腦膜瘤組織中miR-190和FOXP2表達(dá)及其與患者預(yù)后的關(guān)系

李雄飛，胡偉，周明安，田少斌

腦膜瘤發(fā)于腦膜及腦膜間隙的中樞神經(jīng)系統(tǒng)，多為良性，具有生長緩慢、病程長等特點。腦膜瘤在中老年人群發(fā)病較高，且女性發(fā)病率高于男性。由于外界環(huán)境影響，近年來腦膜瘤發(fā)病率逐年遞增，嚴(yán)重影響人類健康及生活質(zhì)量。若不能得到有效治療，腦膜瘤患者易出現(xiàn)復(fù)發(fā)或腫瘤惡性進(jìn)展，降低患者生存率[1]。雖然腦膜瘤影響因素相關(guān)研究已較多，但在分子層面探究腦膜瘤患者預(yù)后相關(guān)因子，對確定治療方案及改善患者預(yù)后仍具有重要意義。有研究表明，微小RNA(miR)-190在乳腺癌中表達(dá)下調(diào)，可抑制乳腺癌的體內(nèi)外轉(zhuǎn)移，其表達(dá)水平與乳腺癌患者預(yù)后有關(guān)[2]。宋默等[3]研究表明，miR-190在結(jié)直腸癌組織中表達(dá)水平顯著降低，與結(jié)直腸癌細(xì)胞生長和轉(zhuǎn)移有關(guān)，miR-190在結(jié)直腸癌進(jìn)展中起抑癌作用。研究報道，叉頭框蛋白P2(FOXP2)在肝癌組織中表達(dá)下調(diào)，顯著增強(qiáng)癌細(xì)胞侵襲性，F(xiàn)OXP2低表達(dá)與總體生存率較差有關(guān)[4]。Chen等[5]研究發(fā)現(xiàn)，乳腺癌細(xì)胞中下調(diào)FOXP2能促進(jìn)癌細(xì)胞增殖、遷移，F(xiàn)OXP2表達(dá)降低與惡性乳腺癌發(fā)生及患者不良預(yù)后有關(guān)。miR-190與FOXP2表達(dá)均與腫瘤內(nèi)皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化有關(guān)[6-7]，然而二者與腦膜瘤預(yù)后的關(guān)系尚不清楚?，F(xiàn)分析腦膜瘤中miR-190與FOXP2表達(dá)水平，及其與腦膜瘤患者臨床病理特征及預(yù)后的相關(guān)性，報道如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2009年8月—2014年10月湖北省天門市第一人民醫(yī)院神經(jīng)外科診治腦膜瘤患者108例作為研究對象，其中男33例，女75例，年齡31～79(58.33±12.57)歲； 病程10 d～5年，平均(2.34±0.72)年；基礎(chǔ)?。焊哐獕?、糖尿病16例；有腦顱外傷史23例；有家族遺傳史10例。根據(jù)世界衛(wèi)生組織(WHO)分類標(biāo)準(zhǔn)[8]：Ⅰ級(良性)73例，Ⅱ～Ⅲ級(非典型性、退行性或惡性)35例；按腫瘤直徑分類：>4 cm 60例，≤4 cm 48例；按手術(shù)切除率分類：全部切除69例，部分切除39例。本研究已經(jīng)過醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)同意，患者及其家屬對本研究知情并簽署知情同意書。

1.2 病例選擇標(biāo)準(zhǔn) (1)納入標(biāo)準(zhǔn)：①經(jīng)MR診斷確診為腦膜瘤；②入院治療前未進(jìn)行放、化療者；③臨床資料完整。(2)排除標(biāo)準(zhǔn)：①非首次患腫瘤者；②合并患有其他部位腫瘤者；③患有嚴(yán)重精神疾病者；④心、腎、肝臟功能嚴(yán)重不足者。

1.3 觀測指標(biāo)與方法

1.3.1 樣本采集：術(shù)中收集腦膜瘤患者癌組織及相應(yīng)癌旁組織(距病灶>2 cm)，一部分放入液氮中迅速冷凍后立即放入-80℃冰箱保存，用于實時熒光定量PCR(qRT-PCR)；另一部分經(jīng)10%福爾馬林溶液固定，制成4 μm厚切片，用于免疫組織化學(xué)染色。

