響應(yīng)面法優(yōu)化超臨界二氧化碳萃取苦參堿工藝技術(shù)

姚 眾，張貴云，張麗萍，劉 珍，范巧蘭，呂貝貝

（山西農(nóng)業(yè)大學(xué)棉花研究所，山西運(yùn)城044000）

苦參堿（matrine）是中藥材苦參（Sophora flavescens）的提取物，不僅廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥，具有抗菌、抗腫瘤、抗炎、抗過敏等作用[1-4]，而且是一類低毒、低殘留、環(huán)保型植物源農(nóng)藥，對(duì)多種病蟲害的防治和植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)均有較好的作用[5-6]?！吨袊?guó)藥典》2015 版中以氯仿為溶劑，超聲波提取法提取苦參堿[7]，工業(yè)生產(chǎn)中，亦采用滲漉法、溫浸法、回流法、快速溶劑萃取法等多種傳統(tǒng)方法進(jìn)行萃取[8-9]。雖然方法簡(jiǎn)單，但存在大量使用有機(jī)溶劑、有效成分損失較多、提取率低、污染環(huán)境、安全性低等問題[10]。超臨界CO2流體萃取技術(shù)作為一種新型的萃取分離技術(shù)，具有保持生物活性、提取率高、操作簡(jiǎn)便、效率高、無殘留溶劑等優(yōu)點(diǎn)，適用于植物源農(nóng)藥的提取[11-12]。梁燕明等[9]對(duì)比分析了滲漉法、溫浸法與超臨界CO2流體萃取技術(shù)從山豆根中提取苦參堿的工藝優(yōu)劣特點(diǎn)，結(jié)果表明，超臨界萃取法萃取的苦參堿含量要高于傳統(tǒng)方法。

響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)是基于多項(xiàng)式方程與試驗(yàn)數(shù)據(jù)擬合的數(shù)學(xué)和統(tǒng)計(jì)技術(shù)的集合，能夠迅速有效地對(duì)多個(gè)影響因素進(jìn)行交叉考察，獲得最佳的提取工藝條件[13-14]。與傳統(tǒng)的正交設(shè)計(jì)和均勻設(shè)計(jì)相比，響應(yīng)面設(shè)計(jì)通過較少的試驗(yàn)次數(shù)快速建模，可在整個(gè)區(qū)域內(nèi)對(duì)試驗(yàn)各個(gè)水平進(jìn)行連續(xù)分析，并考慮了試驗(yàn)的隨機(jī)誤差，所得回歸方程精確度高，具有突出的優(yōu)越性[15-16]。

本研究以苦參堿萃取率為響應(yīng)值，以影響苦參堿萃取率的萃取壓力、萃取溫度、萃取時(shí)間和夾帶劑用量為自變量，運(yùn)用Design-Expert 軟件進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)，對(duì)苦參堿超臨界CO2萃取工藝進(jìn)行優(yōu)化，旨在探求苦參堿超臨界CO2萃取的最佳工藝條件，為超臨界CO2萃取苦參堿的深入研究提供參考。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試樣品為豆科植物苦參的干燥根，于2017 年8 月下旬采集于山西汾陽(yáng)。

1.2 儀器與試劑

HA220-50-06 型超臨界CO2萃取儀（江蘇華安科研儀器有限公司）；1790 氣象色譜儀（安捷倫科技上海分析儀器有限公司）；Sartorius BSA224SCW 型電子分析天平（賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司）；HR-10 多功能粉碎機(jī)（上海哈瑞斯電器有限公司）；HHB11600 型電熱恒溫培養(yǎng)箱（寧波醫(yī)療器械二廠）。

