白藜蘆醇對(duì)神經(jīng)元缺氧復(fù)氧過程中細(xì)胞凋亡與氧化應(yīng)激反應(yīng)的影響

王濤，汪凱，李亞強(qiáng)，胡盼盼，張梅，余傳慶，薛敏

(1.安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，合肥 230022；2.安徽省淮南市第一人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科、安徽理工大學(xué)第一附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，淮南 232007)

在腦組織缺血-再灌注過程中，氧化應(yīng)激反應(yīng)過程和細(xì)胞凋亡過程過度激活是造成缺血-再灌注損傷的關(guān)鍵[1-2]，抑制氧化應(yīng)激和細(xì)胞凋亡是減輕缺血-再灌損傷、改善再灌注治療效果的重要靶點(diǎn)。白藜蘆醇(resveratrol，Res)是廣泛存在于葡萄、花生等天然植物中的多酚類化合物，具有抗炎、抗氧化、抗凋亡等廣泛的生物學(xué)活性，對(duì)心腦血管系統(tǒng)具有確切保護(hù)效應(yīng)[3]。國內(nèi)研究報(bào)道，Res能夠減輕神經(jīng)元缺氧復(fù)氧(hypoxia/reoxygenation，H/R)損傷，但關(guān)于細(xì)胞凋亡情況及氧化應(yīng)激反應(yīng)程度尚不明確[4]。筆者在本實(shí)驗(yàn)以神經(jīng)元H/R模型模擬腦組織缺血-再灌注過程，以了解Res對(duì)神經(jīng)元H/R過程中細(xì)胞凋亡、氧化應(yīng)激反應(yīng)的影響。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料 Res(購于上海阿拉丁生化科技股份有限公司，批號(hào)：111535-201703)，PC12細(xì)胞株購于中國科學(xué)院細(xì)胞庫(貨號(hào)：C161832)，達(dá)爾伯克改良伊格爾培養(yǎng)基(Dulbecco's modified Eagle medium，DMEM)培養(yǎng)基、胎牛血清、神經(jīng)生長因子購買于Gibco公司(批號(hào)分別為1912，0418A，180221C)，3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-5 -(3-羧甲酯基)-2 -(4 -磺苯基)-2H-四唑[3-(4，5-dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2H-tetrazolium，MTS]細(xì)胞活力檢測試劑盒購于Promega公司(批號(hào)：YK180612131)，2'，7'-二氯二氫熒光素二乙酸酯(2'，7'-dichlorodihydrofluorescein diacetate，DCFH-DA)活性氧檢測試劑盒購于上海碧云天公司(批號(hào)：BYT18110217A)，放射免疫沉淀試劑盒購買于南京建成公司(批號(hào)：18110415A)，RNA提取、cDNA合成、熒光定量PCR試劑盒購買于北京天根公司(批號(hào)分別為18051922，18102913，18112109)；丙二醛酶聯(lián)免疫試劑盒、人晚期氧化蛋白產(chǎn)物檢測試劑盒、人8-羥基脫氧鳥苷酸(8-hydroxy-2-deoxyguanosine，8-OHdG)檢測試劑盒均購自深圳晶美生物科技有限公司(貨號(hào)分別為CEA597Ge，BYS11062B，xy-E10798)。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1細(xì)胞的培養(yǎng)和處理 PC12細(xì)胞復(fù)蘇后用含10%胎牛血清、50 ng·mL-1神經(jīng)生長因子的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，誘導(dǎo)PC12細(xì)胞向神經(jīng)元分化。鏡下觀察到細(xì)胞長出長突起，即認(rèn)為誘導(dǎo)分化成功，然后進(jìn)行消化傳代。傳代后的細(xì)胞接種在培養(yǎng)板中，并分為對(duì)照組、H/R組和不同濃度(40，80 μmol·L-1)Res組。分別按照下列方法處理：對(duì)照組用無血清DMEM培養(yǎng)基在常氧培養(yǎng)箱[37 ℃、5%二氧化碳(CO2)]培養(yǎng)，H/R組用無血清DMEM培養(yǎng)基在缺氧培養(yǎng)箱[37 ℃、5%CO2、95%氮?dú)?N2)]中缺氧培養(yǎng)2 h后在常氧培養(yǎng)箱(37 ℃、5%CO2)中繼續(xù)培養(yǎng)；不同濃度Res組參照文獻(xiàn)[4]研究結(jié)果，分別給予40和80 μmol·L-1Res處理，無血清DMEM培養(yǎng)基在缺氧培養(yǎng)箱(37 ℃、5%CO2、95%N2)中缺氧培養(yǎng)2 h后，在常氧培養(yǎng)箱(37 ℃、5%CO2)中繼續(xù)培養(yǎng)。

