高通量自動化磁珠提取血凝塊DNA的方法研究

潘亭亭 汪偉偉 吉栩

臨床檢驗(yàn)中血清樣本使用后剩余的血凝塊可以作為重要的樣本資源重新回收、提取DNA進(jìn)行利用，作為生物樣本進(jìn)行保存[1]，或者用來進(jìn)行疾病診斷[2]或基因多態(tài)性和功能研究[3-5]。血凝塊DNA提取的方法通?？梢苑譃閮蓚€(gè)階段：第一階段通常是血凝塊的勻漿或破碎，常見的方法包括使用手動或電動勻漿器、尼龍網(wǎng)擠壓、剪刀剪碎、研磨棒研磨、加入鋼珠攪拌等方式[6-8]，使血凝塊從一整塊分散成為懸濁液或者是盡可能小的小塊；第二個(gè)階段則是將分散后的血凝塊樣本采用不同的方法進(jìn)行DNA提取，通常是各種血液DNA的提取方法或者是試劑盒，包括使用如酚/氯仿、高鹽沉淀、各種商業(yè)化血液提取試劑盒等[6，9-11]。血凝塊的勻漿、破碎可以增加樣本與消化、裂解試劑的接觸面積，有利于DNA釋放。但是文獻(xiàn)所述方法中的手工和勻漿設(shè)備等操作[2，6-7]，需要消耗大量的時(shí)間和人力，難以高通量同時(shí)處理大量樣本，并且需要額外準(zhǔn)備器械、適配的耗材等?；蛘呤鞘褂酶鼜?fù)雜的試劑處理，試劑體積較大不適合常規(guī)自動化提取設(shè)備的要求[6-7]。為了實(shí)現(xiàn)自動化提取血凝塊DNA，本研究采取流程簡化、效率兼顧的思路，通過對適當(dāng)大小的血凝塊調(diào)整蛋白酶K用量、消化處理的溫度和時(shí)間，結(jié)合常規(guī)血液DNA自動化提取使用的磁珠提取方式，建立高通量自動化的血凝塊DNA提取方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 材料和試劑 血凝塊來源于生化檢驗(yàn)后剩余的血凝塊，采集時(shí)間為檢驗(yàn)結(jié)束后1～2天，將血凝塊凍存在-80℃?zhèn)溆?。通用型血?組織DNA磁珠法提取試劑盒購自長春志昂生物科技有限公司，蛋白酶K為試劑盒自帶，濃度為20 mg/mL。提取過程中使用的無水乙醇購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。96孔深孔板購自蘇州海貍生物醫(yī)學(xué)工程有限公司。瓊脂糖購自Biowest。50×TAE緩沖液購自Solarbio DNA Marker購自Takara公司。

1.1.2 儀器和器材 4℃冰箱購自中科美菱，金屬浴、Kingfisher FLEX自動化核酸提取儀、16孔磁力架DynaMagTM-2、臺式離心機(jī)Micro21R、Nanodrop 2000 c微量分光光度計(jì)購自美國Thermo Fisher公司，核酸電泳儀和水平電泳槽JY-SPCT購自北京君意東方電泳設(shè)備有限公司，凝膠成像儀購自英國UVItec公司，電子天平購自德國Sartorius公司。

1.2 方法

1.2.1 血凝塊處理和分割 凍存血凝塊在4℃化凍后使用一次性吸管移去非抗凝采血管中的分離膠，轉(zhuǎn)移血凝塊至1.5 mL離心管，同時(shí)使用手術(shù)刀片將血凝塊分割為約0.1～0.2 g的單個(gè)血凝塊，稱重記錄處理前血凝塊質(zhì)量。在篩選優(yōu)化條件階段，使用6例血凝塊樣本，分成多份血塊后按不同條件進(jìn)行處理。

1.2.2 血凝塊消化裂解 參考常規(guī)血液DNA提取時(shí)蛋白酶K用量，為每200～250 μL血液中加入20 μL蛋白酶K（20 mg/mL）。考慮到非抗凝血的凝固過程，0.1 g血凝塊約來自于原200～250 μL全血，本研究中將每0.1 g血凝塊使用20 μL蛋白酶K定義為1倍消化酶用量。蛋白酶K的用量分別為1倍（1×）和2倍（2×）兩種條件，消化溫度包括4℃、室溫（23±1）℃和37℃。蛋白酶K消化后，加入提取試劑盒中的裂解液65℃加熱裂解10分鐘，10 000 rmp室溫離心2分鐘后吸取上清，轉(zhuǎn)移至新1.5 mL離心管用于后續(xù)手工提取，或轉(zhuǎn)移至96孔深孔板用于自動化提取。剩余的未消化血凝塊稱重，使用（原血塊質(zhì)量-剩余質(zhì)量）/原質(zhì)量×100%=血凝塊的消化裂解率。不同條件下的消耗裂解率和常溫下1倍蛋白酶K用量消化4小時(shí)的效率進(jìn)行比較分析差異。

