作物,這與植物富集抗生素能力為栽培作物>野生植物的結(jié)果恰好相反. 本研究只關(guān)注了短期效應(yīng),當(dāng)土壤中不斷地施用畜禽糞便引入抗生素,隨著時間的推移轉(zhuǎn)運抗生素能力強的植物其生態(tài)風(fēng)險也會變大. 相關(guān)研究表明抗生素在植物中的TF還與植物蒸騰作用、生長速度、疏水性和電離能力等因素有關(guān)[23-25],因此關(guān)于栽培作物和野生植物轉(zhuǎn)運抗生素的機制還需要進一步的研究.

表4 栽培作物和野生植物中抗生素的轉(zhuǎn)運系數(shù)(TF)Table 4 Translocation factor of antibiotics in cultivated crops and wild plants

2.4 抗生素的含量與植物生理指標(biāo)的相關(guān)性

相關(guān)性分析的結(jié)果進一步說明外源抗生素對栽培作物和野生植物的氧化脅迫程度不同(表5). 根際土壤中抗生素的含量與栽培作物地下、地上部分SOD活性呈極顯著正相關(guān)(r=0.923,P<0.01;r=0.866,P<0.01),而與野生植物的SOD活性無顯著相關(guān)性(P>0.05);栽培作物地上部分POD活性與其根際土壤、地上部分的抗生素含量呈(極)顯著負相關(guān)(r=-0.682,P<0.05;r=-0.913,P<0.01),而野生植物地上部分POD活性卻與其根際土壤、地上部分的抗生素含量呈(極)顯著正相關(guān)(r=0.739,P<0.05;r=0.956,P<0.01);栽培作物地下部分的CAT活性與其對應(yīng)部位的抗生素含量呈顯著負相關(guān)(r=-0.267,P<0.05);野生植物地上部分MDA含量與其對應(yīng)部位的抗生素含量呈顯著正相關(guān)(r=0.670,P<0.05). 產(chǎn)生以上結(jié)果的原因可能是豬糞在引入抗生素的同時,也會導(dǎo)致重金屬、鹽、有機物等污染物進入到土壤[26-27],誘導(dǎo)植物產(chǎn)生ROS而干擾抗氧化酶的活性和MDA的含量.

表5 植物和根際土壤中抗生素含量與植物抗氧化酶活的相關(guān)性Table 5 Correlation between antibiotic content and antioxidant enzyme activity in plants and rhizosphere soils

注:**表示在P<0.01水平(雙側(cè))上顯著相關(guān);*表示在P<0.05水平(雙側(cè))上顯著相關(guān).

3 結(jié)論

(1)外源抗生素對栽培作物的SOD活性呈抑制作用,并且栽培作物的MDA含量在外源抗生素處理下顯著增加,特別是栽培植物玉米. 這表明栽培作物受到外源抗生素的脅迫作用更強,在抗生素污染的土壤中,要更關(guān)注短期培養(yǎng)的栽培作物對抗生素的響應(yīng).

(2)栽培作物和野生植物不同部位抗生素的含量基本一致,為地下部分>地上部分;兩者對外源抗生素的富集能力整體上呈現(xiàn):栽培作物>野生植物,但其轉(zhuǎn)運抗生素的能力為野生植物>栽培作物,因此不論栽培作物還是野生植物,都具有一定的生態(tài)風(fēng)險.

(3)栽培作物和野生植物對不同類型抗生素的富集能力均表現(xiàn)為TCs>SAs>QNs,且兩者體內(nèi)及其根際土壤中抗生素殘留量也表現(xiàn)為TCs>SAs>QNs,因此在抗生素污染的土壤-植物系統(tǒng)中TCs的生態(tài)風(fēng)險較高.