張麗,方步武
(天津醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院藥理學(xué)系,天津300070)
肝纖維化是慢性肝損傷引起的一種病理性傷口愈合反應(yīng),主要表現(xiàn)為細胞外基質(zhì)(extracellular matrix, ECM)的過度沉積[1]。在肝纖維化發(fā)展過程中肝星狀細胞(hepatic stellate cells, HSCs)是ECM的主要來源細胞[2]。核因子NF-E2 相關(guān)因子2(NFE2-related factor 2,Nrf2)是重要的轉(zhuǎn)錄因子,Nrf2 可促進抗氧化基因如血紅素加氧酶-1(heme oxygenase-1, HO-1)的轉(zhuǎn)錄,進而保護組織和細胞抵抗氧化應(yīng)激[3-4]。本研究采用的虎杖苷由于具有抗氧化及保肝作用,可用于一些肝臟疾病的治療[5-6]。但關(guān)于虎杖苷對肝星狀細胞活化的影響及作用機制尚未深入研究。本研究通過體外培養(yǎng)HSC-T6 細胞,用不同濃度虎杖苷處理,探討虎杖苷對肝星狀細胞活化的作用及相關(guān)機制。
1.1 實驗材料
1.1.1 細胞 本實驗所用細胞是大鼠肝星狀細胞HSC-T6,由北京地壇醫(yī)院提供。
1.1.2 主要試劑 虎杖苷(Polydatin)購于大連美侖生物公司,Methyl thiazolyl tetrazolium(MTT)購于北京鼎國昌盛生物技術(shù)公司,羥脯氨酸測定試劑盒和LDH 活力測定試劑盒購于南京建成生物工程研究所,β-actin 抗體、α-tubulin 抗體和BCA 蛋白定量試劑盒購于碧云天生物技術(shù)研究所,CollagenⅠ抗體購于北京博奧森生物技術(shù)公司,α-SMA 抗體購于Cell Signaling Technology(CST),HO-1 抗體購于Abconal,Nrf2 抗體購于Pepro Tech 公司。
1.1.3 主要儀器 680 酶標(biāo)儀(美國BIO-RAD 公司),CO2恒溫培養(yǎng)箱(美國NAPCO series5400),DL-CJ-2NDI 潔凈工作臺(北京東聯(lián)哈爾儀器制造公司),WD-9405A 型脫色搖床(北京六一儀器廠),湘儀L420 低速自動平衡離心機(湖南湘儀離心機儀器有限公司),垂直電泳槽(美國BIO-RAD 公司)。
1.2 實驗方法
1.2.1 細胞培養(yǎng)及分組處理 細胞培養(yǎng)在含有10%FBS(Gibco,USA),50 U/mL 青霉素/鏈霉素的DMEM(Gibco,USA)中,置于37℃,5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中。實驗分4 組:(1)對照組。(2)不同濃度虎杖苷(Polydatin)給藥組:125、250、500 μmol/L。給藥時間為48 h。
1.2.2 細胞活力測定 使用MTT 法測定虎杖苷對肝星狀細胞增殖的影響。將HSC-T6 細胞根據(jù)實驗分組以5×104個/mL 的密度接種于96 孔板中。培養(yǎng)24 h 后用不含血清的DMEM 饑餓12 h,然后用不同濃度的虎杖苷處理細胞。處理48h 后每孔加入20μL 0.5%MTT,繼續(xù)孵育4 h,吸出廢液,每孔加入200 μL DMSO 溶解產(chǎn)生的藍紫色結(jié)晶甲臢(formazan),震蕩10 min,490 nm 處測定每孔的吸光度值。細胞活力計算公式:細胞活力(%)=(實驗組吸光度值/對照組吸光度值)×100%。
1.2.3 LDH 活力測定 根據(jù)實驗分組處理細胞后收集細胞培養(yǎng)上清液。比色法測定細胞培養(yǎng)液中LDH的活性,取20 μL 細胞上清液,按照LDH 活力測定試劑盒說明書進行操作,波長450 nm 酶標(biāo)儀測定吸光度值。LDH 活性(U/L)=[(測定OD 值-對照OD 值)/(標(biāo)準OD 值-空白OD 值)]×1 000×標(biāo)準品濃度(0.2 μmol/mL)。