1.2.3 磁珠法DNA提取 根據(jù)磁珠提取試劑盒流程，在裂解液加入相應(yīng)的磁珠進(jìn)行吸附，再分別用洗滌液BW1和80%的乙醇按步驟進(jìn)行清洗。在優(yōu)化條件階段使用16孔磁力架進(jìn)行手工提取。選擇優(yōu)化條件后，對48個(gè)樣品各兩份，共96份樣品使用核酸提取儀Kingfisher FLEX進(jìn)行自動化提取，參考試劑盒常規(guī)設(shè)置，調(diào)整提取程序?yàn)槿缦虏襟E：裂解10分鐘，磁珠結(jié)合吸附10分鐘，BW1第一次清洗5分鐘，BW1第二次清洗3分鐘，80%乙醇第一次清洗3分鐘，80%乙醇第二次清洗3分鐘，晾干后洗脫10分鐘。最后收集洗脫液轉(zhuǎn)移至干凈離心管中。

1.2.4 DNA質(zhì)量分析 對提取所得的DNA用1%的瓊脂糖電泳，觀察提取所得的DNA的條帶是否完整。用分光光度計(jì)分析濃度和純度。使用Nanodrop 2000 c測定DNA的濃度，以及260 nm和280 nm下的光密度（OD）比值OD260/OD280。

1.2.5 統(tǒng)計(jì)和繪圖 用SPSS 17.0軟件分析統(tǒng)計(jì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，比較同樣血凝塊來源不同處理?xiàng)l件下的消化裂解效率時(shí)，采用配對t檢驗(yàn)分析不同條件下消化裂解率的差異。對48例血凝塊樣本，通過Pearson相關(guān)性分析，分析同一樣品兩份血塊之間提取結(jié)果的相關(guān)性。P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。繪圖使用GraphPad Prism 5.0。

2 結(jié)果

2.1 血凝塊DNA提取條件的優(yōu)化

2.1.1 不同蛋白酶K用量和溫度下血凝塊消化和裂解效率 將6例血凝塊樣本分成不同的血凝塊小份，使每個(gè)小塊大約為0.1～0.2 g，將各份置于不同處理?xiàng)l件下進(jìn)行蛋白酶K消化和DNA裂解液處理，處理前后均對血凝塊進(jìn)行稱重，通過（原血塊質(zhì)量-剩余質(zhì)量）/原質(zhì)量×100%計(jì)算不同酶量、時(shí)間、溫度下的消化裂解效率。處理的條件為：4℃下1×蛋白酶K消化16小時(shí)（4-16 h-1×）、4℃下2×蛋白酶K消化4小時(shí)（4-4 h-2×）、4℃下2×蛋白酶K消化16小時(shí)（4-16 h-2×）；室溫下1×蛋白酶K消化2小時(shí)（RT-2 h-1×）、室溫下1×蛋白酶K消化4小時(shí)（RT-4 h-1×）、室溫下2×蛋白酶K消化4小時(shí)（RT-4 h-2×）；37℃下2×蛋白酶K消化4小時(shí)（37-4 h-2×）。不同條件下的消化裂解率如圖1A所示。將不同處理?xiàng)l件下的消化裂解率進(jìn)行配對T檢驗(yàn)，除4-16 h-2×、RT-4 h-1×、RT-4 h-2×和37-4 h-2×四個(gè)條件下的消化裂解率無差異外，其余條件下，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。如圖1A所示，可見適當(dāng)延長消化時(shí)間（4℃從4小時(shí)延長至16小時(shí)，室溫下從2小時(shí)延長至4小時(shí)）、適當(dāng)增加蛋白酶K用量（4℃下從1×用量增加至2×用量）可以提高消化裂解率，但對于室溫下處理4小時(shí)，增加酶用量效果不顯著。

從提取的DNA單位質(zhì)量血凝塊DNA產(chǎn)量和DNA總產(chǎn)量來看（圖1B），4℃用1×蛋白酶K消化16小時(shí)的單位DNA產(chǎn)出量最高，同時(shí)也有較高的DNA總產(chǎn)出量，而4℃用2×蛋白酶K消化的兩組和室溫下用2×蛋白酶K消化4小時(shí)組雖然單位產(chǎn)量不高，但都有較高的DNA總產(chǎn)出量，這四組總DNA量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。綜合消化裂解率和DNA產(chǎn)量，4℃下進(jìn)行消化和室溫使用2×蛋白酶K消化4小時(shí)的效率較有優(yōu)勢。

2.1.2 處理溫度和時(shí)間對DNA完整性的影響 從DNA電泳的結(jié)果可以看出（圖1C），在4℃下消化血凝塊提取的DNA基本完整，主帶清晰，僅在消化16小時(shí)有個(gè)別樣品出現(xiàn)極為輕微的降解。室溫下，處理2小時(shí)得到的DNA也基本完整，但是處理4小時(shí)就出現(xiàn)了較為明顯的降解帶。在37℃處理時(shí)，樣品出現(xiàn)了嚴(yán)重的降解。同時(shí)未觀察到蛋白酶K濃度對DNA的降解有影響。因此，控制消化的溫度和時(shí)間對獲得完整的DNA有重要影響。