1.3.2 qRT-PCR檢測miR-190、FOXP2 mRNA相對表達(dá)量： 使用RNA提取試劑盒(北京百泰克生物技術(shù)有限公司)提取總RNA后，經(jīng)反轉(zhuǎn)錄(試劑盒購自上?？道噬锟萍加邢薰?得到cDNA，使用7500 Fast型qRT-PCR儀(美國ABI公司)及qRT-PCR試劑盒(北京寶日醫(yī)生物技術(shù)有限公司)進(jìn)行實驗。qRT-PCR 20 μl 反應(yīng)體系如下，SYBR Premix Ex TaqTM(2×) 10 μl，ROX Reference Dye(50×)0.4 μl，上游引物0.8 μl，下游引物0.8 μl，cDNA 2 μl，dH2O 6 μl。qRT-PCR反應(yīng)程序如下：95℃、30 s，1個循環(huán)；95℃、5 s,63℃、34 s， 40個循環(huán)。一個樣品設(shè)置3次重復(fù)，使用2-△△CT法計算miR-190、FOXP2 mRNA相對表達(dá)量。miR-190以U6為內(nèi)參基因，F(xiàn)OXP2以GAPDH為內(nèi)參基因。引物由北京寶日醫(yī)生物技術(shù)有限公司合成，見表1。

表1 qRT-PCR引物序列

1.3.3 免疫組織化學(xué)染色檢測FOXP2蛋白表達(dá)水平：使用免疫組織化學(xué)染色試劑盒(上海優(yōu)予生物科技有限公司)檢測。鼠抗人FOXP2多克隆抗體購自亞諾法生技股份有限公司，羊抗鼠二抗購自上海優(yōu)予生物科技有限公司；嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行操作。DM2700型顯微鏡(德國徠卡公司)400倍下觀察染色結(jié)果，并采集圖像資料，鏡下選取6個視野進(jìn)行陽性細(xì)胞計數(shù)。

染色結(jié)果判定：細(xì)胞核中出現(xiàn)棕黃色或棕褐色顆粒為FOXP2蛋白表達(dá)陽性細(xì)胞。分別根據(jù)染色強(qiáng)度和陽性細(xì)胞比例記分。(1)染色強(qiáng)度：無色0分，淡黃色1分，棕黃色2分，棕褐色3分。(2)陽性細(xì)胞比例：以<5%為0分，≥5%且≤25%為1分，>26%且≤50%為2分，>51%且≤75%為3分，>75%為4分。兩類記分相乘，0分為陰性(-)，1～4分為弱陽性(+)，5～8分為陽性(++)，9～12分為強(qiáng)陽性(+++)，將陰性(-)、弱陽性(+)定義為FOXP2蛋白低表達(dá)，陽性(++)、強(qiáng)陽性(+++)定義為FOXP2蛋白高表達(dá)。

1.4 隨訪 腦膜瘤患者經(jīng)手術(shù)或放射治療出院后，以電話或復(fù)查形式進(jìn)行5年隨訪，隨訪期間主要觀察患者是否有不良事件(復(fù)發(fā)或死亡)發(fā)生，分析患者5年無瘤生存情況。

2 結(jié) 果

2.1 miR-190、FOXP2 mRNA表達(dá)水平比較 腦膜瘤組織中miR-190、FOXP2 mRNA表達(dá)水平均顯著低于癌旁組織(P均<0.01)，見表2。

表2 腦膜瘤組織和癌旁組織miR-190、 FOXP2 mRNA表達(dá)量比較

2.2 FOXP2蛋白表達(dá)水平比較 FOXP2蛋白主要在細(xì)胞核中表達(dá)，腦膜瘤組織中FOXP2蛋白陽性表達(dá)率顯著低于癌旁組織(67.59%vs.90.74%，χ2=17.544，P=0.000)，見圖1。

圖1 腦膜瘤組織和癌旁組織中FOXP2蛋白染色結(jié)果 (免疫組織化學(xué)染色，×400)

2.3 不同臨床特征患者miR-190 mRNA、FOXP2蛋白表達(dá)水平比較 將腦膜瘤組織以miR-190表達(dá)水平平均數(shù)(0.64)和FOXP2蛋白免疫組化染色結(jié)果分為高表達(dá)和低表達(dá)亞組。腦膜瘤組織中miR-190、FOXP2蛋白高/低表達(dá)水平在不同性別、年齡、病程、有無患基礎(chǔ)病、有無腦顱外傷史、有無家族遺傳史、腫瘤直徑、手術(shù)切除方式及是否接受放射治療患者中比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，而在WHO分級、術(shù)前腦干是否水腫方面比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P均<0.01)，見表3。

