血清miR-125b、miR-142-3p表達(dá)與膿毒癥預(yù)后的關(guān)系及其預(yù)測(cè)價(jià)值

徐志育，謝曉紅，朱永，周忠義，雷振林

膿毒癥是一種由感染、創(chuàng)傷等損傷因素引發(fā)的全身炎性反應(yīng)綜合征(SIRS)[1]，該綜合征在重癥醫(yī)學(xué)科(ICU)較為多見，因此ICU患者的病死率通常高于其他科室[2]。目前，關(guān)于膿毒癥的發(fā)病機(jī)制尚未完全明確，大多數(shù)學(xué)者認(rèn)為其發(fā)病的核心為炎性反應(yīng)失衡[3]，當(dāng)機(jī)體受到創(chuàng)傷、感染等損傷時(shí)，機(jī)體的各種細(xì)胞和體液系統(tǒng)被激活，產(chǎn)生大量的炎性介質(zhì)，炎性介質(zhì)又會(huì)作用于各種炎性細(xì)胞，產(chǎn)生級(jí)聯(lián)放大效應(yīng)，加重機(jī)體的炎性反應(yīng)，導(dǎo)致全身炎性反應(yīng)失衡，最終發(fā)展成全身多器官功能障礙[4]。因此，控制全身炎性反應(yīng)失衡，有助于膿毒癥患者的治療和預(yù)后[5]。微小RNA(microRNA，miRNA)是一類由內(nèi)源性基因編碼的單鏈RNA，其長(zhǎng)度為18～22個(gè)核苷酸，主要通過降解信使RNA(mRNA)或抑制翻譯過程調(diào)控轉(zhuǎn)錄后基因表達(dá)，從而參與發(fā)育、炎性疾病、膿毒癥和衰老等過程[6-7]。研究發(fā)現(xiàn)，miR-125b和miR-142-3p與炎性反應(yīng)密切相關(guān)，可以通過多種途徑調(diào)控炎性因子的表達(dá)[8-9]。因此，現(xiàn)檢測(cè)患者血清miR-125b和miR-142-3p的表達(dá)，分析其與相關(guān)臨床指標(biāo)和實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)的關(guān)系，及其對(duì)膿毒癥患者的預(yù)后評(píng)估價(jià)值，報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2017年1月—2019年10月海南省人民醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科重癥監(jiān)護(hù)室(ICU)住院的膿毒癥患者100例作為膿毒癥組，其中腹腔感染34例，肺部感染38例，顱內(nèi)感染10例，泌尿系統(tǒng)感染18例。男43例，女57例，年齡25～83(61.43±20.52)歲，急性生理和慢性健康評(píng)分量表(APACHE Ⅱ)評(píng)分為(17.22±7.17)分，序貫器官衰竭估計(jì)評(píng)分(SOFA)為(7.25±3.51)分。另選取同期于醫(yī)院ICU住院的非膿毒癥患者90例作為對(duì)照組，其中腦出血35例，腦梗死42例，其他13例。男42例，女48例，年齡27～80(58.92±18.46)歲, APACHE Ⅱ評(píng)分為(15.96±5.63)分，SOFA評(píng)分為(6.52±3.75)分。2組患者性別、年齡、APACHE Ⅱ評(píng)分和SOFA評(píng)分比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，患者或家屬對(duì)研究知情同意且簽署同意書。

1.2 選擇標(biāo)準(zhǔn) (1)納入標(biāo)準(zhǔn)：①符合2016年美國(guó)重癥醫(yī)學(xué)會(huì)和歐洲重癥醫(yī)學(xué)會(huì)聯(lián)合發(fā)布的膿毒癥Sepsis3.0診斷標(biāo)準(zhǔn)[10]；②年齡>18歲。(2)排除標(biāo)準(zhǔn)：①入院1 d內(nèi)死亡者；②入院前使用激素藥物；③合并惡性腫瘤的患者；④患有慢性肝臟疾病、腎臟疾病和自身免疫性疾病的患者。

