貓須草提取物體外抗腫瘤活性部位研究

鄭英換 潘顯茂 李蘭婷

摘要 [目的]研究貓須草不同提取物對多種腫瘤細胞生長抑制的影響，篩選出貓須草的抗腫瘤活性部位。[方法]采用MTT法體外抗腫瘤活性試驗研究貓須草提取物分別對人回盲腸癌細胞（HCT-8）、人肝癌細胞（BEL-7402）和人非小細胞肺癌細胞（A549）的生長抑制作用。[結果]貓須草乙醇提取物分別經(jīng)石油醚萃取、乙酸乙酯萃取后對3種腫瘤細胞均具有良好的抑制活性，而正丁醇萃取物和萃取后的水層無抗腫瘤活性作用。[結論]該研究為后續(xù)開展的抗癌活性化學成分單體的提純和體內抗腫瘤藥理試驗研究提供理論依據(jù)。

關鍵詞 貓須草;腎茶;體外抗腫瘤試驗;DMSO腫瘤細胞毒性

Abstract [Objective] The research aimed to study the different extracts of Clerodendranthus spicatus on growth inhibition of various tumor cells，and to screen out the antitumor active sites. [Method] MTT colourometry was used to determine the inhibitory effect of the different extracts of Clerodendranthus spicatus on hct8 ，bel7402 and A549 human tumor cells in vitro. [Result]The petroleum ether extract and ethyl acetate extract of spicatus had inhibitory activity on three kinds of human tumor cells， but the nbutanol extract and the water extract had no antitumor activity.[Conclusion] This research provides a theoretical basis for the subsequent purification of anticancer active chemical constituent monomers and in vivo antitumor pharmacological test research.

Key words Clerodendranthus spicatus;Kidney tea;Antitumor activity in vitro;Tumor cytotoxicity of DMSO

貓須草（Clerodendranthus spicatus（Thunb.）C.Y.Wu）為唇形科腎茶屬植物，又名腎茶、貓須公，主要分布在我國海南、廣西、廣東、云南等熱帶亞熱帶地區(qū)，是一種多年生草本植物，為民間傳統(tǒng)中草藥[1-2]。貓須草味甘淡、性涼、微苦，具有清熱祛濕、排石利水的功效，民間主要用于急慢性腎炎、膀胱炎、尿路結石等多種泌尿系統(tǒng)疾病[3-4]?，F(xiàn)代研究表明，貓須草含有黃酮類、二萜類、甾體類、水溶性酚酸類等多種化學成分，并具有抗炎解熱鎮(zhèn)痛、抗菌、抗氧化、利尿、保肝保腎、降糖降血脂及抗腫瘤等多項藥理作用[5-7]。其中貓須草的體外抗腫瘤活性作用研究相對較少，筆者主要通過研究貓須草醇提取物用水分散經(jīng)石油醚萃取、乙酸乙酯萃取、正丁醇萃取和萃取后水層4種萃取物分別對人非小細胞肺癌細胞A549、人回盲腸癌細胞HCT-8、人肝癌細胞BEL-7402的生長抑制作用，初步篩選出貓須草抗癌細胞活性部位，為后續(xù)開展的抗癌活性化學成分單體的提純和體內抗腫瘤藥理試驗研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 藥材與細胞株。

貓須草購自海南省萬寧市，由鄭希龍博士鑒定;人非小細胞肺癌細胞A549、人回盲腸癌細胞HCT-8、人肝癌細胞BEL-7402均購自中國科學院細胞庫。

1.1.2 主要儀器。

Hei-VAP advantage減壓旋轉蒸發(fā)儀（德國海道爾夫）;YRE-2020A智能數(shù)顯恒溫水浴鍋（杭州億捷科技）;DM IL LED 相差倒置顯微鏡（LEICA德國公司）;BPN-170RWP二氧化碳培養(yǎng)箱（上海一恒）;F-50酶標儀（TECAN奧地利公司）;Countess Ⅱ 全自動細胞計數(shù)儀（Thermo Scientific）;LMQ.C-80EP立式蒸汽壓力滅菌器（山東新華儀器裝備有限公司）;BSA124S-CW分析天平（賽多利斯）。

1.1.3 試劑。

DMEM高糖培養(yǎng)液、RPIM 1640培養(yǎng)液、小牛血清、胰酶消化液、PBS、青霉素-鏈霉素溶液，均購自GBIGO公司;MTT，SIGMA公司;95%乙醇、石油醚（I）、正丁醇、乙酸乙酯，均為分析純，來自西隴科學;DMSO，分析純，來自廣東光華科技。

1.2 試驗方法

1.2.1 貓須草處理方法。

取干燥貓須草全草適量粉碎，采用95%乙醇靜置提取7 d，藥液減壓濃縮至無醇味浸膏，加適量蒸餾水混懸后依次用石油醚（I）、乙酸乙酯、正丁醇萃取，并分別濃縮萃取液，回收得貓須草石油醚萃取物（MP1）、乙酸乙酯萃取物（MP2）、正丁醇萃取物（MP3）和萃取后水層（MP4）4種組分浸膏。分別稱取上述浸膏適量，用二甲基亞砜助溶，過濾除菌，低溫保存?zhèn)溆谩ＥR用前用完全培養(yǎng)基梯度稀釋至相應濃度。

