外泌體相關(guān)RNA結(jié)合蛋白基因通過參與先天免疫對肝細(xì)胞癌發(fā)展的可能性影響研究

黃小程，黃雙平，董夢婷，陳 淼，闞 寵，盧東軍，唐玉蓮，倪安妮，李根亮

(右江民族醫(yī)學(xué)院,廣西 百色 533000)

肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是一種高死亡率的原發(fā)性肝癌，是全世界癌癥相關(guān)死亡率的第三大常見原因。多種RNA結(jié)合蛋白表達(dá)異?；蚬δ墚惓Ｅc腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[1-2]。RNA結(jié)合蛋白是一類能夠決定細(xì)胞分化、活動(dòng)力和生長等過程的調(diào)節(jié)因子，可參與RNA的剪接、多聚腺苷化、序列的編輯、RNA 轉(zhuǎn)運(yùn)、維持 RNA 的穩(wěn)定及參與其降解、細(xì)胞內(nèi)定位和翻譯調(diào)節(jié)等[3]，可通過多種方式影響腫瘤的發(fā)生發(fā)展[4-5]。外泌體內(nèi)含有多種功能分子，廣泛參與各種生理和病理過程，包括腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程[6]。RNA結(jié)合蛋白也可能存在于外泌體中，但其是否參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程還有待深入研究。腫瘤的發(fā)生發(fā)展必然伴隨著機(jī)體對病變細(xì)胞的免疫清除，尤其先天免疫過程[7-8]。但外泌體相關(guān)RNA結(jié)合蛋白是否參與腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中的先天免疫及如何參與也尚不清楚。

因此，本研究通過建立肝癌小鼠模型，分離癌變后的瘤體組織及健康肝組織,通過RNA-seq和生物信息學(xué)手段分析HCC瘤體組織中外泌體相關(guān)RNA結(jié)合蛋白相關(guān)基因的表達(dá)情況，分析其是否參與以及如何參與HCC發(fā)生發(fā)展過程中的先天免疫過程。研究結(jié)果可能為深入理解HCC的發(fā)生發(fā)展機(jī)制及診斷治療HCC提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1肝癌小鼠模型的構(gòu)建及樣本獲取:選取120只鼠齡7周左右，體重22～25 g的清潔健康昆明小鼠。將其隨機(jī)分為兩組，實(shí)驗(yàn)組和對照組各60只。購自南京凱基生物技術(shù)有限公司的H22肝癌細(xì)胞系，體外培養(yǎng)至細(xì)胞指數(shù)生長期時(shí)，取細(xì)胞3 000 r/min離心、洗滌、稀釋至終濃度105個(gè)/ml，給予實(shí)驗(yàn)組小鼠雙前肢腋下接種細(xì)胞懸液0.2 ml/只，對照組采用生理鹽水同法注射，正常飼養(yǎng)4周后，選出成瘤小鼠(n=50)，解剖取出瘤體作為腫瘤微環(huán)境(TM)樣本，對照組健康小鼠肝臟作生理微環(huán)境(PM)樣本(n=60)。本次研究經(jīng)過本院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)同意。

1.2RNA提取及RNA-seq:實(shí)驗(yàn)組和對照組組織樣本，采用RNA提取試劑盒提取各樣本總RNA，同組內(nèi)等量取各樣本總RNA混合成混合總RNA樣本送公司測序。RNA質(zhì)量檢測、逆轉(zhuǎn)錄、文庫構(gòu)建、RNA-seq及去掉低質(zhì)量的序列后得到待分析數(shù)據(jù)(clean reads)按常規(guī)程序完成。

1.3篩選出在兩類樣本中差異表達(dá)的RNA結(jié)合蛋白基因:以各基因匹配的clean reads數(shù)為依據(jù)，統(tǒng)計(jì)分析各基因RPKF值的差異，以實(shí)驗(yàn)組和對照組同一基因之間的RPKF值比值≥2或≤0.5，且FDR值≤0.05的基因?yàn)闂l件，獲得兩樣本的差異表達(dá)基因。

使用NCBI數(shù)據(jù)庫(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)以“(cancer or carcinoma) and ‘RNA binding protein’”為關(guān)鍵詞檢索RNA結(jié)合蛋白基因，構(gòu)建基因比對數(shù)據(jù)庫。通過DAVID在線數(shù)據(jù)庫(https://david.ncifcrf.gov)轉(zhuǎn)換成Ensembl gene ID后與兩樣本測序數(shù)據(jù)中的差異表達(dá)基因進(jìn)行比對，篩選出兩類樣本中差異表達(dá)的RNA結(jié)合蛋白基因。