1.2.4 羥脯氨酸(Hyp)含量測定 根據(jù)實驗分組處理細胞后收集細胞培養(yǎng)上清液。酶消化法測定細胞培養(yǎng)液中Hyp 的含量,取500 μL 細胞上清液,根據(jù)Hyp 測定試劑盒說明書進行操作,波長550 nm 處,1 cm 光徑,雙蒸水調(diào)零,測定各管吸光度。羥脯氨酸含量(μg/mL)=[(測定OD 值-空白OD 值)/(標(biāo)準OD 值-空白OD 值)]×標(biāo)準品濃度(5 μg/mL)。
1.2.5 蛋白免疫印跡法檢測Ⅰ型膠原(collagenⅠ)、α-平滑肌肌動蛋白(α-SMA)、Nrf2 和HO-1 蛋白的表達 按照實驗分組,將HSC-T6 細胞以5×104個/mL 密度接種于6 孔板中,培養(yǎng)24 h 后用不含血清的DMEM 饑餓12 h,然后用不同濃度虎杖苷處理細胞48 h。藥物處理后,棄去培養(yǎng)液,每孔加入適量含有1%PMSF 的RIPA 裂解液來提取蛋白并用BCA 蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度。蛋白變性后,取等量蛋白SDS-PAGE 電泳分離后轉(zhuǎn)移到PVDF 膜上,使用5%脫脂牛奶阻斷非特異性蛋白結(jié)合,4℃下孵育一抗(collagenⅠ1:500、α-SMA 1:1 000、Nrf2 1:1 000、HO-1 1:1 000)過夜。次日,TBST 洗膜3 次,每次7 min,HRP 結(jié)合二抗(1:1 000)室溫孵育2 h,TBST 洗膜3 次后,ECL 化學(xué)發(fā)光試劑盒顯色,采用Image J 軟件對蛋白條帶的光密度值進行分析。
1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 17.0 統(tǒng)計分析軟件,所有符合正態(tài)分布的計量資料以(±s 表示。多組間比較采用單因素方差分析,若方差齊則采用LSD檢驗,若方差不齊采用Dunnett T3檢驗。以P<0.05 認為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
2.1 虎杖苷對細胞增殖的影響 如圖1 所示,與對照組比較,不同濃度的虎杖苷(125、250、500 μmol/L)作用于HSC-T6 細胞48 h后,對HSC-T6 細胞增殖有明顯的抑制作用(F=252.01,P<0.001);與虎杖苷125 μmol/L 組比較,虎杖苷250、500 μmol/L組中細胞活力顯著降低(F=252.01,P<0.001);與虎杖苷250 μmol/L 組比較,虎杖苷500 μmol/L 組中細胞活力顯著降低(F=252.01,P<0.001)。
2.2 虎杖苷對LDH 活力的影響 與對照組(80.34±13.61)U/L 比較,虎杖苷125、250、500 μmol/L 組中LDH 活性無明顯變化[(84.83±8.71)、(82.91±12.26)、(79.91±10.28)U/L],如圖2 所示,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(F=0.246,P>0.05)。
2.3 虎杖苷對Hyp 含量的影響 如圖3 所示,與對照組[(2.91±0.18)μg/mL]比較,虎杖苷125、250、500μmol/L組中Hyp 含量顯著降低[(2.61±0.13)、(2.29±0.13)、(2.05±0.19)μg/mL;F=16.50,P<0.05];與虎杖苷125 μmol/L 組比較,虎杖苷250、500 μmol/L 組Hyp 含量顯著減少(F=16.50,P<0.05),且隨著濃度的增高,抑制作用越明顯,呈一定的劑量依賴性。
圖1 虎杖苷對細胞增殖的影響(±SD,n=6)Fig 1 Effects of Polydatin on the proliferation of cell(±SD,n=6)
圖2 虎杖苷對LDH 活力的影響(±SD,n=6)Fig 2 Effects of Polydatin on the activity of LDH(±SD,n=6)