1.2.2細(xì)胞活力的檢測 復(fù)氧后12，24，48 h，向培養(yǎng)基中加入MTS試劑盒檢測液，繼續(xù)在培養(yǎng)基中孵育4 h，然后取出培養(yǎng)板，并在酶標(biāo)儀上測定450 nm波長處吸光度值(A值)，細(xì)胞增殖活力值=(對(duì)照組A值-實(shí)驗(yàn)組A值)/對(duì)照組A值。

1.2.3細(xì)胞中氧化應(yīng)激產(chǎn)物的檢測 復(fù)氧后48 h，棄去培養(yǎng)基并保留細(xì)胞，加入蛋白裂解液后充分裂解細(xì)胞，提取蛋白質(zhì)，再采用DCFH-DA活性氧檢測試劑盒測定活性氧(reactive oxygen species，ROS)含量。采用丙二醛酶聯(lián)免疫試劑盒、人晚期氧化蛋白產(chǎn)物檢測試劑盒、人8-OHdG檢測試劑盒分別對(duì)丙二醛(MDA)、晚期氧化蛋白產(chǎn)物(human advanced oxidation protein products，AOPP)、8-OHdG含量進(jìn)行測定，均采用酶聯(lián)免疫吸附測定法。

1.2.4細(xì)胞中基因mRNA表達(dá)量的檢測 復(fù)氧后48 h，棄去培養(yǎng)基并保留細(xì)胞，加入Trizol裂解液后充分裂解，再采用RNA提取試劑盒和cDNA第一鏈合成試劑盒分離細(xì)胞中總RNA并反轉(zhuǎn)錄為cDNA；取cDNA樣本，使用熒光定量PCR試劑盒擴(kuò)增Bcl-2、Bax、Caspase-3、甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)，引物序列為aattggtacc atttggatgc caacaccgat cattgggcgt ttgttgatca attgcacgcc，根據(jù)擴(kuò)增曲線讀取循環(huán)閾值，以GAPDH為內(nèi)參計(jì)算Bcl-2、Bax、Caspase-3的mRNA表達(dá)量。

1.2.5細(xì)胞中蛋白表達(dá)的免疫組化染色 復(fù)氧后48 h，棄去培養(yǎng)基并保留細(xì)胞，4%多聚甲醛固定細(xì)胞，免疫組化染色試劑盒進(jìn)行操作，孵育Bcl-2、Bax、Caspase-3的多克隆抗體過夜后孵育二抗，而后進(jìn)行二氨基聯(lián)苯胺(3，3’-diaminobenzidine，DAB)顯色、蘇木精復(fù)染，顯微鏡下觀察、攝影記錄圖像并測定A值。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS20.0版軟件錄入數(shù)據(jù)并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，3組間計(jì)量資料比較采用方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1細(xì)胞增殖活力 復(fù)氧后12，24，48 h，對(duì)照組細(xì)胞的增殖活力明顯高于H/R組、40 μmol·L-1Res組及80 μmol·L-1Res組，80 μmol·L-1Res組高于40 μmol·L-1Res組和H/R組，40 μmol·L-1Res組高于H/R組，均差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表1。

2.2細(xì)胞中氧化應(yīng)激產(chǎn)物含量 復(fù)氧后48 h對(duì)照組ROS、MDA、AOPP、8-OHdG含量均明顯低于H/R組、40 μmol·L-1Res組及80 μmol·L-1Res組，80 μmol·L-1Res組低于40 μmol·L-1Res組和H/R組，40 μmol·L-1Res組低于H/R組，均差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表2。

表1 4組細(xì)胞增殖活力比較

組別12 h24 h48 h對(duì)照組77.10±1.1085.40±1.2595.11±1.20H/R組55.89±1.11①②③64.50±1.10①②③73.85±1.15①②③Res組 40 μmol·L-167.68±1.12①②77.42±1.18①②82.90±1.10①② 80 μmol·L-172.42±1.08①81.35±1.15①88.88±1.12①

①與對(duì)照組比較，P<0.05；②與80 μmol·L-1Res組比較，P<0.05；③與40 μmol·L-1Res組比較，P<0.05。

①Compared with control group，P<0.05；②Compared with 80 μmol·L-1Res group，P<0.05；③Compared with 40 μmol·L-1Res group，P<0.05.