1.4參與先天免疫反應(yīng)的外泌體相關(guān)RNA結(jié)合蛋白基因的獲取及功能分析:利用DAVID數(shù)據(jù)庫對以上差異表達(dá)的RNA結(jié)合蛋白基因進(jìn)行在線功能富集與聚類，篩選其中參與先天免疫反應(yīng)的外泌體相關(guān)RNA結(jié)合蛋白基因，再次使用DAVID篩選到的基因進(jìn)行GO和KEGG分析，其中以FDR(false discovery rate)≤0.05且P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.5參與先天免疫反應(yīng)的外泌體相關(guān)RNA結(jié)合蛋白基因的SNV和INDEL分析:根據(jù)RNA-seq數(shù)據(jù)對外泌體相關(guān)RNA結(jié)合蛋白基因進(jìn)行單核苷酸位點(diǎn)變異(single nucleotide variants, SNV)及核苷酸插入/刪除(INDEL)分析，探討其與基因表達(dá)的可能相關(guān)性。

1.6參與先天免疫反應(yīng)的外泌體相關(guān)RNA結(jié)合蛋白基因編碼蛋白的互作分析:采用STING數(shù)據(jù)庫(https://string-db.org/)對參與先天免疫反應(yīng)的外泌體相關(guān)RNA結(jié)合蛋白基因的編碼蛋白進(jìn)行互作分析。

1.7差異表達(dá)基因的RT-qPCR驗(yàn)證:隨機(jī)選擇3個(gè)參與先天免疫反應(yīng)的外泌體相關(guān)RNA結(jié)合蛋白基因進(jìn)行 RT-qPCR 分析，內(nèi)參基因?yàn)?RN18s，驗(yàn)證其表達(dá)量以及RNA-seq測序結(jié)果準(zhǔn)確性。

2 結(jié)果

通過篩選共獲得了69個(gè)參與先天免疫反應(yīng)的差異表達(dá)的外泌體相關(guān)RNA結(jié)合蛋白基因。DAVID數(shù)據(jù)庫功能富集分析結(jié)果顯示，它們共參與了12個(gè)BP、4個(gè)CC、1個(gè)KEGG和3個(gè)UP-SEQ(見圖1)。GO分析發(fā)現(xiàn)，這些差異表達(dá)基因主要聚集在免疫應(yīng)答，尤其是先天免疫，還有參與補(bǔ)體激活經(jīng)典途徑、炎性反應(yīng)等。其中大量基因存在N-連接糖基化位點(diǎn)、二硫鍵及信號肽。這些差異表達(dá)基因的編碼蛋白互作情況見圖2。

SNV和INDEL分析顯示，有55個(gè)差異表達(dá)基因發(fā)生了520 個(gè)SNV 和22個(gè)INDEL 位點(diǎn)的改變，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的有15個(gè)基因，它們分別是Apobec3、Myo1g、App、Src、Pstpip1、Aim2、Cd5l、Il1rap、C4bp、Apcs、Hc、Tec、Fgg、Ifit1和Cfi，且SNV 改變與其基因的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)。

注：BP，生物學(xué)程序；CC，細(xì)胞組分；MF，分子功能；UP-SEQ，蛋白位點(diǎn)序列特征圖1 TM中瘤體組織外泌體相關(guān)差異表達(dá)基因的生物學(xué)功能

圖2 HCC中參與免疫應(yīng)答的RNA結(jié)合蛋白基因編碼蛋白的互作

隨機(jī)選擇的3個(gè)差異表達(dá)基因RT-qPCR 分析，其結(jié)果與 RNA-seq 結(jié)果一致(見圖3)。3個(gè)差異表達(dá)基因和18sRNA內(nèi)參基因的引物序列見表1。

表1 RT-qPCR引物序列

基因引物5'-引物3'-引物18sRNAGGTGAAGGTCGGTGTGAACGCTCGCTCCTGGAAGATGGTGFasGCCAACCTGAAAACTAGGCTGCGTTTGGCTTCTTTACCCACCCtnna1AAGTCTGGAGATTAGGACTCTGGACGGCCTCTCTTTTTATTAGACGTnfrsf1bACACCCTACAAACCGGAACCAGCCTTCCTGTCATAGTATTCCT

注：圖中數(shù)值為以2為底的對數(shù)值圖3 RT-qPCR 與 RNA-seq 分析HCC中參與先天免疫反應(yīng)的外泌體相關(guān)RNA結(jié)合蛋白基因的表達(dá)情況

3 討論

基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄后修飾是重要的表觀調(diào)控機(jī)制，轉(zhuǎn)錄后修飾包括RNA剪接、編輯、穩(wěn)定性、定位、修飾、翻譯及3′多聚腺苷酸化和5′加帽等[9]。RNA結(jié)合蛋白是轉(zhuǎn)錄后修飾的重要參與者，有多種RNA結(jié)合蛋白參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程[10-11]。

本研究也顯示，與健康肝組織相比，HCC 中共有69個(gè)差異表達(dá)的外泌體相關(guān)RNA結(jié)合蛋白基因可能參與先天免疫反應(yīng)，說明這些基因在參與HCC的發(fā)生發(fā)展中對早期清除癌細(xì)胞及其引起的相關(guān)炎性可能起著重要作用。在這些差異表達(dá)的基因里不同的基因在HCC發(fā)生發(fā)展的過程中可能參與不同的反應(yīng)，進(jìn)而對腫瘤的發(fā)生發(fā)展有著不一樣的影響。如Han等發(fā)現(xiàn)，RNA結(jié)合蛋白SORBS2基因通過穩(wěn)定RORA基因來抑制HCC的發(fā)生和轉(zhuǎn)移[10]。Dong等則發(fā)現(xiàn)，RNA結(jié)合蛋白R(shí)BM3基因通過調(diào)節(jié)環(huán)狀核糖核酸SCD-circRNA 2的產(chǎn)生促進(jìn)HCC的細(xì)胞增殖[11]。

