缺血性腦卒中小鼠腎功能損害的相關(guān)研究

李文奎，蘇悅，劉嘯軒，烏日吉木斯，袁荃，閻濤，2

（1.天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院神經(jīng)病學(xué)研究所，天津300052；2.天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，天津300052）

研究表明，腦卒中不僅會(huì)損害神經(jīng)系統(tǒng)本身，而且還會(huì)對(duì)心臟、腸道等多種器官的功能造成損害[1-4]。臨床研究發(fā)現(xiàn)，腎功能損害是腦卒中住院患者中常見(jiàn)的并發(fā)癥[5]。但是，目前對(duì)于腦卒中后腎功能損害發(fā)生率差異也很大，腦卒中患者人群中的腎功能改變研究甚少，一些研究是在不同的人種以及不同的腦卒中類型中進(jìn)行的[6]。無(wú)論是在臨床還是在基礎(chǔ)研究中，腦卒中與腎功能損害的關(guān)系仍不清楚。在本研究中，筆者觀察小鼠缺血性腦卒中腎功能改變，為將來(lái)進(jìn)一步理論研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 成年雄性C57BL/6 小鼠，20～25 g，8～12 周齡；購(gòu)買于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物[許可證號(hào)：SCXK（京）2019-0008，批號(hào)：1103221911011874]全部飼養(yǎng)于天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院神經(jīng)病學(xué)研究所的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，飼養(yǎng)環(huán)境為SPF 級(jí)專業(yè)鼠房。采用簡(jiǎn)單隨機(jī)抽樣，將動(dòng)物分為對(duì)照組、腦梗死3 d 組、腦梗死28 d 組，每組8 只小鼠。小鼠在適應(yīng)環(huán)境1 周后進(jìn)行造模處理，在腦梗死3 d 后或者腦梗死28 d 后將小鼠處死。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 缺血性腦卒中模型 本研究采用光化學(xué)法誘導(dǎo)局灶性大腦皮層缺血性腦卒中模型（photothrombotic models of ischemic stroke），可以造成持續(xù)的局灶性缺血病變，死亡率更低。主要建立方法：將預(yù)先配置好玫瑰紅染料注射到小鼠的腹腔中，經(jīng)過(guò)腹腔吸收進(jìn)入血液循環(huán)，然后暴露小鼠顱骨，用綠光光源照射特定的區(qū)域20 min，局部大腦皮層血液中的玫瑰紅在綠光照射后，發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，造成特定區(qū)域血管的阻塞，模擬缺血性腦卒中[7]。缺血性腦卒中模型構(gòu)建結(jié)束以后，對(duì)缺血性腦卒中后的小鼠進(jìn)行神經(jīng)功能的評(píng)分[4]，把評(píng)分≥3 分的小鼠，納入實(shí)驗(yàn)組；對(duì)于無(wú)癥狀、評(píng)分＜3 分的小鼠或者術(shù)后1 d 內(nèi)死亡的小鼠排除實(shí)驗(yàn)組。本次實(shí)驗(yàn)中，每組造模10 只小鼠，實(shí)驗(yàn)過(guò)程中每組死亡2 只，最終每組8 只小鼠納入實(shí)驗(yàn)研究。

1.2.2 小鼠標(biāo)本的收集 采用代謝籠搜集小鼠造模前和造模后第3、7、14、28 天的尿液，搜集期間，小鼠在代謝籠內(nèi)飲食和活動(dòng)自由，分別提供12 h 的光照和12 h 的黑夜，保證其正常的睡眠節(jié)律。搜集到的尿液經(jīng)過(guò)離心后取上清，在-80℃的條件下進(jìn)行冷凍保存?zhèn)溆?。采用眼球摘除法搜集缺血性腦卒中3 d 和28 d 的小鼠血液，然后離心取上清，在-80℃的條件下進(jìn)行冷凍保存?zhèn)溆谩⑷毖阅X卒中3 d 和28 d 的小鼠進(jìn)行麻醉后處死，摘取腎臟后，將腎臟制成石蠟標(biāo)本，備用。