苦參堿標(biāo)品（中國(guó)食品藥品檢定研究院）；鄰苯二甲酸二辛酯（石家莊市有機(jī)化工廠）、無水乙醇、氨水均為分析純；CO2購(gòu)于廷威氣體有限公司（純度＞99%）。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 苦參堿超臨界CO2萃取方法 采集的苦參于45 ℃干燥箱中干燥至恒質(zhì)量，用粉碎機(jī)粉碎后過0.25 mm 篩。精密稱取100 g苦參粉末，加入0.5 mol/L氨水浸潤(rùn)過夜。次日裝入1 L 萃取缸中，同時(shí)根據(jù)試驗(yàn)要求將夾帶劑放入夾帶劑罐中，接通制冷開關(guān)，將冷箱溫度控制在4 ℃，接通水循環(huán)。通入CO2后，控制合適的萃取溫度、萃取壓力、萃取時(shí)間、夾帶劑用量等試驗(yàn)條件進(jìn)行萃取。

1.3.2 苦參堿含量測(cè)定 采用氣相色譜法，以鄰苯二甲酸二辛酯為內(nèi)標(biāo)物，參考單煒力等[17]的方法對(duì)苦參堿含量進(jìn)行測(cè)定，稍有修改。

1.3.3 萃取工藝響應(yīng)面試驗(yàn) 根據(jù)預(yù)試驗(yàn)，確定不同因素及水平值，選取萃取溫度（A）、萃取壓力（B）、萃取時(shí)間（C）、夾帶劑用量（D）為自變量，以苦參堿萃取率（Y）為響應(yīng)值，運(yùn)用Design-Expert 8.0軟件進(jìn)行Box-Behnken 響應(yīng)面設(shè)計(jì)，試驗(yàn)因素及水平設(shè)計(jì)如表1 所示。

表1 Box-Behnken 試驗(yàn)因素水平

1.3.4 驗(yàn)證試驗(yàn) 根據(jù)響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果分析，得出超臨界CO2萃取苦參中苦參堿的最佳工藝條件，并在優(yōu)化條件下萃取苦參堿，通過比較預(yù)測(cè)值和試驗(yàn)值驗(yàn)證模型的有效性。

2 結(jié)果與分析

2.1 模型的建立與顯著性檢驗(yàn)

表2 響應(yīng)面Box-Behnken 試驗(yàn)結(jié)果分析

利用統(tǒng)計(jì)分析軟件Design-Expert 8.0，采用響應(yīng) 面法進(jìn)行試驗(yàn)設(shè)計(jì)，以表2 中苦參堿得率（Y）對(duì)自變量萃取溫度（A）、萃取壓力（B）、萃取時(shí)間（C）和夾帶劑用量（D）進(jìn)行回歸分析，得到回歸方程：Y＝-35.36 ＋0.34A ＋1.49B ＋0.68C ＋0.89D－5.00×10-5AB＋4.50×10-3AC＋3.75×10-3AD＋0.01 BC＋0.03BD ＋0.10CD-2.80×10-3A2-0.03B2－0.22 C2－0.37D2。

試驗(yàn)?zāi)Ｐ偷姆讲罘治觯ū?）結(jié)果表明，本研究模型極顯著（P＜0.000 1），失擬性不顯著，說明方程有很好的擬合性，苦參堿得率回歸模型能夠代表苦參堿實(shí)際萃取得率。對(duì)模型進(jìn)行回歸方程系數(shù)顯著性檢驗(yàn)可知，A、B、C、D、BD、A2、B2、C2、D2對(duì)苦參堿得率影響顯著（P＜0.05）。各個(gè)因素對(duì)苦參堿萃取率的影響不是單純的線性關(guān)系，對(duì)其提取工藝影響因素從大到小排序?yàn)檩腿毫Γ˙）＞萃取時(shí)間（C）＞萃取溫度（A）＞夾帶劑用量（D）。

