10株分離自田菁根瘤內(nèi)菌株的回接試驗(yàn)及結(jié)瘤驗(yàn)證

董鑫

摘要 選擇10株分離自田菁根瘤內(nèi)的菌株進(jìn)行結(jié)瘤試驗(yàn)，他們分別屬于貪銅菌屬（Cupriavidus）、拜納蒙納斯屬（Balneimonas）、克羅諾桿菌屬（Cronobacter）、泛菌屬（Pantoea）及腸桿菌屬（Enterobacter），應(yīng)用全細(xì)胞水溶性蛋白電泳（SDS-PAGE）技術(shù)對(duì)結(jié)瘤后再次分離的菌株進(jìn)行驗(yàn)證。結(jié)瘤試驗(yàn)結(jié)果表明，隸屬于貪銅菌屬（Cupriavidus）和拜納蒙納斯（Balneimonas）的7株菌SWF65120、SWF65122、SWF66465、SWF66521、SWF67557、SWF67558、SWF67572都能夠與宿主田菁植物結(jié)瘤，并應(yīng)用SDS-PAGE分子標(biāo)記對(duì)結(jié)瘤菌株與接種菌株進(jìn)行了比較，蛋白圖譜顯示完全一致。

關(guān)鍵詞 根瘤菌;內(nèi)生菌;結(jié)瘤;全細(xì)胞水溶性蛋白電泳

中圖分類號(hào) S182文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A文章編號(hào) 0517-6611（2020）13-0157-02

Abstract 10 strains isolated from the root nodule of Sesbania spp. were selected for reinnoculation nodulation test，these strains belonged to 6 genera，i.e. Cupriavidus， Balneimonas ，Cronobacter， Pantoea and Enterobacter. The whole cell protein SDSPAGE method analysis demonstrated that 7 original strains （SWF65120，SWF65122，SWF66465，SWF66521，SWF67557，SWF67558，SWF67572）had an identical protein pattern with their reisolated strains at higher similarity， it indicated that these strains could establish symbiotic nodulation connection with their original Sesbania spp. hosts.

Key words Rhizobia;Endophyte;Nodulation;SDSPAGE

根瘤菌（rhizobia）是一類廣泛遍布于土壤中的革蘭氏陰性細(xì)菌。它能夠侵染豆科植物根部與之共生，并幫助豆科植物吸收空氣中的氮，轉(zhuǎn)化為植物能夠利用的氮素營(yíng)養(yǎng)。然而，在研究根瘤菌的同時(shí)，還在根瘤內(nèi)分離出除根瘤菌外的其他非共生細(xì)菌，如Agrobacterium tumefaciens，Pantoea agglomerans等[1]，這類細(xì)菌不是污染所致，他們的特點(diǎn)是不具有共生基因和結(jié)瘤基因，不能夠使豆科植物根部結(jié)瘤，屬于根瘤內(nèi)生菌。內(nèi)生菌是指長(zhǎng)期生活在植物體內(nèi)，對(duì)植物本身不引起侵害或產(chǎn)生積極作用的一類細(xì)菌或真菌的總稱。內(nèi)生菌具有廣闊的研究開發(fā)前景，在研制植物菌劑、生物醫(yī)藥及生物農(nóng)藥等領(lǐng)域得到應(yīng)用[2]。但目前國(guó)內(nèi)對(duì)內(nèi)生菌研究成果較少。

SDS-PAGE是最常用的蛋白表達(dá)分析技術(shù)。其原理是基于蛋白質(zhì)分子量的大小，將不同大小的蛋白質(zhì)分離，該技術(shù)常用于檢測(cè)蛋白質(zhì)亞基的分子量、鑒定純度及鑒定菌株，其特點(diǎn)是操作簡(jiǎn)單，重復(fù)性好，分辨率高[3]。筆者采用全細(xì)胞蛋白電泳技術(shù)SDS-PAGE對(duì)10株來(lái)自田菁根瘤內(nèi)的菌株和回接后重新分離得到的結(jié)瘤菌株進(jìn)行比對(duì)，以驗(yàn)證分離自田菁的根瘤菌與田菁的共生結(jié)瘤關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 種子處理方法

結(jié)瘤試驗(yàn)所用的種子為田菁屬植物的種子。用98% 濃硫酸[4]浸泡1 h，無(wú)菌水漂洗5～10次，置于濕潤(rùn)的裝有無(wú)菌濾紙的培養(yǎng)皿中28 ℃萌發(fā)，待幼芽萌發(fā)至0.5 mm后，轉(zhuǎn)入4 ℃冰箱冷藏保存。

1.2 結(jié)瘤試驗(yàn)

將玻璃試管（規(guī)格為300 mm×350 mm）中放置濾紙折疊成能夠支撐幼苗的斜面，并于試管內(nèi)裝入120 mL無(wú)氮培養(yǎng)液，封口后121 ℃滅菌30 min，冷卻后室溫放置。將萌發(fā)好的種苗在菌液中浸泡1 h以上，將其放置于濾紙斜面上，每株接種菌株設(shè)3個(gè)重復(fù)，同時(shí)設(shè)5個(gè)不接種菌液的試管作為對(duì)照[5]。置于恒溫箱中，28 ℃培養(yǎng)，其間觀察結(jié)瘤情況，培養(yǎng)45 d后停止培養(yǎng)并收集根瘤。