1.2.3 腎臟代謝指標(biāo)的檢測(cè) 使用小鼠尿白蛋白（urine albumin，UA）ELISA 試劑盒（ab108792，Abcam，Cambridge，UK）、小鼠尿β2-微球蛋白（β2-microglob ulin，β2-M）ELISA 試劑盒（KE1592，ImmunoWay）和肌酐比色測(cè)定試劑盒（500701，Cayman）測(cè)量UA、尿β2-M 和尿肌酐（urine creatinine，UCr）濃度。分別使用肌酐比色測(cè)定試劑盒（700460，Cayman）和Quanti ChromTM尿素測(cè)定試劑盒（DIUR-500，BioAssay System，USA）測(cè)量血肌酐（plasma creatinine，PCr）和血尿素氮（blood urea nitrogen，BUN）濃度。所有實(shí)驗(yàn)過(guò)程完全按照實(shí)驗(yàn)說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。

1.2.4 腎臟病理染色 為了評(píng)估缺血性腦卒中后小鼠的腎臟損害程度，在缺血性腦卒中后3 d 和28 d 使用蘇木素和伊紅（HE，hematoxylin-eosin）對(duì)腎組織進(jìn)行染色，進(jìn)行腎臟病理評(píng)分。為了確定缺血性腦卒中對(duì)腎小球基底膜的影響，在缺血性腦卒中后3 d 和28 d 采用高碘酸-席夫試劑（PAS，periodic acid-schiff）染色，增厚的基底膜被染成紫色的面積就會(huì)增大。為了確定缺血性腦卒中后的腎纖維化程度，在缺血性腦卒中后第3 天和第28 天采用天狼猩紅（PSR，picosirius red）染色，腎臟組織中的纖維增生部分會(huì)被染成紅色。

1.2.5 腎臟組織學(xué)和病理學(xué)評(píng)估

1.2.5.1 腎臟病理學(xué)評(píng)分 使用半定量病理評(píng)分系統(tǒng)對(duì)腎臟進(jìn)行腎組織病理評(píng)分（renal pathology score,RPS），簡(jiǎn)而言之，腎組織病理?yè)p害包括腎小管刷狀緣膜缺失、腎小管的擴(kuò)張、腎組織細(xì)胞腫脹、腎臟管腔碎片、核固縮和核缺失，這可以通過(guò)分級(jí)系統(tǒng)進(jìn)行評(píng)分（0、1、2、3）：0 分：在高倍鏡視野中無(wú)可見(jiàn)病灶；1 分：在高倍鏡視野中損傷范圍＜1/3；2 分：在高倍鏡視野中，損傷范圍＜2/3；3 分：在高倍鏡視野中，損傷范圍＞2/3 小管中的病理?yè)p傷。每個(gè)腎臟計(jì)數(shù)20 個(gè)視野（400 倍）。每個(gè)腎臟的總得分是來(lái)自20 個(gè)視野的所有得分的總和。

1.2.5.2 腎小球基底膜厚度（thickness of glomerular basement membrane，TGBM）測(cè)量 腎組織切片用PAS 染色以評(píng)估基底膜的增厚和腎小球系膜的擴(kuò)張。總共計(jì)數(shù)30 個(gè)腎小球，使用光學(xué)顯微鏡（Olympus, Tokyo，Japan）對(duì)腎組織進(jìn)行400 倍的放大[8]，所有實(shí)驗(yàn)均采用盲法進(jìn)行計(jì)算和評(píng)估。

1.2.5.3 腎組織纖維化程度（renal fibrosis rate,RFR）測(cè)評(píng) 腎臟切片用PSR 染色，以計(jì)算膠原蛋白在腎組織中的沉積。在高倍鏡下，采用隨機(jī)原則，選擇5 個(gè)視野進(jìn)行計(jì)算，使用高倍顯微鏡將其放大200 倍；計(jì)算每個(gè)腎組織切片[9]。每個(gè)區(qū)域中的陽(yáng)性面積百分比都要進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。因此，每個(gè)腎臟的得分就是5 個(gè)視野的陽(yáng)性面積的百分比的平均值。所有實(shí)驗(yàn)均采用盲法進(jìn)行計(jì)算和評(píng)估。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 本次實(shí)驗(yàn)的所有數(shù)據(jù)都采用Graphpad Prism 8.0 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，以mean±SEM 表示實(shí)驗(yàn)結(jié)果。兩獨(dú)立樣本之間的比較采用非配對(duì)t檢驗(yàn)。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 缺血性腦卒中對(duì)BUN 和PCr 的影響 腦梗死后第3 天，與對(duì)照組相比，BUN 顯著升高（t=6.885，P＜0.05），PCr 差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；腦梗死后第28 天，與第3 天相比，BUN 明顯下降（t=4.815，P＜0.05），PCr 差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見(jiàn)圖1。

