楨楠種子萌發(fā)過(guò)程中內(nèi)源激素對(duì)溫度變化的響應(yīng)

（1.生物資源保護(hù)與利用湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北 恩施 445000；2.湖北民族大學(xué) 林學(xué)園藝學(xué)院，湖北 恩施 445000）

楨楠Phoebe zhennanS.Lee & F.N.Wei，樟科Rosaceae 楠屬PhoebeNees 常綠大喬木，主要分布于四川、貴州、湖北、湖南及浙江等省，是國(guó)家二級(jí)重點(diǎn)保護(hù)樹種[1]。楨楠的種子具有休眠特性，不易萌發(fā)[2]，因此采用輔助方法比如種子去皮處理[3]、添加植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑[4]、不同的浸種方式、溫度和貯藏時(shí)間[5]等方法可以提高種子的發(fā)芽率，但實(shí)際發(fā)芽效果均不甚理想。研究證實(shí)不同溫度處理對(duì)于楨楠種子萌發(fā)有一定的促進(jìn)作用，低溫處理可以增加解除休眠內(nèi)源激素的含量，增加種子的發(fā)芽 率[6]。種子休眠與萌發(fā)的影響因素有很多，其中植物激素是調(diào)控種子萌發(fā)過(guò)程中重要因素之一[7]，它們能通過(guò)信號(hào)傳導(dǎo)途徑對(duì)種子內(nèi)各種生理變化做出應(yīng)答，調(diào)節(jié)一系列蛋白質(zhì)、酶的代謝，從而調(diào)控種子的休眠和萌發(fā)[8]。在種子休眠和萌發(fā)過(guò)程中GA3、CTK、ABA 分別在萌發(fā)中起著原發(fā)、許可與抑制作用，對(duì)最初萌發(fā)起決定作用的激素為GA3[9]。本試驗(yàn)采用低溫（4 ℃）處理后的種子在恒溫（25 ℃）和變溫（15 ℃/25 ℃）條件下研究楨楠種子萌發(fā)率，以及低溫處理后種子萌發(fā)過(guò)程中內(nèi)源激素的變化，為探明楨楠種子萌發(fā)機(jī)制提供依據(jù)，也為其繁育和開發(fā)應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

2017年11月上旬于湖北省恩施土家族苗族自治州林業(yè)科學(xué)研究院（30°17′51″N，109°29′58″E）采集楨楠種子，空癟粒采用水選法漂出，然后將飽滿種子于室溫下陰干后調(diào)制，室溫儲(chǔ)藏備用。楨楠種子千粒重為281 g。

1.2 試驗(yàn)方法

將新鮮成熟的種子在4 ℃的低溫條件下分別處理0、7、14、21、28 d，以自然狀態(tài)保存0、7、14、21、28 d 的種子作為對(duì)照（CK）。然后將低溫處理過(guò)的種子放置于培養(yǎng)皿中，在恒溫條件25 ℃ 和變溫條件15 ℃/25 ℃（夜溫15 ℃，晝溫25 ℃，各12 h）下進(jìn)行發(fā)芽試驗(yàn)，每個(gè)處理100 粒種子，3 次重復(fù)。在發(fā)芽過(guò)程中，每3 天采集1 次樣品，立即用液氮速凍并置于-80 ℃冰箱內(nèi)保存，用于內(nèi)源激素含量測(cè)定。植物內(nèi)源激素的測(cè)定采用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法（ELISA），為了保證測(cè)試數(shù)據(jù)的穩(wěn)定可靠，試劑盒由中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)提供，植物激素提取測(cè)定方法參照試劑盒附帶操作說(shuō)明書進(jìn)行，3 次重復(fù)。

1.3 數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Excel 2016 和SPSS 20.0 進(jìn)行分析處理，用鄧肯新復(fù)極差法（Duncan）進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同處理下楨楠種子的發(fā)芽率