2.4 miR-190、FOXP2高/低表達(dá)腦膜瘤患者預(yù)后比較 Kaplan-Meier分析結(jié)果顯示，miR-190高表達(dá)亞組5年無瘤生存率為58.33%，高于miR-190低表達(dá)亞組的28.33%(χ2=10.170，P=0.001)；FOXP2高表達(dá)亞組為72.09%，高于FOXP2低表達(dá)亞組的33.85%(χ2=11.290，P=0.001)，見圖2。

2.5 腦膜瘤患者預(yù)后影響因素分析 單因素Cox回歸分析結(jié)果顯示，性別、年齡、腫瘤直徑與腦膜瘤患者預(yù)后無關(guān)(P均>0.05)，無放射治療、術(shù)前腦干水腫、部分切除、WHO分級高、miR-190低表達(dá)、FOXP2低表達(dá)是影響腦膜瘤患者不良預(yù)后危險因素(P均<0.05)，見表4。

3 討 論

日常生活中有害化學(xué)物質(zhì)、放射性照射、機(jī)械性顱腦損傷、病毒感染、基因突變等均可能引發(fā)腦膜瘤。腦膜瘤早期癥狀有頭痛、視力下降、肢體無力等，隨著疾病進(jìn)展，患者易出現(xiàn)智力下降、癲癇、肢體運動障礙等癥狀，嚴(yán)重者危及生命[9-10]。腦膜瘤患者經(jīng)手術(shù)治療或放射治療后生存期較長，但腫瘤切除不完全、患者術(shù)后情緒差等因素易導(dǎo)致復(fù)發(fā)或死亡等不良預(yù)后[11-14]。因此，尋找腦膜瘤預(yù)后標(biāo)志物對于有效評估患者預(yù)后、提高患者生存率、延長生存時間有一定幫助[15-16]。

表3 腦膜瘤組織中miR-190、FOXP2高/低表達(dá)水平在不同臨床特征中的比較 [例(%)]

圖2 5年無瘤生存率分析 表4 影響腦膜瘤患者預(yù)后不良危險因素Cox回歸分析

變 量β值SE值Wald值P值HR值(95%CI)性別0.5060.5240.9310.2411.658(0.594～4.628)年齡0.6300.4561.9070.2121.877(0.768～4.635)腫瘤直徑0.5610.3612.4130.2031.752(0.863～3.557)放射治療0.8950.3985.0600.0462.448(1.121～5.347)術(shù)前腦干是否水腫1.0040.3996.3400.0312.731(1.245～5.989)切除方式1.0010.3826.8620.0352.720(1.284～5.763)WHO分級1.1970.32313.7390.0213.311(1.758～6.236)miR-1901.2630.39010.4920.0133.537(1.649～7.587)FOXP21.3720.39412.1250.0083.943(1.823～8.257)

微小RNA(miRNA)是一種能穩(wěn)定存在于人體組織和細(xì)胞內(nèi)的短鏈非編碼RNA，具有調(diào)控腫瘤進(jìn)展功能。研究發(fā)現(xiàn)，miR-219在腦膜瘤組織中低表達(dá)，與腦膜瘤患者高復(fù)發(fā)率顯著相關(guān)[17]。非典型性腦膜瘤細(xì)胞中miR-145表達(dá)水平明顯低于良性腦膜瘤細(xì)胞，過表達(dá)miR-145可導(dǎo)致癌細(xì)胞增殖減少、凋亡增加[18]。以上研究提示，miRNA可能參與腦膜瘤進(jìn)展，且與患者預(yù)后有關(guān)。Yu等[6]研究報道，miR-190在肝癌組織中低表達(dá)，miR-190可通過抑制上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)，抑制癌細(xì)胞遷移和侵襲。本結(jié)果顯示，miR-190在腦膜瘤組織中表達(dá)水平顯著降低，與Yu等[6]在miR-190與肝癌進(jìn)展關(guān)系研究中發(fā)現(xiàn)相似，提示miR-190下調(diào)可能與腦膜瘤發(fā)生有關(guān)。有研究表明，胃癌細(xì)胞中miR-190下調(diào)，過表達(dá)miR-190能顯著降低胃癌細(xì)胞生存能力[19]。本研究發(fā)現(xiàn)，腦膜瘤組織中miR-190表達(dá)水平與WHO分級有關(guān)，提示miR-190可能參與調(diào)控腦膜瘤發(fā)展，miR-190可能通過影響EMT過程，抑制腫瘤細(xì)胞增殖和侵襲能力，在腦膜瘤發(fā)生中起阻礙作用。有研究報道，miR-190通過靶向Smad2下調(diào)TGF-β誘導(dǎo)的EMT過程，抑制乳腺癌體內(nèi)外轉(zhuǎn)移[20]，提示本研究中miR-190可能通過靶向調(diào)控Smad2、TGF-β等EMT上游信號因子表達(dá)，參與腦膜瘤進(jìn)展。Xu等[21]研究表明，miR-190在前列腺癌組織中顯著降低，miR-190低表達(dá)與患者無瘤生存率降低有關(guān)。本研究結(jié)果中，miR-190低表達(dá)亞組5年無瘤生存率顯著降低，與Xu等[21]在前列腺癌組織中研究結(jié)果一致，提示miR-190表達(dá)水平降低可能與腫瘤增殖和遷移能力增加引起的腦膜瘤患者病死率增加有關(guān)。

