蠟樣芽孢桿菌0-9對(duì)小麥根腐病菌的抑菌作用研究

黃秋斌 韓興旺 劉鳳英

摘要 采用平板對(duì)峙法，研究0-9菌株對(duì)引起小麥根腐病的致病菌尖孢鐮刀菌的抑菌作用，抑菌率為50%，該菌株發(fā)酵代謝產(chǎn)物對(duì)小麥根腐病菌的抑菌作用達(dá)83%;0-9菌株代謝產(chǎn)物處理尖孢鐮刀菌的分生孢子后，其萌發(fā)率降低61.2%;發(fā)酵代謝物質(zhì)在高溫和長時(shí)間紫外線照射下仍具有約80%的抑菌活性，且代謝產(chǎn)物的有效抑菌活性可以長達(dá)14 d。同時(shí)采用平板對(duì)峙法研究0-9菌株對(duì)5株植物病原真菌的抑菌作用，結(jié)果表明0-9菌株也具有廣泛的抑菌效果。

關(guān)鍵詞 蠟樣芽孢桿菌0-9 ;代謝產(chǎn)物;小麥尖孢鐮刀菌;抑菌活性

Abstract The bacteriostatic effect of strain 0-9 on Fusarium oxysporum，which caused wheat root rot，was studied by plate confrontation method.The bacteriostatic rate of Fusarium oxysporum was 50%.The bacteriostatic effect of fermentation metabolites on Fusarium oxysporum was 83%.After the conidia of Fusarium oxysporum was treated with metabolites of strain 0-9，the germination rate decreased by 61.2%，and the fermentation metabolites still had about 80% bacteriostatic activity under high temperature and long time ultraviolet irradiation，and the effective bacteriostatic activity of metabolites could be as long as 14 days.At the same time，the bacteriostatic effect of strain 0-9 on 5 strains of plant pathogenic fungi in laboratory was studied by plate confrontation method.The results showed that strain 0-9 also had a wide range of bacteriostatic effects.

Key words Bacillus cereus 0-9;Metabibolites;Fusarium oxysporum;Activity

小麥根腐病是比較普遍的一種小麥病害，在東北、華北和西北地區(qū)發(fā)生比較嚴(yán)重，能夠嚴(yán)重影響小麥的產(chǎn)量和品質(zhì)，是由多種病原菌入侵小麥根部所造成，主要致病菌以麥根腐平臍蠕孢菌（Bipolaris sorokiniana）和尖孢鐮刀菌屬（Fusarium oxysporum）為主。目前常用的防治手段有物理方法、種子化學(xué)藥物包衣及生物方法[1-2]。物理防治手段主要采用農(nóng)作物輪作的方法，防治效果有限，受環(huán)境條件影響較大，而化學(xué)防治手段則是通過化學(xué)藥物三唑類殺菌劑與小麥種子拌種來防治，但長時(shí)間使用殺菌劑會(huì)造成環(huán)境污染，誘導(dǎo)病菌抗性增強(qiáng)，破壞生態(tài)平衡[3]。生物防治方法則是利用環(huán)境微生物和提取物來進(jìn)行防治，具有有效、安全和持久的特點(diǎn)，近年來備受關(guān)注。目前常用的生物防治微生物主要有內(nèi)生細(xì)菌、內(nèi)生真菌、放線菌等多種菌群[4-6]，其中芽孢桿菌屬抗逆能力強(qiáng)，繁殖速度快，對(duì)生長要求簡單，可以產(chǎn)生細(xì)菌素、酶類、活性物質(zhì)、脂肽等抗菌物質(zhì)，在自然界中廣泛存在于植物內(nèi)，是一種理想的生防微生物，但目前對(duì)小麥根腐病防治的微生物研究很少[7-10]。蠟樣芽孢桿菌0-9（Bacillus cereus）是從小麥根部中分離得到的內(nèi)生細(xì)菌，具有很好的抑菌作用[11]，筆者研究0-9菌株對(duì)小麥根腐病菌尖孢鐮刀菌活性的影響及其發(fā)酵代謝物質(zhì)的穩(wěn)定性，為探索該菌株的抑菌機(jī)制以及開發(fā)應(yīng)用生防制劑提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