圖1 缺血性腦卒中對(duì)血肌酐和血尿素氮的影響Fig 1 Effects of ischemic stroke onplasma creatinine and blood urea nitrogen

2.2 缺血性腦卒中對(duì)尿β2-M、UA 和UCr 的影響 腦梗死后第3 天，與對(duì)照組相比，尿β2-M 和UA 顯著升高（t=3.804，P＜0.05；t=2.638，P＜0.05）。腦梗死后第7 天，與第3 天相比，尿β2-M 和UA 明顯下降（t=2.521，P＜0.05；t=2.521，P＜0.05）。腦梗死后UCr始終無(wú)明顯變化（P＞0.05），見(jiàn)圖2。

2.3 缺血性腦卒中對(duì)RPS、TGBM 和RFR 的影響 腦梗死后第3 天，與對(duì)照組相比，RPS、TGBM 和RFR 明顯升高（t=2.181，P＜0.05；t=4.262，P＜0.05；t=7.366，P＜0.05）。腦梗死后第28 天，與第3 天相比，RPS 和RFR 明顯升高（t=2.791，P＜0.05；t=6.187，P＜0.05）；梗死后第28 天，與對(duì)照組相比，RPS、TGBM 和RFR明顯升高（t=4.065，P＜0.05；t=4.005，P＜0.05；t=6,178,P＜0.05），見(jiàn)圖3。

圖2 缺血性腦卒中對(duì)尿β2-M、UA 和UCr 的影響Fig 2 Effects of ischemic stroke on urine β2-microglobulin,urine albumin and urine creatinine

圖3 缺血性腦卒中對(duì)RPS、TGBM 和RFR 的影響Fig 3 Effects of ischemic stroke on renal pathology score,thickness of the glomerular basement membrane and renal fibrosis

3 討論

臨床研究表明，腎功能損害在腦卒中患者中很常見(jiàn)[5,10-11]，并且腎臟疾病本身也是腦卒中的危險(xiǎn)因素[12]。研究表明，和普通人相比，缺血性腦卒中患者腎功能損害的發(fā)病率明顯升高[10]。但是，關(guān)于缺血性腦卒中后腎功能損害的發(fā)生率差異很大[13]。目前沒(méi)有足夠的證據(jù)表明腎功能損害與腦缺血性腦卒中之間存在因果關(guān)系。因此，研究缺血性腦卒中后腎臟功能損害具有重要意義。

在本次實(shí)驗(yàn)中，筆者觀察了小鼠缺血性腦卒中后腎功能的變化，明確了缺血性腦卒中可以引起腎功能損害和腎組織病理?yè)p害。缺血性腦卒中會(huì)誘發(fā)急性腎臟功能損害，主要表現(xiàn)為缺血性腦卒中后BUN、UA、尿β2-M 一過(guò)性升高。同時(shí)，缺血性腦卒中也可以導(dǎo)致腎組織病理?yè)p害，在腦梗死后第3 天和第28 天，筆者發(fā)現(xiàn)其RPS、TGBM、RFR 明顯升高?？偠灾毖阅X卒中可以導(dǎo)致急性腎功能損害，同時(shí)可以導(dǎo)致急性和慢性腎臟病理?yè)p害，腦腎之間存在著必然聯(lián)系。

白蛋白尿是公認(rèn)的腎臟疾病現(xiàn)象，也是影響腎功能衰竭進(jìn)展和過(guò)程的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。β2-M 的分子量相對(duì)較小，血液中的β2-M 主要經(jīng)過(guò)腎小球?yàn)V過(guò)，其中濾出的99.9%的β2-M 在腎臟近曲小管中被重新分解吸收，因此尿液中β2-M 的濃度極低[14]。尿β2-M 是早期檢測(cè)急性腎臟損害（acute kidney injury，AKI）的標(biāo)志物[15]。在一項(xiàng)前瞻性研究中，對(duì)252 例急診科的兒童進(jìn)行尿β2-M 檢測(cè)，表明尿β2-M 在預(yù)測(cè)AKI 方面具有良好的準(zhǔn)確性[16]。同時(shí)，尿β2-M 是腎小管和腎小球損害的重要標(biāo)志物[17]。此外，尿白蛋白也是腎小管和腎小球損害的重要標(biāo)志物[18]。腎小球陰離子電荷濾過(guò)屏障受到損害時(shí)，將會(huì)出現(xiàn)選擇性白蛋白尿。其中尿液中出現(xiàn)白蛋白，通常意味著腎小球基底膜的結(jié)構(gòu)嚴(yán)重受損[18]。筆者在缺血性腦卒中后第3 天發(fā)現(xiàn)，尿β2-M 和UA 明顯升高，說(shuō)明在缺血性腦卒中后，發(fā)生了急性腎臟功能損害，主要表現(xiàn)為腎小管和腎小球的損害。這與筆者在缺血性腦卒中后發(fā)現(xiàn)腎組織中腎小管擴(kuò)張和腎小球基底膜增厚的現(xiàn)象是一致的。