Diao等[22]研究表明，胰腺導(dǎo)管腺癌中FOXP2表達(dá)下調(diào)，與癌細(xì)胞增殖和侵襲能力增強(qiáng)有關(guān)，可能是胰腺導(dǎo)管腺癌潛在診斷和治療靶點。FOXP2在膠質(zhì)瘤細(xì)胞中表達(dá)水平明顯低于正常星型膠質(zhì)細(xì)胞，上調(diào)FOXP2可明顯降低癌細(xì)胞侵襲能力[23-24]。有研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)OXP2在結(jié)直腸癌組織中低表達(dá)，與神經(jīng)浸潤、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及不良預(yù)后有關(guān)，體外過表達(dá)FOXP2可顯著抑制癌細(xì)胞增殖[25]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與癌旁組織相比，腦膜瘤組織FOXP2 mRNA表達(dá)水平及蛋白陽性表達(dá)率明顯降低，且FOXP2蛋白低表達(dá)與腦膜瘤WHO分級升高、術(shù)前腦干發(fā)生水腫有關(guān)，與劉揆亮等[25]結(jié)果一致，提示FOXP2低表達(dá)可能通過調(diào)控腦膜瘤細(xì)胞增殖促進(jìn)腦膜瘤發(fā)生發(fā)展。FOXP2在乳腺癌中被證實參與腫瘤進(jìn)展中EMT過程，還與腫瘤細(xì)胞G1/S轉(zhuǎn)換及增殖有關(guān)[7]，因此推測FOXP2也可能通過參與EMT過程影響調(diào)控腦膜瘤進(jìn)展。有研究報道，乳腺癌組織中FOXP2可能誘導(dǎo)了TGF-β/Smad信號通路參與的EMT過程，導(dǎo)致乳腺癌細(xì)胞侵襲和遷移能力增強(qiáng)[25]。本研究中，F(xiàn)OXP2低表達(dá)也可能通過影響TGF-β/Smad等EMT上游信號途徑激活，促進(jìn)了腦膜瘤細(xì)胞增殖和遷移，參與腦膜瘤進(jìn)展。本研究還發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)OXP2蛋白低表達(dá)亞組患者5年無瘤生存率明顯降低，提示FOXP2低表達(dá)可能通過促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖和遷移，影響腫瘤惡性進(jìn)展，引起5年無瘤生存率低等不良預(yù)后。有研究表明，是否進(jìn)行放射治療、腫瘤是否全部切除、WHO Ⅱ級等均可能影響腦膜瘤患者復(fù)發(fā)、死亡等不良預(yù)后發(fā)生[26]。本研究結(jié)果顯示，術(shù)前腦干水腫、WHO Ⅱ～Ⅲ級、miR-190低表達(dá)、FOXP2低表達(dá)是影響腦膜瘤患者不良預(yù)后的獨立危險因素，提示miR-190與FOXP2可能作為評估腦膜瘤的獨立預(yù)后標(biāo)志物，在腦膜瘤治療過程中應(yīng)關(guān)注miR-190與FOXP2表達(dá)情況，以改進(jìn)治療措施，改善患者預(yù)后。但本研究僅從表達(dá)水平層面分析miR-190、FOXP2在腦膜瘤中作用，若要明確相關(guān)作用機(jī)制，還需進(jìn)一步進(jìn)行更深入的實驗研究。

綜上所述，與癌旁組織相比，腦膜瘤組織中miR-190、FOXP2均呈低表達(dá)，二者表達(dá)水平與WHO分級及5年無瘤生存率有關(guān)，可能作為腦膜瘤生物標(biāo)志物，在評估腦膜瘤患者預(yù)后中有一定價值。但由于本研究樣本量較少、研究方法較為基礎(chǔ)，具體作用機(jī)制尚需進(jìn)一步研究。