經(jīng)過(guò)低溫（4 ℃）處理不同天數(shù)后，在變溫（15 ℃/25 ℃）條件和恒溫條件（25 ℃）下楨楠種子的發(fā)芽率進(jìn)行方差分析（表1），結(jié)果表明：在變溫條件種子發(fā)芽率有較為明顯的提高，低溫處理0、7、4、21、28 d 后，楨楠種子發(fā)芽率分別為43.3%、50.7%、66.0%、53.3%、55.7%，而在恒溫條件下的發(fā)芽率不足30%?？梢姷蜏靥幚砟茱@著促進(jìn)楨楠種子萌發(fā)；但并不是低溫處理的時(shí)間越長(zhǎng)，楨楠種子的發(fā)芽率越高，由表1可知經(jīng)過(guò)低溫處理14 d 的種子在變溫條件下的發(fā)芽率最高，達(dá)到66.0%，而在恒溫條件下的發(fā)芽率均低于30%。方差分析可知，經(jīng)過(guò)4 ℃低溫處理不同天數(shù)后的楨楠種子在變溫條件下的發(fā)芽率和未經(jīng)過(guò)低溫處理的種子發(fā)芽率呈極顯著差異（P＜0.01）。

2.2 未經(jīng)低溫處理的楨楠種子發(fā)芽過(guò)程中內(nèi)源激素的變化

未經(jīng)過(guò)低溫（4 ℃）處理的種子在變溫（15 ℃/25 ℃）條件下的GA3、IAA、ZR 含量均高于恒溫（25 ℃）條件下的GA3、IAA、ZR 含量，僅ABA含量在變溫條件下比恒溫條件下略低（圖1）。在恒溫條件下，GA3、ABA、ZR 含量均呈現(xiàn)出先降低再升高的趨勢(shì)，IAA 含量呈現(xiàn)出先下降再上升，在發(fā)芽結(jié)束時(shí)又下降的趨勢(shì)，在變溫條件下，GA3和ZR 含量呈現(xiàn)出先上升后下降趨勢(shì)，ABA 和IAA含量變化趨勢(shì)則與這兩者相反，呈現(xiàn)出先下降后上升趨勢(shì)?？梢娮儨啬軌蛱岣咦匀槐４鏃l件下種子內(nèi)源激素的含量，進(jìn)而提高種子的發(fā)芽率，這也和表1結(jié)果相對(duì)應(yīng)，自然保存變溫條件下種子的發(fā)芽率均高于自然保存恒溫條件下的發(fā)芽率。

表1 楨楠種子在不同處理下的發(fā)芽率? Table 1 The germination rate of phoebe zhennan seeds at different treatments %

圖1 未經(jīng)低溫處理楨楠種子發(fā)芽過(guò)程中內(nèi)源激素含量的變化Fig.1 The content dynamics of endogenous hormones of phoebe zhennan seeds in the process of germination without pre-chilling

2.3 低溫處理后的楨楠種子發(fā)芽過(guò)程中內(nèi)源激素的變化

由表1可知，經(jīng)過(guò)低溫（4 ℃）處理14 d 后的種子在變溫（15 ℃/25 ℃）條件下的發(fā)芽率最高，因此以經(jīng)過(guò)低溫處理14 d 的種子為研究對(duì)象，研究在發(fā)芽過(guò)程中種子內(nèi)源激素的變化。

經(jīng)過(guò)低溫（4 ℃）處理后的種子，在變溫（15 ℃/25 ℃）條件下的GA3、IAA、ZR 含量均高于恒溫（25 ℃）條件下的GA3、IAA、ZR 含量，僅ABA含量在變溫條件下比恒溫條件下略低。在恒溫條件下，GA3含量變化趨勢(shì)較小，在發(fā)芽6 d 略有下降，隨后又逐漸緩慢上升，而在變溫條件下GA3含量呈現(xiàn)出先升高再降低的趨勢(shì)，在發(fā)芽12 d 時(shí)達(dá)到最大值為417.17 ng·g-1。而ABA 的變化規(guī)律較為一致，均出現(xiàn)先降低后增高的趨勢(shì)，在發(fā)芽12 d 時(shí)ABA 均達(dá)到最小值，分別為 226.85、276.84 ng·g-1，且ABA 的減小幅度在變溫條件下比恒溫條件下要大，但在發(fā)芽第24 天時(shí)，變溫條件下的種子ABA 含量要比恒溫條件下的含量略高。