1.3 觀測(cè)指標(biāo)與方法

1.3.1 APACHEⅡ、SOFA評(píng)分相關(guān)指標(biāo)檢測(cè)[11]：2組患者進(jìn)入ICU后24 h內(nèi)，根據(jù)APACHE Ⅱ的相關(guān)計(jì)算參數(shù)收集體溫、血鉀、血鈉等相應(yīng)指標(biāo)的最差值，并計(jì)算APACHE Ⅱ評(píng)分；按照SOFA的相關(guān)計(jì)算參數(shù)收集血小板、多巴胺、膽紅素等相應(yīng)指標(biāo)的最差值，計(jì)算SOFA評(píng)分。

1.3.2 WBC、PCT和CRP檢測(cè)：患者進(jìn)入ICU 24 h內(nèi)采集肘靜脈血10 ml，放置1 h后， 離心收集上層血清。其中5 ml血清使用全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)白細(xì)胞總數(shù)(WBC)、降鈣素原(PCT)和C反應(yīng)蛋白 (CRP)。另5 ml血清放置于-80℃超低溫冰箱保存。

1.3.3 血清炎性因子檢測(cè)：將儲(chǔ)存在超低溫冰箱的血清取出，置于室溫融化，使用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)法檢測(cè)血清腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白介素-1β(IL-1β)和IL-6，試劑盒均購(gòu)自Abcam公司，所有樣品處理和操作嚴(yán)格按照試劑盒說明進(jìn)行。

1.3.4 血清miR-125b和miR-142-3p表達(dá)檢測(cè)： 使用血清RNA提取試劑盒(Life Technologies公司)提取血清總RNA，使用Nanodrop 2000(Thermo Fisher Scientific 公司)檢測(cè)總RNA濃度和純度，采用北京天根生化科技有限公司的RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將提取總RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。以cDNA為模板進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR：反應(yīng)體系20 μl，2 × qPCR Mix 10 μl、上下游引物各2 μl、cDNA 1 μl、ddH2O 7 μl。反應(yīng)過程：預(yù)變性 95℃、15 min， 72 ℃、34 s， 94 ℃、29 s， 60 ℃、34 s，重復(fù)循環(huán)40 次；溶解曲線 72 ℃、1 min。以U6作為內(nèi)參基因，采用2-△△Ct法計(jì)算miR-125b和miR-142-3p的相對(duì)表達(dá)量，以表示目的基因表達(dá)水平。引物序列見表1。

表1 不同基因的引物序列

2 結(jié) 果

2.1 2組臨床資料比較 膿毒癥組WBC、CRP、PCT、TNF-α、IL-6、IL-1β、miR-125b和miR-142-3p水平高于對(duì)照組(P均<0.01)，2組APACHE Ⅱ評(píng)分和SOFA評(píng)分比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)，見表2。

表2 2組患者臨床資料比較

2.2 膿毒癥患者2亞組臨床資料比較 根據(jù)膿毒癥患者28 d病死情況將患者分為存活亞組(63例)和死亡亞組(37例)。存活亞組患者入院時(shí)APACHE Ⅱ評(píng)分、SOFA評(píng)分、PCT、TNF-α、IL-1β、miR-125b和miR-142-3p水平均低于死亡亞組(P均<0.01)；而2亞組WBC、CRP和IL-6水平比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)，見表3。

表3 2亞組患者臨床資料比較

2.3 miR-125b和miR-142-3p與膿毒癥相關(guān)指標(biāo)的關(guān)系 Pearson相關(guān)性分析顯示，miR-125b與APACHE Ⅱ評(píng)分、SOFA評(píng)分、CRP、PCT、TNF-α和IL-6呈正相關(guān)(P均<0.05)，與WBC和IL-1β無明顯相關(guān)性(P>0.05)；miR-142-3p與PCT、TNF-α、IL-6和IL-1β呈正相關(guān)(P均<0.05)，與APACHE Ⅱ評(píng)分、SOFA評(píng)分、WBC和CRP無明顯相關(guān)性(P>0.05)，見表4。