蠟樣芽孢桿菌0-9由河南大學(xué)資源分離與微生物實(shí)驗(yàn)室分離保存，保存于-80 ℃。小麥禾谷絲核菌（Rhizoctonia zeae）、綠豆立枯絲核菌（ Rhizoctonia solani）、玉米彎孢霉葉斑病（Curvularia lunata Boedijn）、西瓜炭疽病菌（Colleetotrichum lagenarium）、尖鐮孢菌黃瓜?；停‵usarium oxysporum f.sp cucumerinum）、小麥尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum）6種真菌均由河南大學(xué)資源遺傳與分離實(shí)驗(yàn)室提供，保存于4 ℃。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 菌株的活化。

0-9菌株活化：取甘油管保藏菌，在固體LB培養(yǎng)基（1%蛋白胨，0.5%酵母粉，1% NaCl，121 ℃滅菌20 min）上劃線活化，挑取新鮮單菌落接入100 mL液體LB培養(yǎng)基中，30 ℃、200 r/min條件下振蕩培養(yǎng)18 h，4 ℃條件下保存?zhèn)溆谩?/p>

植物病原真菌的活化：取病原真菌試管斜面，用接種針挑取真菌菌絲放置于PDA培養(yǎng)基（馬鈴薯200 g，葡萄糖10 g，瓊脂粉15 g，1 000 mL ddH2O，115 ℃滅菌20 min）上，于25 ℃培養(yǎng)箱繁殖培養(yǎng)7 d，4 ℃條件下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 蠟樣芽孢桿菌0-9菌株對(duì)植物病原菌菌絲生長的測定。

將活化后的0-9單菌落轉(zhuǎn)接于100 mL LB液體培養(yǎng)基內(nèi)，30 ℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)18 h，后12 000 r/min離心收集菌體，并用無菌水懸浮菌體，4 ℃保存?zhèn)溆?在PDA培養(yǎng)基平板上距中心位置接種直徑為8 mm的病原菌菌餅，后在平板周圍距離該菌餅2.5 cm的位置加入5 μL 0-9細(xì)菌菌懸液，以5 μL 無菌水作為對(duì)照，后放置于25 ℃培養(yǎng)，培養(yǎng)6 d后觀察結(jié)果，采用十字交叉法測量病原菌直徑，對(duì)照病原菌直徑記為A，處理病原菌直徑記為B，計(jì)算抑菌率： 抑菌率=[（A - B）/ A]×100%

1.2.3 蠟樣芽孢桿菌 0-9菌株代謝產(chǎn)物對(duì)小麥尖孢鐮刀菌活性測定。將活化后的0-9單菌落轉(zhuǎn)接于100 mL PDA液體培養(yǎng)基中，30 ℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)24 h，后在12 000 r/min離心收集上清，用0.22 μm的濾頭過濾除菌，配制不同濃度（10-1倍、10-2倍）的混合液，后與冷卻至45 ℃的100 mL固體PDA培養(yǎng)基混合倒平板，待冷卻后在平板中心接種直徑8 mm 的病原菌菌餅，以PDA培養(yǎng)基為對(duì)照，放置于25 ℃培養(yǎng)，6 d后觀察小麥尖孢鐮刀菌在平板上的生長情況。

1.2.4 蠟樣芽孢桿菌0-9代謝產(chǎn)物對(duì)孢子萌發(fā)的測定。

小麥尖孢鐮刀菌在PDA平板培養(yǎng)14 d后，加入10 mL無菌水洗脫孢子，用8層紗布過濾除去菌絲碎片，3 000 r/min慢速離心，清洗2次后獲得孢子懸液，然后將不同梯度的代謝產(chǎn)物和孢子懸液等比例混合，放到凹玻片中，置于25 ℃培養(yǎng)箱中黑暗條件下培養(yǎng)24 h，40×顯微鏡下觀察并統(tǒng)計(jì)孢子萌發(fā)數(shù)，計(jì)算孢子的萌發(fā)率。