IAA 含量呈現(xiàn)出先下降再上升，在發(fā)芽結(jié)束時(shí)又下降的趨勢(shì)；在發(fā)芽前期變溫條件下的IAA 含量略高于恒溫條件下的IAA 含量，在發(fā)芽 18 d 以后，變溫條件下的IAA 含量略低于恒溫條件下的IAA 含量，在發(fā)芽6 d 時(shí)達(dá)到最低值，分別為153.48、142.64 ng·g-1。ZR 含量在恒溫條件和變溫條件下的趨勢(shì)則相反，在恒溫條件下ZR 含量隨著發(fā)芽時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸降低，最小值出現(xiàn)在發(fā)芽15 d 時(shí)，為25.81 ng·g-1，而在變溫條件下ZR含量則隨著發(fā)芽時(shí)間的正在逐漸升高，最大值出現(xiàn)在發(fā)芽12 d 時(shí)，為47.69 ng·g-1。

2.4 低溫處理后楨楠種子在發(fā)芽過(guò)程中內(nèi)源激素動(dòng)態(tài)變化

經(jīng)過(guò)低溫（4 ℃）處理后，在變溫（15 ℃/25 ℃）條件楨楠種子內(nèi)源激素GA3/ABA、ZR/ABA、（GA3+IAA+ZR）/ABA 均比恒溫（25 ℃）條件下楨楠種子內(nèi)源激素GA3/ABA、ZR/ABA、（GA3+IAA+ZR）/ABA 高，只有發(fā)芽前期（18 d左右），在變溫條件下IAA/ABA 值高于恒溫條件下IAA/ABA 值（圖3）。

圖2 4 ℃低溫處理楨楠種子發(fā)芽過(guò)程中內(nèi)源激素含量變化Fig.2 The content of endogenous hormones of phoebe zhennan seeds in the process of germination with 4 ℃ pre-chilling

圖3 4 ℃低溫處理楨楠種子發(fā)芽過(guò)程中內(nèi)源激素動(dòng)態(tài)變化Fig.3 The content dynamics of endogenous hormones of phoebe zhennan seeds in the process of germination with 4 ℃ pre-chilling

2.4.1 楨楠種子內(nèi)源激素GA3/ABA 的變化

經(jīng)過(guò)低溫（4 ℃）處理后，在變溫（15 ℃/25 ℃）條件和恒溫（25 ℃）條件下楨楠種子的GA3/ABA 值均呈現(xiàn)出先上升后下降的趨勢(shì)。在發(fā)芽第12 天時(shí)，變溫條件下GA3/ABA 值達(dá)到最大，隨后又顯著下降，與恒溫條件相比GA3/ABA 值上升146.43%，；在恒溫條件下GA3/ABA 上升幅度沒有變溫條件下顯著；至發(fā)芽結(jié)束時(shí)，無(wú)論變溫還是恒溫，GA3/ABA 比值相差不大，分別為1.09和1.07，與種子開始發(fā)芽時(shí)的GA3/ABA 值相比分別增加29.36%和27.38%。

2.4.2 楨楠種子內(nèi)源激素IAA/ABA 的變化

經(jīng)過(guò)低溫（4 ℃）處理后，在變溫（15 ℃/25 ℃）條件和恒溫（25 ℃）條件下楨楠種子的IAA/ABA值都呈先上升后下降的趨勢(shì)，但最大值出現(xiàn)的時(shí)間不同。變溫條件下在發(fā)芽第12 天IAA/ABA 達(dá)到最大值，隨后又顯著降低，而恒溫條件下在發(fā)芽第18 天IAA/ABA 達(dá)到最大值，隨后緩慢下降，至發(fā)芽結(jié)束時(shí)，反而恒溫條件下的IAA/ABA 值比變溫條件下略高，但都高于發(fā)芽開始時(shí)的IAA/ABA 值，分別比發(fā)芽開始時(shí)高31.71%和2.44%。