2.2 高通量自動化提取的效果

96份血凝塊總體的平均消化裂解率都在70%以上，OD260/280平均值在1.70以上，基本符合預(yù)期1.7～1.9的參考范圍。抽樣電泳顯示各樣本條帶完整，DNA基本無降解（圖片未出示）。DNA的單位產(chǎn)量（每0.1 g血凝塊產(chǎn)出DNA量）均值在4 μg左右，總量的均值在5 μg上下，均在預(yù)期范圍內(nèi)（表1）。對兩份樣品對應(yīng)的參數(shù)進(jìn)行相關(guān)性分析，除OD260/280之外消化裂解率、單位產(chǎn)量和總量均有相關(guān)性。兩份樣本消化裂解率相關(guān)性P值為0.004，相關(guān)系數(shù)0.409，而單位產(chǎn)量兩份樣本的相關(guān)系數(shù)為0.912，兩份樣本總量的相關(guān)系數(shù)為0.881，P值均小于0.001，說明對于同一例樣本進(jìn)行兩次提取的結(jié)果非常相近，提取方法的可重復(fù)性好。

3 討論

圖1 不同處理?xiàng)l件下血凝塊提取效果比較

表1 48例血凝塊樣本分兩份提取效果的比較

本研究選擇一種通用且簡化的方式來實(shí)現(xiàn)高通量自動化提取血凝塊DNA。雖然未對血凝塊大小進(jìn)行分析，但根據(jù)以往經(jīng)驗(yàn)，較大的血凝塊不利于處理，而且需要消耗更多的蛋白酶K、DNA裂解液等試劑。同時(shí)對血凝塊中殘留的血液進(jìn)行提取，得到的DNA含量低，不能滿足常規(guī)實(shí)驗(yàn)需求（結(jié)果未出示）。參考常規(guī)全血提取DNA需要的血液量，我們將單份提取的血凝塊大小限制為約0.1～0.2 g。從消化裂解的效率看（圖1A），2倍酶量相比1倍酶量對于較短處理時(shí)間的消化裂解率有提升，但在較長的處理時(shí)間下效率提升幅度較小。從DNA產(chǎn)出量來看（圖1B），較長的消化時(shí)間有利于DNA的釋放，較高的消化酶用量并不直接和更高的DNA產(chǎn)率相關(guān)，可能是相對過量的酶對于效率的提升作用有限，或是受DNA提取效率影響。在王琦等[10]的研究中發(fā)現(xiàn)，對于250 μL全血使用濃度為18.8～19.0 mg/mL的蛋白酶K效果最佳，因此可以根據(jù)實(shí)際工作和成本控制的需要，選擇1～2倍之間的蛋白酶K進(jìn)行消化。

從DNA的完整性來看，消化處理時(shí)的溫度非常重要，37℃會造成DNA的嚴(yán)重降解，室溫處理的時(shí)間也需要嚴(yán)格控制。其他研究中報(bào)道對牛血液、牛乳進(jìn)行DNA提取時(shí)，4℃提取所得DNA質(zhì)量優(yōu)于室溫提取[12-13]。結(jié)合本研究，4℃是血凝塊提取的優(yōu)選條件，如果選擇室溫下進(jìn)行消化，建議控制時(shí)間在2小時(shí)左右。

根據(jù)文獻(xiàn)中方法，勻漿器勻漿需要使用一次性耗材，否則容易導(dǎo)致樣品的交叉污染[8]，增加了額外的耗材成本。在Mardan-Nik使用的方法中，在樣品中放入金屬的攪拌器材，并且使用了較大體積500 μL的提取試劑[7]，和常規(guī)的反應(yīng)體系存在差異，這些參數(shù)和自動化設(shè)備的要求相沖突。本研究中蛋白酶K消化的操作屬于極為普遍的操作，不需要特殊試劑和耗材，適用性好。消化時(shí)間也可以根據(jù)需要進(jìn)行調(diào)整，即使需要4℃過夜消化，也不會額外增加對人力操作的需求。

以常見的Qiagen的DNA Blood Mini試劑盒為例，單次提取可從200 μL新鮮全血中得到4～12 μg的DNA，本研究從相當(dāng)于200 μL左右全血的0.1 g血凝塊中，平均可以獲得的DNA約4 μg，提取效率和常規(guī)方法可以相比較。自動化提取的結(jié)果可以看到有一些樣本的提取效率不高，這可能和樣本初始的狀態(tài)、個(gè)體的差異以及血凝塊的不均一有關(guān)。但絕大部分單份樣品可以得到0.5 μg以上的DNA，可滿足常規(guī)單次全基因組測序的要求。值得注意的是有一些樣品OD260/280稍微偏低，可能由于蛋白等雜質(zhì)造成，因此目前的自動化提取程序還可以進(jìn)一步優(yōu)化以提高DNA的純度。