1.2.2 體外抗腫瘤活性試驗。

取對數(shù)生長期細胞用0.25%胰酶消化計數(shù)，分別采用含10%小牛血清細胞完全培養(yǎng)液（A549用高糖DMEM完全培養(yǎng)液，HCT-8和BEL-7402用RPIM 1640完全培養(yǎng)液）制成5.5×104個/mL的細胞懸液，并接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔180 μL，置37 ℃，5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)過夜后，分別加入不同濃度的貓須草萃取物溶液20 μL。4種貓須草萃取物均設5個劑量組，每組6個復孔，同時設有空白對照組（加20 μL培養(yǎng)液）和調零組（200 μL培養(yǎng)液，無細胞），置37 ℃，5%CO2培養(yǎng)箱分別培養(yǎng)24、48 h后，棄液，PBS洗板1次，加入100 μL無血清培養(yǎng)基和20 μL 5 mg/mL MTT溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄液，每孔加150 μL DMSO避光振蕩（37 ℃）混勻10 min。酶標儀492 nm波長處測定各孔吸光度（OD），各孔調零后取平均值計算細胞生長的抑制率，抑制率=（1-樣品組OD值/陰性對照組OD值）×100%[8-9]。

正式試驗前為排除DMSO作為溶劑對各個腫瘤細胞的毒性影響，采用以上試驗步驟，設置不同體積分數(shù)的DMSO溶液分別測定其對BEL-7402、A549和HCT-8細胞的毒性作用，從而選擇合適的藥物配比濃度，減小DMSO溶劑對試驗結果的影響。計算不同體積分數(shù)DMSO對細胞生長的抑制率。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

試驗數(shù)據(jù)用±S表示，采用SPSS 20.0對試驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學處理，DMSO數(shù)據(jù)采用單因素方差分析進行組間比較;計算貓須草各萃取物的細胞半數(shù)抑制濃度（IC50）。

2 結果與分析

2.1 DMSO作為溶劑對腫瘤細胞的影響

從3種腫瘤細胞分別經(jīng)不同體積分數(shù)的DMSO處理24、48 h后的細胞生長抑制率（表1）可以看出，與DMSO體積分數(shù)為0的空白對照組比較，當DMSO體積分數(shù)≤0.6%時，對HCT-8腫瘤細胞毒性作用差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05），影響弱;當DMSO體積分數(shù)≤0.5%時，對A549腫瘤細胞毒性作用差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05），影響弱;當DMSO體積分數(shù)≤0.4%時，對BEL7402腫瘤細胞毒性作用差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05），影響弱。

2.2 貓須草萃取物對腫瘤細胞的影響

MTT比色法檢測結果表明，貓須草石油醚萃取物與乙酸乙酯萃取物對3種腫瘤細胞均呈現(xiàn)不同程度的抗癌活性;正丁醇萃取物與萃取后的水層均無腫瘤細胞抑制作用。由表2～4可見，貓須草石油醚萃取物對HCT-8腫瘤細胞作用最強，并隨著濃度的升高而增強;對BEL-7402和A549的抑制作用雖較弱，但呈現(xiàn)良好的濃度依賴性。貓須草乙酸乙酯萃取物對3種細胞的抑制作用強度相當，對A549、HCT-8細胞的抑制作用呈現(xiàn)良好的濃度依賴性，但對BEL-7402細胞的抑制強度高低濃度時有反復，量效關系較差。

2.3 貓須草萃取物對腫瘤細胞的IC50值

比較貓須草石油醚萃取物和乙酸乙酯萃取物對3種腫瘤細胞的半數(shù)抑制濃度IC50（表5）可知，2種萃取物對HCT-8的作用最顯著，作用48 h時IC50分別為109.63和194.61 μg/mL;石油醚萃取物對A549細胞的抑制強度與作用時間長短關系最密切，當作用24 h時IC50>600.00 μg/mL，當作用時間延長至48 h時IC50為273.01 μg/mL。乙酸乙酯萃取物對BEL-7402和A549細胞作用強度相當，48 h時IC50分別為283.05和238.61 μg/mL。

3 討論與結論

DMSO作為萬能溶劑是許多脂溶性藥物進行細胞試驗中常見的溶媒，但是在保證藥物溶解度的情況下也要考慮DMSO 對細胞的毒性作用，避免其對研究結果產生不良影響。不同的細胞對DMSO的耐受能力不同，且與生產廠家有一定關系[10]。筆者通過對作為溶媒的DMSO進行預試驗，選擇合適的體積分數(shù)范圍進行正式試驗可減少DMSO對試驗結果的影響，有效提高試驗結果的準確性。

貓須草作為民間常用中草藥被廣泛應用，多年來研究者們對其研究不斷，因其具有良好的保腎利尿作用，已被開發(fā)成多種保健茶飲[1]。目前，貓須草研究多限于化學成分和藥效學的研究，但對其活性成分的提純和藥物作用機理的深入研究相對較少。筆者通過此次抗腫瘤活性成分研究發(fā)現(xiàn)，貓須草經(jīng)乙醇提取、石油醚萃取、乙酸乙酯萃取后對HCT-8、BEL-7402、A549腫瘤細胞均具有良好的活性作用，為后續(xù)開展的活性化學成分的研究和體內抗腫瘤藥理學研究提供新的研究方向。

參考文獻

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