表2 4組細(xì)胞中氧化應(yīng)激產(chǎn)物含量比較

組別ROS(MFI平均熒光強(qiáng)度)MDA/(μmol·L-1)對(duì)照組0.83±0.113.48±0.52H/R組2.42±0.38①②③10.38±1.65①②③Res組 40 μmol·L-11.79±0.22①②7.65±0.77①② 80 μmol·L-11.20±0.25①5.80±0.85①組別AOPP/(μmol·L-1)8-OHdG/(ng·mL-1)對(duì)照組2.29±0.361.95±0.23H/R組6.52±0.94①②③5.51±0.79①②③Res組 40 μmol·L-15.44±0.52①②4.04±0.55①② 80 μmol·L-13.89±0.41①3.00±0.60①

①與對(duì)照組比較，P<0.05；②與80 μmol·L-1Res組比較，P<0.05；③與40 μmol·L-1Res組比較，P<0.05。

①Compared with control group，P<0.05；②Compared with 80 μmol·L-1Res group，P<0.05；③Compared with 40 μmol·L-1Res group，P<0.05.

2.3細(xì)胞中線粒體途徑凋亡分子表達(dá)量 復(fù)氧后48 h對(duì)照組Bax、Caspase-3、BaxmRNA表達(dá)量、Caspase-3mRNA表達(dá)量均明顯低于H/R組、40 μmol·L-1Res組及80 μmol·L-1Res組，80 μmol·L-1Res組低于40 μmol·L-1Res組和H/R組，40 μmol·L-1Res組低于H/R組，均差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；對(duì)照組Bcl-2、Bcl-2mRNA表達(dá)量均明顯高于H/R組、40 μmol·L-1Res組及80 μmol·L-1Res組，80 μmol·L-1Res組高于40 μmol·L-1Res組和H/R組，40 μmol·L-1Res組高于H/R組，均差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)，見表3，4。

表3 4組細(xì)胞中線粒體途徑凋亡分子表達(dá)量比較

組別Bcl-2BaxCaspase-3對(duì)照組1.00±0.161.00±0.191.00±0.14H/R組0.39±0.06①②③2.32±0.37①②③2.55±0.41①②③Res組 40 μmol·L-10.76±0.10①②1.89±0.21①②2.02±0.29①② 80 μmol·L-10.88±0.12①1.44±0.20①1.65±0.30①

①與對(duì)照組比較，P<0.05；②與80 μmol·L-1Res組比較，P<0.05；③與40 μmol·L-1Res組比較，P<0.05。

①Compared with control group，P<0.05；②Compared with 80 μmol·L-1Res group，P<0.05；③Compared with 40 μmol·L-1Res group，P<0.05.

表4 4組細(xì)胞中線粒體途徑凋亡分子mRNA表達(dá)量比較

組別Bcl-2mRNABaxmRNACaspase-3mRNA對(duì)照組0.418±0.0620.215±0.0420.239±0.039H/R組0.252±0.036①②③0.511±0.083①②③0.475±0.062①②③Res組 40 μmol·L-10.303±0.005①②0.342±0.061①②0.351±0.054①② 80 μmol·L-10.338±0.006①0.288±0.059①0.297±0.048①

①與對(duì)照組比較，P<0.05；②與80 μmol·L-1Res組比較，P<0.05；③與40 μmol·L-1Res組比較，P<0.05。

①Compared with control group，P<0.05；②Compared with 80 μmol·L-1Res group，P<0.05；③Compared with 40 μmol·L-1Res group，P<0.05.