表4 miR-125b和miR-142-3p與膿毒癥相關(guān)指標(biāo)的關(guān)系

2.4 miR-125b和miR-142-3p對(duì)膿毒癥患者的預(yù)后價(jià)值 繪制ROC曲線評(píng)估m(xù)iR-125b和miR-142-3p對(duì)膿毒癥患者預(yù)后的預(yù)測(cè)價(jià)值，血清miR-125b的AUC為0.746(95%CI0.676～0.817)，最佳臨界值為1.74，敏感度和特異度分別為79.57%和72.26%，約登指數(shù)為0.518；血清miR-142-3p的AUC為0.685(95%CI0.609～0.760)，最佳臨界值為2.68，敏感度和特異度分別為68.03%和71.15%，約登指數(shù)為0.392，見圖1。

圖1 miR-125b和miR-142-3p對(duì)膿毒癥預(yù)測(cè)價(jià)值的 ROC曲線分析

3 討 論

膿毒癥是ICU危重患者死亡的主要原因之一，據(jù)統(tǒng)計(jì)，全球每年膿毒癥新發(fā)病例約3 150萬(wàn)例，每年死亡例數(shù)達(dá)到530萬(wàn)例[12]。有學(xué)者提出早期預(yù)測(cè)膿毒癥患者死亡風(fēng)險(xiǎn)，及時(shí)給予個(gè)體化治療具有十分重要的臨床意義[13]。現(xiàn)有生物標(biāo)志物如IL-6、CRP、WBC和PCT是評(píng)價(jià)感染的指標(biāo)，但這些指標(biāo)在一些非感染性疾病中也升高，對(duì)于死亡風(fēng)險(xiǎn)的預(yù)測(cè)能力有限[14]。近幾年研究顯示，由于miR在血液中的穩(wěn)定性強(qiáng)，化學(xué)結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，因此，循環(huán)系統(tǒng)中miR用作生物標(biāo)志物的性能可能優(yōu)于其他血清標(biāo)志物[15]。多項(xiàng)研究顯示miR-125b和miR-142-3p是某些炎性疾病的風(fēng)險(xiǎn)標(biāo)志物[8, 9, 16]，并且miR-125b和miR-142-3p參與了膿毒癥的發(fā)病過程[17-18]，提示miR-125b和miR-142-3p可能作為膿毒癥的死亡風(fēng)險(xiǎn)標(biāo)志物。

本次研究中，膿毒癥組患者血清WBC、CRP、PCT、TNF-α、IL-6和IL-1β水平明顯高于對(duì)照組，李愛林等[19]的研究也顯示，膿毒癥患者血清CRP和PCT水平高于健康成年人。本研究采用多項(xiàng)炎性因子指標(biāo)，進(jìn)一步驗(yàn)證了膿毒癥是一種全身炎性反應(yīng)綜合征，機(jī)體存在炎性反應(yīng)失衡[20]，同時(shí)也檢測(cè)了血清中miR-125b和miR-142-3p表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)膿毒癥組患者血清miR-125b和miR-142-3p表達(dá)水平顯著高于對(duì)照組，Zhu[21]的研究也發(fā)現(xiàn)，miR-125b在膿毒癥組患者血清中表達(dá)水平顯著增加，上述研究均提示miR-125b和miR-142-3p與膿毒癥有關(guān)。有miR測(cè)序研究顯示，miR-125b是炎性疾病的潛在標(biāo)志物[16]，本次研究發(fā)現(xiàn)，死亡亞組患者入院時(shí)血清miR-125b相對(duì)表達(dá)量高于存活亞組。ROC曲線結(jié)果顯示，血清miR-125b預(yù)測(cè)膿毒癥患者預(yù)后的AUC為0.746，最佳臨界值為1.74，敏感度和特異度分別為79.57%和72.26%,提示miR-125b也可以作為膿毒癥患者死亡風(fēng)險(xiǎn)增加的生物標(biāo)志物。而Zhu[21]的研究中血清miR-125b預(yù)測(cè)膿毒癥患者預(yù)后的AUC為0.658，低于本次研究，可能是患者病情的嚴(yán)重程度不同及基礎(chǔ)疾病不同造成的。本研究還發(fā)現(xiàn)，死亡亞組患者入院時(shí)APACHE Ⅱ評(píng)分、SOFA評(píng)分、PCT、TNF-α和IL-1β水平也顯著高于存活亞組，說明病情和感染越嚴(yán)重的患者預(yù)后越差。此外，miR-125b與APACHE Ⅱ評(píng)分、SOFA評(píng)分、CRP、PCT、TNF-α和IL-6水平呈正相關(guān)，提示miR-125b可能是通過多種途徑促進(jìn)機(jī)體炎性反應(yīng)和器官功能障礙，具體機(jī)制可能是miR-125b和p38絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)相互作用，通過調(diào)節(jié)p38 MAPK/核轉(zhuǎn)錄因子κB (nuclear factor kappa-B，NF-κB)信號(hào)通路促進(jìn)炎性因子的釋放[18]，因此miR-125b與TNF-α和IL-6呈正相關(guān)，以嚴(yán)重炎性反應(yīng)為特征的膿毒癥患者血清miR-125b的表達(dá)水平也升高。另一方面，膿毒癥會(huì)誘發(fā)多種器官功能障礙和衰竭，而miR-125b可以促進(jìn)心臟纖維化及成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)變成肌成纖維細(xì)胞，還可以引起急慢性肝功能衰竭[22-23]，因此以多器官功能障礙和衰竭為特征的膿毒癥患者血清miR-125b表達(dá)水平增加。