PCr、UCr 和BUN 在腎臟疾病的診斷中具有重要意義[19-21]。本研究顯示，缺血性腦卒中可以引起B(yǎng)UN 升高，但是對(duì)于PCr 和UCr 并無(wú)影響。有研究指出，在腎臟損害50%的情況下，PCr 濃度有不升高的情況，具體原因不詳[22]。筆者推測(cè)可能是因?yàn)橛胁糠帜I功能的替代作用，使得肌酐清除并沒(méi)有受到明顯影響。

缺血性腦卒中引起腦實(shí)質(zhì)的損害，進(jìn)而影響了中樞神經(jīng)系統(tǒng)，中樞神經(jīng)系統(tǒng)的內(nèi)側(cè)前額葉皮層、下丘腦的損害，都可以對(duì)腎臟功能產(chǎn)生影響[23]。缺血性腦卒中引起交感神經(jīng)興奮，釋放大量?jī)翰璺影啡胙鹉I動(dòng)脈收縮，減少腎小球血流量，影響腎小球?yàn)V過(guò)率和加劇腎臟組織纖維化。此外，交感神經(jīng)激活引起下丘腦視上核和室旁核釋放抗利尿激素，通過(guò)V1 和V2 受體對(duì)腎臟功能產(chǎn)生影響。缺血性腦卒中可以對(duì)下丘腦-垂體-腎上腺軸產(chǎn)生影響，進(jìn)而調(diào)節(jié)糖皮質(zhì)激素的釋放，影響腎小球和腎小管的功能[23]。而且，缺血性腦卒中可以激活腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)，血管緊張素Ⅱ通過(guò)誘導(dǎo)白細(xì)胞介素6 的產(chǎn)生，在腎組織纖維化中起著重要作用[24-25]。有研究發(fā)現(xiàn)，缺血性腦卒中引起大腦自主調(diào)節(jié)功能下降，進(jìn)而引起腎小球?yàn)V過(guò)率的下降[26]。此外，缺血性腦卒中激活炎癥和免疫反應(yīng)，增加C 反應(yīng)蛋白、白細(xì)胞介素-6、腫瘤壞死因子-α 等炎癥因子進(jìn)入組織和血液，進(jìn)一步加劇腎臟損害，因此全身性炎癥和免疫反應(yīng)可能在促進(jìn)缺血性腦卒中后腎功能損害中起重要作用。此外，細(xì)胞外囊泡也參與了缺血性腦卒中后的免疫反應(yīng)調(diào)節(jié)過(guò)程，與腎臟的纖維化等病理?yè)p害有關(guān)[27-28]。筆者發(fā)現(xiàn)，在缺血性腦卒中后，腎組織纖維化程度明顯加重。其中缺血性腦卒中第28 天比第3 天的腎組織纖維化程度增高。除此之外，腎組織病理?yè)p害評(píng)分也呈進(jìn)行性增加趨勢(shì)?？偟膩?lái)說(shuō)，缺血性腦卒中后導(dǎo)致急性腎組織病理?yè)p害和慢性腎臟病理?yè)p害。有研究指出，腎臟結(jié)構(gòu)受損后，會(huì)激活腎臟修復(fù)系統(tǒng)，其中腎臟修復(fù)系統(tǒng)的失控，最終導(dǎo)致間質(zhì)纖維化和組織破壞，形成惡性循環(huán)，造成腎組織病理?yè)p害進(jìn)行性加重。這與筆者的實(shí)驗(yàn)結(jié)論是一致的。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，缺血性腦卒中導(dǎo)致急性腎功能損害和急慢性腎組織病理?yè)p害。缺血性腦卒中主要通過(guò)對(duì)腎組織結(jié)構(gòu)的破壞，影響腎臟功能，主要造成腎小管的擴(kuò)張、腎組織纖維化、腎小球基底膜的增厚，引起B(yǎng)UN、UA、尿β2-M 的升高。本研究將為進(jìn)一步研究缺血性腦卒中后腎功能損害的機(jī)制奠定基礎(chǔ)。