3 討論

已有研究證實(shí)，Res對(duì)心腦血管具有保護(hù)作用，長期攝入Res能夠降低心腦血管疾病發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)[5-6]。缺血-再灌注損傷可嚴(yán)重影響腦梗死治療效果，Res對(duì)神經(jīng)元氧化應(yīng)激損傷具有保護(hù)作用[7]。本研究中，筆者將神經(jīng)元H/R損傷模型作為研究Res抗凋亡和抗氧化作用的工具。為明確H/R過程對(duì)神經(jīng)元的損傷程度，筆者分析了細(xì)胞增殖活力，結(jié)果顯示H/R組細(xì)胞復(fù)氧后12，24，48 h時(shí)增殖活力值均低于對(duì)照組，提示H/R模型細(xì)胞增殖受到顯著抑制。在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步分析Res對(duì)神經(jīng)元H/R損傷的影響可知，40 μmol·L-1和80 μmol·L-1Res組細(xì)胞復(fù)氧后12，24，48 h時(shí)增殖活力值均顯著高于H/R組，且增殖活力值隨著Res濃度升高而提高。這一結(jié)果與文獻(xiàn) [4，7]報(bào)道一致，說明Res能夠減輕H/R所致神經(jīng)元損傷。

氧化應(yīng)激反應(yīng)激活是H/R損傷過程中重要的病理環(huán)節(jié)，處于缺氧狀態(tài)的組織和細(xì)胞獲得血流灌注后會(huì)造成ROS大量產(chǎn)生，進(jìn)而引起細(xì)胞中脂質(zhì)、蛋白質(zhì)、核酸發(fā)生過氧化并生成相應(yīng)的氧化產(chǎn)物MDA、AOPP、8-OHdG[8-10]。筆者對(duì)H/R后細(xì)胞中氧化應(yīng)激產(chǎn)物的分析發(fā)現(xiàn)，H/R組細(xì)胞ROS、MDA、AOPP、8-OHdG含量顯著高于對(duì)照組，提示H/R能激活神經(jīng)元氧化應(yīng)激反應(yīng)，導(dǎo)致ROS生成增加并造成細(xì)胞脂質(zhì)、蛋白質(zhì)、核酸發(fā)生過氧化，進(jìn)而導(dǎo)致神經(jīng)元結(jié)構(gòu)和功能損傷。Res抗氧化作用和氧自由基清除作用得到一致認(rèn)可，筆者對(duì)Res處理后細(xì)胞中氧化應(yīng)激產(chǎn)物的分析證實(shí)，40 μmol·L-1和80 μmol·L-1Res組細(xì)胞中ROS、MDA、AOPP、8-OHdG含量顯著低于H/R組，且隨著Res濃度提高，氧化應(yīng)激反應(yīng)減輕，提示Res能夠抑制神經(jīng)元H/R損傷過程中的氧化應(yīng)激反應(yīng)，減輕氧化應(yīng)激反應(yīng)對(duì)神經(jīng)元的損傷。

Bax和Bcl-2是調(diào)節(jié)線粒體功能以及線粒體膜對(duì)細(xì)胞色素C通透性的重要分子，前者能夠形成同源二聚體并定位于線粒體膜，增加線粒體膜對(duì)細(xì)胞色素C的通透性，進(jìn)入胞質(zhì)的細(xì)胞色素C能夠激活Caspase-3并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡；后者能夠與Bax形成異源二聚體并抑制Bax的促凋亡作用[11-12]。筆者對(duì)神經(jīng)元H/R過程中上述線粒體途徑凋亡分子表達(dá)量的分析發(fā)現(xiàn)，H/R能夠顯著抑制Bcl-2水平，增加Bax、Caspase-3表達(dá)；Res組細(xì)胞中Bcl-2的mRNA表達(dá)量顯著高于H/R組，Bax、Caspase-3的mRNA表達(dá)量顯著低于H/R組，且該效果與Res濃度間存在密切關(guān)聯(lián)，提示Res能夠抑制神經(jīng)元H/R損傷過程中線粒體途徑細(xì)胞凋亡。

綜上所述，Res能夠減輕神經(jīng)元H/R損傷，抑制H/R過程中的細(xì)胞凋亡和氧化應(yīng)激反應(yīng)是Res發(fā)揮神經(jīng)元保護(hù)作用的分子機(jī)制之一。