另外本研究還發(fā)現(xiàn)外泌體相關(guān)RNA結(jié)合蛋白可能還參與炎性反應(yīng)。已有研究報(bào)道HCC的入侵常會(huì)引起機(jī)體的炎性反應(yīng)，而持續(xù)存在的炎性可能促進(jìn)癌癥的發(fā)生、發(fā)展。Yiakouvaki等研究表明，RNA結(jié)合蛋白Hur基因結(jié)合并調(diào)節(jié)先天免疫應(yīng)答的有效激活，并與依賴于編碼炎性效應(yīng)蛋白的mRNAs的產(chǎn)生和轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)相關(guān)，進(jìn)而導(dǎo)致結(jié)腸炎相關(guān)癌癥的嚴(yán)重易感性增高[12]。本研究發(fā)現(xiàn)外泌體相關(guān)RNA結(jié)合蛋白基因還涉及后天性免疫反應(yīng)，所以它們對HCC中癌細(xì)胞及相關(guān)炎性的清除可能是持續(xù)性的，即在后續(xù)的特異性免疫反應(yīng)中也可能發(fā)揮著一定的作用。但由于后天性免疫涉及的基因較少，而先天性免疫反應(yīng)涉及的基因相對較多，因此外泌體相關(guān)RNA結(jié)合蛋白基因在HCC發(fā)生發(fā)展中的作用可能更傾向于非特異性的防御保護(hù)。

通過對這些基因的功能富集分析，發(fā)現(xiàn)多種外泌體相關(guān)RNA結(jié)合蛋白存在N-連接(N乙酰葡萄糖胺)糖基化位點(diǎn)、二硫鍵及信號肽序列，說明這些差異表達(dá)基因編碼蛋白可能是通過糖蛋白的N-粘連方式或二硫鍵方式與受體結(jié)合而參與先天性免疫反應(yīng)。信號肽的存在說明多種基因編碼蛋白為膜蛋白，這與多種外泌體相關(guān)RNA結(jié)合蛋白的胞外分布特點(diǎn)是相一致的，這也說明外泌體相關(guān)RNA結(jié)合蛋白的功能可能涉及從胞外到胞內(nèi)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。二硫鍵是多肽鏈內(nèi)部或多肽鏈之間的一種共價(jià)結(jié)合方式，表明相關(guān)分子之間連接的緊密性，這與其他研究發(fā)現(xiàn)相一致，即二硫鍵與癌癥病變及其遷移密切相關(guān)[13-14]。N-粘連糖蛋白是血液、尿液和唾液等體液中最常見的一種細(xì)胞分泌蛋白，其寡糖鏈分支增多及復(fù)雜化與HCC的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[15-17]。馬瑾等發(fā)現(xiàn)，HP、hCE1蛋白表達(dá)變化和N-糖鏈變異可能參與了HCC發(fā)生發(fā)展過程[18]。所以推測外泌體相關(guān)RNA結(jié)合蛋白可能通過糖蛋白N-粘連的方式與腫瘤壞死因子受體的結(jié)合參與HCC中的先天性免疫反應(yīng)，從而影響HCC的發(fā)生發(fā)展。對外泌體相關(guān)RNA結(jié)合蛋白基因的SNV和INDEL分析還顯示，HCC中SNV改變與其基因的表達(dá)呈正相關(guān)，這說明SNV可能對基因表達(dá)具有正調(diào)控作用。

綜上所述，本研究利用RNA-seq及生物信息學(xué)手段，發(fā)現(xiàn)在TM和PM中外泌體相關(guān)RNA結(jié)合蛋白基因存在差異表達(dá)，生物信息學(xué)顯示其可能涉及到多個(gè)生物學(xué)過程，且可能通過參與先天免疫影響HCC發(fā)展。推測外泌體相關(guān)RNA結(jié)合蛋白基因可能通過糖蛋白N-粘連或二硫鍵的方式與受體結(jié)合參與HCC中的先天性免疫反應(yīng)，以非特異性的防御保護(hù)影響腫瘤的發(fā)生發(fā)展，但未能對可能的機(jī)制機(jī)理進(jìn)行論證和深入探討，是本研究的不足之處。今后將繼續(xù)對外泌體相關(guān)RNA結(jié)合蛋白基因可能通過先天免疫參與HCC發(fā)生發(fā)展的機(jī)制進(jìn)行深入實(shí)驗(yàn)研究，以期為更好理解HCC發(fā)生發(fā)展機(jī)制及診斷預(yù)防提供理論依據(jù)。