圖3 虎杖苷對Hyp 含量的影響(±SD,n=9)Fig 3 Effects of Polydatin on the content of Hyp(±SD,n=9)
2.4 虎杖苷對α-SMA和CollagenⅠ蛋白表達的影響 如圖4 所示,與對照組比較,虎杖苷125、250、500 μmol/L組中α-SMA 和CollagenⅠ蛋白表達水平顯著降低(F=19.89,P<0.05;F=182.91,P<0.001);與虎杖苷125 μmol/L 組比較,虎杖苷250、500 μmol/L 組中α-SMA 和CollagenⅠ蛋白表達水平顯著降低(F=19.89,P<0.05;F=182.91,P<0.001),隨著劑量增大,抑制作用越明顯,表現(xiàn)出一定的劑量依賴性。
圖4 虎杖苷對α-SMA 和CollagenⅠ蛋白表達的影響(±SD,n=3)Fig 4 Effects of Polydatin on the protein expression of α-SMA and CollagenⅠ(±SD,n=3)
2.5 虎杖苷對Nrf2、HO-1 蛋白表達的影響 如圖5 所示,與對照組比較,虎杖苷125、250、500 μmol/L組中Nrf2 蛋白表達水平顯著升高(F=23.70,P<0.05),虎杖苷250、500 μmol/L 組中HO-1 蛋白表達水平顯著增加(F=12.40,P<0.01);與虎杖苷125 μmol/L 組比較,虎杖苷250、500 μmol/L 組中Nrf2和HO-1 蛋白表達水平顯著升高(F=23.70,P<0.05;F=12.40,P<0.05),隨著劑量增大,上調(diào)作用越明顯,表現(xiàn)出一定的劑量依賴性。
肝纖維化是慢性肝損傷引起的一種病理性傷口愈合反應(yīng),隨著病程的發(fā)展將導(dǎo)致肝硬化,最終導(dǎo)致肝衰竭或肝癌[7]。在肝纖維化階段逆轉(zhuǎn)其進展是治療慢性肝病,避免肝功能衰竭的有效策略。
圖5 虎杖苷對Nrf2 和HO-1 蛋白表達的影響(±SD,n=3)Fig 5 Effects of Polydatin on the protein expression of Nrf2 andHO-1(±SD,n=3)
HSCs 的活化是導(dǎo)致肝纖維化的重要因素[8]?;罨腍SCs 表達α-SMA,合成成纖維細胞因子并促進膠原(如Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原和Ⅳ型膠原)的產(chǎn)生從而加速肝纖維化的進程。當(dāng)在體外培養(yǎng)時,HSCs 會發(fā)生自發(fā)激活[9]。本研究發(fā)現(xiàn)虎杖苷處理HSC-T6細胞能抑制細胞增殖,降低細胞培養(yǎng)液中Hyp 的含量并下調(diào)α-SMA 及CollagenⅠ蛋白的表達。其中Hyp 是一種幾乎只存在于膠原蛋白中的氨基酸,被作為衡量肝纖維化的指標(biāo)[10]。由此可得,虎杖苷可以抑制HSC-T6 細胞的活化及膠原的產(chǎn)生,在體外具有抑制肝纖維發(fā)生的作用。
Nrf2/HO-1 可以減輕肝臟炎癥、減緩肝纖維化的發(fā)展[11-12]。誘導(dǎo)HO-1 的表達可以抑制HSCs 增殖,降低CollagenⅠ的產(chǎn)生,減輕肝臟氧化應(yīng)激水平,進而抑制肝纖維化的發(fā)生、發(fā)展[13]。本實驗采用的虎杖苷是從虎杖根中提取的有效成分,由于具有抗氧化作用在一些肝臟疾病的防治中具有重要作用[14-17]。本研究使用不同濃度的虎杖苷處理HSC-T6 細胞,結(jié)果表明,隨著虎杖苷濃度增加,Nrf2、HO-1 蛋白表達逐漸增加。
本研究發(fā)現(xiàn),虎杖苷通過抑制肝星狀細胞活化及膠原的產(chǎn)生,發(fā)揮抑制肝纖維化發(fā)生的作用,其作用機制可能與上調(diào)Nrf2/HO-1 信號通路有關(guān),這為虎杖苷在肝纖維化治療中應(yīng)用提供了新的思路。