2.4.3 楨楠種子內(nèi)源激素ZR/ABA 的變化

經(jīng)過(guò)低溫（4 ℃）處理后，在變溫（15 ℃/25 ℃）條件和恒溫（25 ℃）條件下楨楠種子的ZR/ABA 值呈先上升后下降的趨勢(shì)。變溫條件下在發(fā)芽第12 天時(shí)ZR/ABA 值達(dá)到最大，比恒溫條件下上升了90.91%，隨后又顯著下降。在恒溫條件下ZR/ABA 上升幅度沒有變溫條件下顯著，在發(fā)芽12 d 時(shí)達(dá)到最大值，至發(fā)芽后期，ZR/ABA 值處于穩(wěn)定狀態(tài)。相比開始發(fā)芽時(shí)的ZR/ABA 值分別增加30%和-10%。

2.4.4 楨楠種子內(nèi)源激素（GA3+IAA+ZR）/ABA的變化

經(jīng)過(guò)低溫（4 ℃）處理后，在變溫（15 ℃/25 ℃）條件和恒溫（25 ℃）條件下楨楠種子的（GA3+IAA+ZR）/ABA 值呈先上升后下降的趨勢(shì)。變溫條件下在發(fā)芽第12 天時(shí)（GA3+ IAA+ZR）/ABA 值達(dá)到最大，比恒溫條件下上升了142.54%，隨后又顯著下降。在恒溫條件下（GA3+IAA+ZR）/ABA 上升幅度較為緩慢，在發(fā)芽18 d 時(shí)達(dá)到最大值。相比開始發(fā)芽時(shí)的ZR/ABA 值分別增加80%和25.93%。

2.5 楨楠種子內(nèi)源激素和發(fā)芽率的相關(guān)分析

楨楠種子在12 d 時(shí)發(fā)芽率達(dá)到最大值，因此以發(fā)芽率最大值作為參照，分析此時(shí)楨楠種子內(nèi)源激素與發(fā)芽率之間的關(guān)系。

經(jīng)過(guò)低溫（4 ℃）處理后的楨楠種子，在變溫（15 ℃/25 ℃）條件和恒溫（25 ℃）條件下的發(fā)芽率均與GA3/ABA、IAA/ABA、ZR/ABA 及（GA3+IAA+ZR）/ABA 比值呈顯著或極顯著正相關(guān)，ABA 與發(fā)芽率相關(guān)性在變溫條件下相關(guān)性不顯著，但在恒溫條件下表現(xiàn)為負(fù)顯著相關(guān)，GA3、IAA 和ZR 與發(fā)芽率的關(guān)系不論在恒溫條件下還是變溫條件均呈顯著或極顯著正相關(guān)（表2）。

表2 各內(nèi)源激素與發(fā)芽率的相關(guān)性?Table 2 The correlation analysis between endogenous hormone and germination rate of phoebe zhennan seeds

3 結(jié)論與討論

3.1 低溫處理對(duì)楨楠種子發(fā)芽率的影響

溫度作為一種外界環(huán)境因子，在種子的整個(gè)生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮著重要作用，如控制種子的休眠與萌發(fā)等，而低溫則對(duì)于破除種子休眠起著非常關(guān)鍵的作用，有些植物種子需要在特定的溫度下才能解除休眠，而有些植物種子的萌發(fā)則需要一個(gè)變溫解除休眠的過(guò)程[10]，如藺吉祥在20 ℃（12 h）/30 ℃（12 h）變溫條件下，通過(guò)對(duì)發(fā)芽率、發(fā)芽速率、開始發(fā)芽時(shí)間以及50%種子發(fā)芽天數(shù)等指標(biāo)進(jìn)行觀察，發(fā)現(xiàn)變溫處理可以顯著提高羊草種子的萌發(fā)率[11]；Weitbrecht 研究則證實(shí)擬南芥種子在4 ℃的溫度下3 d 左右即可破除休眠[12]。本研究發(fā)現(xiàn)經(jīng)過(guò)低溫處理的楨楠種子在自然保存條件下發(fā)芽率為32.7%～37.0%，在變溫條件下發(fā)芽率比自然保存條件下發(fā)芽率顯著提高，但并不是低溫處理的時(shí)間越長(zhǎng)萌發(fā)率越高，在低溫（4 ℃） 處理14 d 后在變溫（15 ℃/25 ℃）條件下發(fā)芽率達(dá)到66.0%，隨著低溫處理時(shí)間的延長(zhǎng)，發(fā)芽率反而有降低趨勢(shì)；而沒有經(jīng)過(guò)低溫處理的種子即使在變溫條件下發(fā)芽率也不足30.0%，說(shuō)明低溫可以解除種子的休眠，顯著提高種子的發(fā)芽率。