1.3 分離和純化

選取飽滿健壯的根瘤進(jìn)行分離，將根瘤置于0.2%汞中表面消毒3 min，無(wú)菌水沖洗3～5次。用無(wú)菌竹簽將根瘤壓破使根瘤內(nèi)菌液流出，挑取一環(huán)菌液于YMA培養(yǎng)基上劃線[6]，并用封口膜將培養(yǎng)皿口封住，28 ℃倒置培養(yǎng)至長(zhǎng)出菌落。待培養(yǎng)基上長(zhǎng)出菌落后標(biāo)記，并分別挑取少許菌體進(jìn)行革蘭氏染色、鏡檢。蘸取一環(huán)菌落放入經(jīng)滅菌處理的裝有小玻璃珠和無(wú)菌水試管中，振蕩3 s后，蘸取菌液于 YMA平板上劃線，28 ℃倒置培養(yǎng)，重復(fù)上述純化操作1～2次。

1.4 菌體的培養(yǎng)和收集

將純化后的供試菌接入TY斜面試管中28 ℃培養(yǎng)。用 pH 7.0的 TrisHCl緩沖液離心洗滌菌體3～4次，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 樣品的制備

樣品制備采用煮沸法，將制備的樣品等比例與2×樣品緩沖液混合，沸水浴變性10 min，然后置于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6 制膠SDS-聚丙烯酰胺凝膠配比見(jiàn)表1。

1.7 注膠與上樣

注膠前，用洗潔精仔細(xì)清洗玻璃板，蒸餾水反復(fù)沖洗干凈，然后豎立晾干。將清洗干凈的玻璃板兩端對(duì)齊后，用夾子加緊，避免漏膠，然后垂直放置。注膠時(shí)，用吸管或槍頭將膠液沿玻璃板緩緩注入，避免產(chǎn)生氣泡。注膠完成后，將梳子水平插入膠中，凝結(jié)后，兩端豎直將梳子拔起。然后將玻璃板垂直放入電泳中，加入電泳液后，使用微量進(jìn)樣器將樣品注入齒隙中。

1.8 染色

采用靈敏度高的銀染色法。電泳結(jié)束后，將分離膠浸泡于固定液中6 h，使蛋白質(zhì)沉淀。取出凝膠放入浸泡液中，搖床上平緩搖動(dòng)，然后凝膠多次反復(fù)水洗，以去除SDS。再將凝膠放入硝酸銀染色溶液中，搖床上平緩搖動(dòng)染色。然后用去離子水沖洗凝膠。將凝膠放入顯色液中平緩搖動(dòng)，顯色后，立即放入終止液中[7]。

1.9 結(jié)果處理 所有電泳圖譜在掃描儀上掃描后以圖片保存，用Quantity One軟件對(duì)電泳條帶進(jìn)行判讀。

2 結(jié)果與分析

2.1 結(jié)瘤試驗(yàn)結(jié)果

各菌株的結(jié)瘤情況見(jiàn)表2。接種18 d后，部分田菁根部已經(jīng)形成根瘤，至接種30 d后，除 SWF66517、 SWF67634和 SWF67639未結(jié)瘤外，其余7株接種菌株均與田菁植物結(jié)瘤，結(jié)瘤數(shù)量為3～8個(gè)/株，對(duì)照組全部沒(méi)有結(jié)瘤。部分根瘤情況見(jiàn)圖1。

2.2 結(jié)瘤菌株的SDS-PAGE驗(yàn)證

從結(jié)瘤試驗(yàn)所結(jié)根瘤中分離獲得7株菌株，與各自的接種菌株一起進(jìn)行 SDS-PAGE全細(xì)胞蛋白電泳分析，發(fā)現(xiàn) SWF65120、 SWF65122、 SWF66465、 SWF66521、 SWF67557、 SWF67558及 SWF67572接種菌株的蛋白圖譜與其對(duì)應(yīng)的結(jié)瘤菌株圖譜相同（圖2）。

3 結(jié)論與討論

結(jié)瘤試驗(yàn)結(jié)果表明，SWF66517、SWF67634和SWF67639這3株分別為腸桿菌屬（Enterobacter）、泛菌屬（Pantoea）和克羅諾桿菌屬（Cronobacter）沒(méi)有結(jié)瘤，這并非操作過(guò)程中菌株染污所致，而是因?yàn)樗麄兪歉鰞?nèi)的內(nèi)生細(xì)菌。因此，應(yīng)進(jìn)一步將這些分離自根瘤內(nèi)但單獨(dú)不能侵染根瘤的內(nèi)生菌與根瘤菌混合回接，以研究他們進(jìn)入根瘤內(nèi)的途徑和在根瘤內(nèi)與根瘤菌的共處模式，對(duì)根瘤內(nèi)微生態(tài)的研究具有重要意義。

從結(jié)瘤試驗(yàn)所結(jié)根瘤中重新分離獲得7株結(jié)瘤菌株，應(yīng)用全細(xì)胞水溶性蛋白電泳技術(shù)（SDS-PAGE）將回接菌株和結(jié)瘤菌株進(jìn)行對(duì)比分析，結(jié)果表明，SWF65120、SWF65122、SWF66465、SWF66521、SWF67557、SWF67558、SWF67572這7株接種菌株的圖譜與結(jié)瘤菌株相同，表明此7株菌株確系與植物田菁存在共生關(guān)系。而他們分別為貪銅菌屬（Cupriavidus）和拜納蒙納斯屬（Balneimonas）。在以往的報(bào)道中，Chen等[8-9]研究證實(shí)了貪銅菌屬（Cupriavidus）能夠與含羞草有效結(jié)瘤，但拜納蒙納斯屬（Balneimonas）具有結(jié)瘤能力尚未見(jiàn)報(bào)道。因此，需要對(duì)其做平均核苷酸一致性[10]（average nucleotide identity）比較分析，以進(jìn)一步確認(rèn)其系統(tǒng)發(fā)育地位。

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