表3 響應(yīng)面試驗(yàn)回歸方程的方差分析

2.2 響應(yīng)面分析

根據(jù)響應(yīng)面選擇的回歸模型繪制響應(yīng)面圖，直觀反映響應(yīng)值與各因素以及各因素之間的相互關(guān)系。由圖1～6 可知，響應(yīng)面曲面圖開口均朝下，響應(yīng)面模型具有最高點(diǎn)，說明本試驗(yàn)存在最優(yōu)解。響應(yīng)面的陡峭程度可反映出各因素對(duì)響應(yīng)值的影響程度。響應(yīng)面越陡峭，表明該因素對(duì)響應(yīng)值影響越顯著，響應(yīng)面越平緩則相反[18-19]。從圖1～6 還可以看出，萃取壓力對(duì)苦參堿萃取率影響最為顯著，與方差分析結(jié)果一致。

等高線圖可反映出2 個(gè)因素交互作用的強(qiáng)弱，等值線呈橢圓形表明交互作用顯著，等值線呈圓形則相反[20]。由圖1～6 可知，溫度和夾帶劑用量之間交互作用較弱，其余各因素彼此間交互作用顯著。

2.3 最佳提取工藝確定與驗(yàn)證

根據(jù)響應(yīng)面優(yōu)化結(jié)果可知，超臨界CO2萃取苦參中苦參堿的最佳工藝條件為：萃取溫度65.64 ℃、萃取壓力32.02 MPa、萃取時(shí)間229.8 min、夾帶劑用量為物料質(zhì)量的3.48 倍，在此條件下苦參堿得率理論上為2.444 1%。

考慮到設(shè)備實(shí)際運(yùn)行情況，從方便可行角度考慮，選取萃取溫度66 ℃、萃取壓力32 MPa、萃取時(shí)間230 min、夾帶劑用量為物料質(zhì)量的3.5 倍，為苦參堿最佳萃取工藝。經(jīng)過3 次平行試驗(yàn)驗(yàn)證得出，苦參堿平均得率為2.38%，理論值與實(shí)際值之間的相對(duì)誤差為2.46%，差異不顯著，說明該方法與實(shí)際情況擬合良好，具有實(shí)用價(jià)值。

3 結(jié)論與討論

本研究獲得響應(yīng)面法優(yōu)化超臨界CO2萃取苦參中苦參堿最佳工藝條件為：溫度66 ℃、壓力32 MPa、時(shí)間230 min、夾帶劑用量為物料質(zhì)量的3.5 倍。4 種因素對(duì)苦參堿萃取率的影響從大到小排序?yàn)椋狠腿毫Γ据腿r(shí)間＞萃取溫度＞夾帶劑用量。驗(yàn)證試驗(yàn)中苦參堿的萃取率為2.38%，與模型預(yù)測(cè)結(jié)果相符。

超臨界CO2萃取中壓力變化及CO2的穿透作用可使苦參細(xì)胞壁脆性增強(qiáng)，通透性提高，亦可使苦參堿溶出性增強(qiáng)，進(jìn)而提高苦參堿萃取率[21]。在工業(yè)化生產(chǎn)中，由于超臨界產(chǎn)品投資運(yùn)行成本高、產(chǎn)業(yè)規(guī)模小、自動(dòng)化連續(xù)生產(chǎn)難等一系列原因，使超臨界CO2萃取技術(shù)工業(yè)化普及率不高。但超臨界CO2萃取技術(shù)有其獨(dú)特的優(yōu)越性，是一種高質(zhì)高效、環(huán)境友好的萃取方法，為越來越多的科技工作者所重視，這對(duì)加快其工業(yè)化進(jìn)程起到一定的促進(jìn)作用[22]。本試驗(yàn)得到的苦參超臨界CO2萃取苦參堿的最佳工藝可為后續(xù)試驗(yàn)及工業(yè)生產(chǎn)提供一定的理論參考，但實(shí)驗(yàn)室環(huán)境不能代表生產(chǎn)上的擴(kuò)大化生產(chǎn)，還需通過中試試驗(yàn)來驗(yàn)證相應(yīng)的技術(shù)效果。