1.2.5 蠟樣芽孢桿菌0-9代謝產(chǎn)物穩(wěn)定性的測定。

（1）熱穩(wěn)定性。將過濾后代謝產(chǎn)物分別在40、60、80、100和121 ℃處理10 min，后與100 mL固體PDA培養(yǎng)基混合倒平板，待冷卻后在平板中心接種直徑8 mm 的病原菌菌餅，以PDA培養(yǎng)基作為對(duì)照，放置于25 ℃培養(yǎng)，培養(yǎng)6 d后采用十字交叉法測量病原真菌直徑，計(jì)算抑菌率。

（2）紫外線穩(wěn)定性。取過濾后0-9菌株代謝產(chǎn)物放置在超凈臺(tái)內(nèi)紫外線（功率21 W，距離70 cm）照射處理，處理時(shí)間為0、10、20、30和60 min，處理完畢后與100 mL固體PDA培養(yǎng)基混合倒平板，待冷卻后在平板中心接種直徑8 mm的病原菌菌餅，以PDA培養(yǎng)基作為對(duì)照，放置于25 ℃培養(yǎng)，培養(yǎng)6 d后采用十字交叉法測量病原真菌直徑，計(jì)算抑菌率。

（3）代謝產(chǎn)物的有效時(shí)間。把過濾后0-9菌株代謝產(chǎn)物在25 ℃條件下分別放置1、3、7和14 d，后與100 mL固體PDA培養(yǎng)基混合倒平板，待冷卻后在平板中心接種直徑8 mm 的病原菌菌餅，以PDA培養(yǎng)基作為對(duì)照，放置于25 ℃培養(yǎng)，培養(yǎng)6 d后采用十字交叉法測量病原真菌直徑，計(jì)算抑菌率。

2 結(jié)果與分析

2.1 蠟樣芽孢桿菌0-9對(duì)小麥尖孢鐮刀菌的抑菌作用

從圖1可以看出，采用平板對(duì)峙法培養(yǎng)后，蠟樣芽孢桿菌0-9菌株對(duì)小麥尖孢鐮刀菌具有很好的抑制作用，其抑制率可達(dá)50%，差異性比較明顯。

2.2 0-9菌株代謝產(chǎn)物對(duì)小麥尖孢鐮刀菌活性的影響

從圖2可以看出，平板經(jīng)過25 ℃培養(yǎng)5 d后，0-9菌株代謝產(chǎn)物對(duì)小麥尖孢鐮刀菌的活性具有很高的抑制率，可達(dá)85%;稀釋100倍后對(duì)病原真菌小麥尖孢鐮刀菌仍具有一定的抑制性，可達(dá)62%，說明0-9代謝產(chǎn)物對(duì)小麥尖孢鐮刀具有很強(qiáng)的抑制活性。

2.3 0-9菌株代謝產(chǎn)物對(duì)分生孢子萌發(fā)的影響

經(jīng)過代謝產(chǎn)物處理后的孢子萌發(fā)率為22.5%，而不經(jīng)過處理的孢子萌發(fā)率為83.7%，且100倍、10倍稀釋的代謝產(chǎn)物處理后孢子萌發(fā)率分別為45.2%、36.7%，比對(duì)照組低，說明0-9菌株產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物能夠影響分生孢子的萌發(fā)。

2.4 0-9菌株代謝產(chǎn)物的穩(wěn)定性

2.4.1 溫度的耐受性。從圖3可以看出，0-9菌株代謝產(chǎn)物經(jīng)過不同溫度處理后還表現(xiàn)出對(duì)小麥根腐病一定的抑菌活性，其中30和40 ℃處理后抑菌活性無明顯變化，抑制率達(dá)84%;100和121 ℃高溫處理后抑菌活性有所下降，但下降趨勢不明顯，抑制率達(dá)76%，說明該代謝產(chǎn)物對(duì)小麥根腐病的抑菌活性受溫度的影響很小，對(duì)溫度具有很好的耐受性。