本次研究還發(fā)現(xiàn)，死亡亞組患者入院時(shí)血清miR-142-3p表達(dá)水平高于存活亞組，miR-142-3p表達(dá)與PCT、TNF-α、IL-6和IL-1β呈正相關(guān)，提示miR-142-3p可能參與調(diào)控炎性因子的表達(dá)，其機(jī)制可能與Sirtuin1有關(guān)，研究顯示，miR-142-3p可通過Sirtuin1/NF-κB信號(hào)通路促進(jìn)炎性因子的釋放[24]，膿毒癥動(dòng)物模型研究顯示，miR-142-3p可能通過降低腺苷酸環(huán)化酶(adenylyl cyclase，AC)的表達(dá)促進(jìn)炎性反應(yīng)，進(jìn)而調(diào)控TNF-α和IL-1β的表達(dá)水平[16]，且另外有研究顯示，miR-142-3p可以直接調(diào)控IL-6的表達(dá)水平[25]。但miR-142-3p與APACHE Ⅱ評(píng)分、SOFA評(píng)分、WBC、CRP無明顯相關(guān)性，說明miR-142-3p與膿毒癥的關(guān)聯(lián)弱于miR-125b，經(jīng)ROC曲線評(píng)估其預(yù)測(cè)價(jià)值，發(fā)現(xiàn)其AUC、敏感度及特異度均小于miR-125b，提示miR-142-3p表達(dá)雖然在膿毒癥患者中異常升高，但其預(yù)測(cè)膿毒癥患者預(yù)后的價(jià)值較miR-125b低，這可能是受到樣本量及遺傳因素的影響造成結(jié)果的偏倚。本研究因研究時(shí)間有限，尚未進(jìn)一步探究miR-125b和miR-142-3p在膿毒癥發(fā)生發(fā)展過程中的機(jī)制，后續(xù)將擴(kuò)大樣本量并做二者的聯(lián)合檢測(cè)以期提高對(duì)膿毒癥患者預(yù)后的預(yù)測(cè)價(jià)值，為臨床膿毒癥的治療提供依據(jù)。

綜上所述，膿毒癥患者血清中 miR-125b和miR-142-3p表達(dá)升高，且均與不良預(yù)后有關(guān)，miR-142-3p表達(dá)與PCT、TNF-α、IL-6和IL-1β呈正相關(guān)，其預(yù)測(cè)膿毒癥患者的價(jià)值較低，miR-125b表達(dá)與APACHE Ⅱ評(píng)分、SOFA評(píng)分、CRP、PCT、TNF-α及IL-6均呈正相關(guān)，其對(duì)膿毒癥患者預(yù)后具有較好的預(yù)測(cè)價(jià)值。