3.2 楨楠種子萌發(fā)過(guò)程中內(nèi)源激素的變化

植物激素對(duì)種子休眠萌發(fā)起著非常重要的調(diào)控作用[13-14]，Khan 認(rèn)為多種內(nèi)源激素共同調(diào)控種子的休眠和萌發(fā)，不單純是某一種植物內(nèi)源激素的增加或者減少就會(huì)導(dǎo)致種子的萌發(fā)[15-16]；Mohammad 等[17]認(rèn)為種子休眠的解除總是與赤霉素類物質(zhì)的積累相伴發(fā)生；張鵬等[18]對(duì)水曲柳種子的研究則發(fā)現(xiàn)內(nèi)源激素ZR 具有抵消發(fā)芽抑制物質(zhì)的作用，從而調(diào)控種子發(fā)育中的物質(zhì)和能量代謝；Kucera 等[19]研究發(fā)現(xiàn)內(nèi)源激素ABA 不僅可以誘導(dǎo)種子的休眠，還可以抑制種子的萌發(fā)；宋發(fā)軍等[20]對(duì)華重樓種子萌發(fā)的結(jié)果則表明華重樓種子休眠的解除、萌發(fā)和出苗不僅受內(nèi)源激素含量的影響，還與各激素之間的平衡有關(guān)，特別是促進(jìn)生長(zhǎng)激素與抑制生長(zhǎng)激素之間的比例和平衡；李應(yīng)蘭等[21]研究發(fā)現(xiàn)在厚竹個(gè)體發(fā)育過(guò)程中內(nèi)源激素IAA、GA 及促進(jìn)生長(zhǎng)類激素總量（IAA+ZR+GA）與抑制生長(zhǎng)類激素（ABA）的比值變化均不顯著。韓繼紅等[22]對(duì)無(wú)患子硬枝扦插研究發(fā)現(xiàn)插穗內(nèi)源激素含量ZR/IAA 和ZR/GA3在4 個(gè)時(shí)期均呈現(xiàn)為先迅速下降，然后迅速上升，再下降或者相對(duì)穩(wěn)定。

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)經(jīng)過(guò)低溫（4 ℃）處理后的種子在變溫（15 ℃/25 ℃）條件內(nèi)源激素GA3、IAA、ZR 的含量均明顯高于恒溫（25 ℃）條件下的內(nèi)源激素含量，ABA 含量則在變溫條件下低于恒溫條件，同時(shí)種子內(nèi)源激素GA3/ABA、IAA/ABA、ZR/ABA 及（GA3+IAA+ZR）/ABA 的比值也顯著上升，表明變溫條件能夠打破種子內(nèi)源激素間的平衡，增加促進(jìn)種子萌發(fā)的內(nèi)源激素含量，降低抑制種子萌發(fā)的內(nèi)源激素含量，使得種子萌發(fā)率顯著增加。這與天女木蘭[23]、滇重樓[24]、紫椴[25]、東北紅豆杉[26]、山桐子[27]等種子內(nèi)源激素與種子萌發(fā)關(guān)系的研究結(jié)果一致。Khan 和Wafters提出的激素三因子調(diào)節(jié)學(xué)說(shuō)認(rèn)為GA3、CTK、ABA 分別在萌發(fā)中起著原發(fā)、許可與抑制作用，GA3為萌發(fā)最初所必需，CTK 可以減緩抑制劑ABA 對(duì)GA3的抑制作用，使GA3的作用得以實(shí)現(xiàn)，這三種激素相互作用，共同決定著種子的休眠與萌發(fā)。本研究測(cè)定了不同溫度處理下楨楠種子內(nèi)源激素赤霉素GA3、脫落酸ABA、生長(zhǎng)素IAA、玉米素ZR 的含量和動(dòng)態(tài)變化，而沒有涉及細(xì)胞分裂素CTK 的含量在不同溫度處理下的變化，下一步將繼續(xù)深入研究變溫條件下細(xì)胞分裂素CTK 對(duì)楨楠種子休眠的減緩抑制作用。