2.4.2 紫外線的耐受性。通過對(duì)0-9菌株代謝產(chǎn)物進(jìn)行不同時(shí)間的紫外線處理后測定抑菌活性，結(jié)果見圖4。從圖4可以看出，沒有紫外線處理的，其抑菌活性為83%，經(jīng)過紫外線處理10、20、30、60 min后，抑制率可達(dá)81%，抑菌活性無明顯變化，說明該代謝產(chǎn)物對(duì)紫外線不敏感，其對(duì)小麥根腐病的抑制性比較穩(wěn)定。

2.4.3 有效時(shí)間的穩(wěn)定性。0-9菌株代謝產(chǎn)物放置4 ℃冰箱1、3、7、14 d后測定抑菌活性，結(jié)果見圖5。從圖5可以看出，代謝產(chǎn)物放置一段時(shí)間后，抑菌活性和對(duì)照組相比無明顯變化，抑制率仍可達(dá)80%～82%，說明0-9菌株代謝物質(zhì)不隨著放置時(shí)間的變化而變化，對(duì)小麥根腐病的抑菌活性穩(wěn)定性較好。

2.5 0-9菌株代謝產(chǎn)物對(duì)5種植物病原真菌的抑制作用

從圖6可以看出，蠟樣芽孢桿菌0-9對(duì)5種真菌均有一定的抑制作用，其中對(duì)西瓜炭疽病菌抑制較為明顯，抑制率為60%;其次是對(duì)尖孢鐮刀菌黃瓜轉(zhuǎn)化型和玉米彎孢霉葉斑病2種真菌的抑制，其抑制率分別為26.7%和25.0%;對(duì)小麥禾谷絲核菌和綠豆立枯絲核菌的抑制效果較低，其抑制率分別為16.7%和18.0%。

3 結(jié)論與討論

目前，生防菌的研究還停留在實(shí)驗(yàn)室階段，在實(shí)驗(yàn)室條件下具有很好的抑菌活性，而在大田條件下，受到溫度、紫外線、酸堿度等環(huán)境變化，生防菌及其代謝產(chǎn)物則不能很好地適應(yīng)環(huán)境而發(fā)揮抑菌作用[12-13]，該研究中蠟樣芽孢桿菌0-9（Bacillus cereus）是從小麥根部分離得到的內(nèi)生細(xì)菌，通過平板對(duì)峙試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)對(duì)引起小麥根腐病的病原真菌小麥尖孢鐮刀菌均有一定的抑制作用，其抑制率可達(dá)50%，為此研究0-9菌株及其代謝產(chǎn)物對(duì)小麥根腐病的抑制作用機(jī)制。通過對(duì)0-9代謝產(chǎn)物進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)其對(duì)小麥尖孢鐮刀菌抑制作用較為明顯，可達(dá)83%，說明0-9菌株能夠產(chǎn)生較強(qiáng)的次生代謝產(chǎn)物，且該代謝產(chǎn)物能夠抑制分生孢子的萌發(fā)，使菌絲局部膨大，不規(guī)則，生長緩慢異常。此外，發(fā)酵產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物能夠保持很強(qiáng)的穩(wěn)定性，在高溫、紫外線等條件下也能夠發(fā)揮對(duì)病原真菌的抑制作用，且0-9菌株對(duì)小麥禾谷絲核菌、綠豆立枯絲核菌、玉米彎孢霉葉斑病、西瓜炭疽病菌、尖鐮孢菌黃瓜?；?種真菌具有廣泛的抑制作用，為該菌株應(yīng)用于大田環(huán)境提供理論基礎(chǔ)。目前0-9菌株代謝產(chǎn)物中發(fā)揮抑制作用的具體物質(zhì)是哪種還不是很明確，下一步工作需要研究該物質(zhì)的具體成分以及提取條件的優(yōu)化，從而為該菌株作為生防制劑防治小麥根腐病的應(yīng)用開發(fā)提供條件。

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