羥丁酸鈉通過Rho/Rho激酶信號通路減輕腦缺血再灌注大鼠腦損傷①

白芙蓉 吳 畏

(西南醫(yī)科大學(xué)研究生院，瀘州 646000)

腦缺血再灌注損傷(cerebral ischemia-reperfusion injury，CI/RI)是永久或短暫的腦血流減少或暫停后突然恢復(fù)血流，造成神經(jīng)元、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞和腦血管功能障礙，導(dǎo)致中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能或代謝障礙[1]。據(jù)報(bào)道，CI/RI是全球第三大致死疾病，僅次于心臟病和癌癥[2]。CI/RI的確切機(jī)制尚不明確，可能與細(xì)胞鈣超載、興奮性氨基酸的毒性、局部腦組織炎癥反應(yīng)和凋亡有關(guān)[3]。羥丁酸鈉是中樞神經(jīng)抑制性遞質(zhì)γ-羥基丁酸的中間代謝產(chǎn)物的鈉鹽，作為靜脈麻醉藥用于臨床麻醉，可改善心肌缺血再灌注損傷，但具體機(jī)制尚不明確[4，5]。Rho在多種細(xì)胞過程(包括基因轉(zhuǎn)錄、細(xì)胞遷移、細(xì)胞凋亡、神經(jīng)再生和細(xì)胞形態(tài)CI/RI中發(fā)揮關(guān)鍵作用，且能夠通過Rho激酶調(diào)節(jié)細(xì)胞肌動蛋白重組及其下游效應(yīng)子[6]。 Rho激酶是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，由Rho激活并調(diào)節(jié)包括形態(tài)學(xué)、黏附、運(yùn)動和增殖等多種細(xì)胞功能，被抑制時(shí)可減少腦組織炎癥和細(xì)胞凋亡，保護(hù)抗體免受CI/RI損傷[7,8]。本研究通過Rho/Rho激酶信號通路探討羥丁酸鈉在大鼠CI/RI中的作用。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動物 清潔級雄性SD 大鼠 160 只，體質(zhì)量(220±10) g，購自四川夏派森醫(yī)藥科技有限公司，許可證號：SYXK(川)2017-203。

1.1.2試劑 羥丁酸鈉(上海旭東海普藥業(yè)有限公司，批號:國藥準(zhǔn)字H31020592)，尼莫地平(亞寶藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司，批號：國藥準(zhǔn)字H14022821)，水仙環(huán)素(美國APExBIO公司，編號：A3642)，RIPA裂解緩沖液(南京?？藸柹锟萍加邢薰?，貨號：SBJ-0999)，BCA試劑盒(上海易色醫(yī)療科技有限公司，貨號：BC201)，Bax抗體(上海酶聯(lián)生物科技有限公司，貨號：ml120073 )，Bcl-2抗體(碧云天生物技術(shù)研究所，貨號：AB112-1)，caspase-3抗體(碧云天生物技術(shù)研究所，貨號：AC031-2)，RhoA抗體(美國Abcam公司，貨號：ab54835)，Rho-kinaseα單克隆抗體(美國Abcam公司，貨號：ab451710)和Rho-kinaseβ單克隆抗體(美國Abcam公司，貨號：ab134181)，山羊抗兔二抗(上?？蹬嗫萍加邢薰?，貨號：C86-SSA004)。

1.2方法

1.2.1造模 根據(jù)參考文獻(xiàn)[9]，通過右側(cè)血管內(nèi)大腦中動脈閉塞(middle cerebral artery occlusion，MCAO)構(gòu)建局灶性腦缺血再灌注模型：將大鼠麻醉，(37±0.5)℃，分離右頸總動脈、頸外動脈和頸內(nèi)動脈，將涂有聚賴氨酸的鈍頭4.0的單絲尼龍縫線通過右頸總動脈和頸外動脈插入頸內(nèi)動脈，當(dāng)遠(yuǎn)端遇到阻力時(shí)，固定尼龍線，阻斷2 h后，取下絲線，使缺血區(qū)充分再灌注24 h。假手術(shù)組不用單絲尼龍縫線阻塞中動脈，其他處理同模型。

1.2.2分組及給藥 根據(jù)參考文獻(xiàn)[10,11]，將SD大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組、尼莫地平組、給藥低劑量組、給藥中劑量組、給藥高劑量組、水仙環(huán)素組、給藥高劑量+水仙環(huán)素組，每組20只。給藥各組在造模前40 min腹腔給予50、100、200 mg/kg羥丁酸鈉，1次/d，連續(xù)灌胃1 周。尼莫地平組每天給予0.7 mg/kg尼莫地平。水仙環(huán)素組和給藥高劑量+水仙環(huán)素組還需每天給予10 mg/kg水仙環(huán)素。對照組和模型組大鼠注射等體積生理鹽水。

1.2.3開場行為檢測自發(fā)活動情況 根據(jù)參考文獻(xiàn)[10]，造模后第8天進(jìn)行開場行為測試。將大鼠放入72 cm×76 cm×57 cm木箱，底部均分為25個(gè)小格，記錄10 min內(nèi)大鼠爬行經(jīng)過的格子數(shù)。

1.2.4T迷宮實(shí)驗(yàn)檢測學(xué)習(xí)記憶能力 參考文獻(xiàn)[10]，造模第8天，進(jìn)行T迷宮測試。測試前一天將大鼠放在T迷宮(由1個(gè)主干和2個(gè)選擇臂構(gòu)成)內(nèi)適應(yīng)5 min，到達(dá)任一個(gè)臂均可獲得食物。第2天，先將1個(gè)臂擋住，到達(dá)另1個(gè)臂可得到食物，將2個(gè)臂全部開放，但只有原來被擋住的臂內(nèi)有食物，獲得食物獎勵記為正確，否則記作錯(cuò)誤。進(jìn)行20組實(shí)驗(yàn)記錄選擇正確次數(shù)。

1.2.5腦含水量檢測 T迷宮實(shí)驗(yàn)后，麻醉后斷頭處死大鼠，分離腦組織，稱重法測定腦含水量：腦干重/腦濕重。

1.2.6HE染色觀察腦損傷 麻醉后處死大鼠，分離腦組織，4%多聚甲醛溶液固定，常規(guī)脫水制成石蠟切片，脫蠟、蘇木精染色、1%鹽酸酒精分化、0.6%氨水返藍(lán)、 0.5%伊紅染色，常規(guī)脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，400倍顯微鏡觀察腦組織損傷情況。

1.2.7TUNEL染色檢測凋亡情況 將制好的石蠟切片按照TUNEL染色檢測試劑盒說明書進(jìn)行染色。每張切片在400 倍視野下隨機(jī)選取5 個(gè)不交叉重復(fù)的視野，細(xì)胞核中出現(xiàn)棕黃色顆粒為凋亡細(xì)胞，計(jì)算腦細(xì)胞凋亡率。

1.2.8qRT-PCR檢查RhoA、Rho-kinaseα和Rho-kinaseβ mRNA表達(dá)水平 采用RNA提取試劑盒從腦組織海馬區(qū)中提取總RNA，使用cDNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。PCR反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性15 min，95℃變性10 s，60℃退火20 s，72℃延長20 s，40個(gè)循環(huán)。以β-actin為內(nèi)參。應(yīng)用凝膠成像系統(tǒng)(Bio-rad)攝影，Quan-tity One 軟件掃描分析，計(jì)算采用2-ΔΔCt法。RhoA上游引物序列：5′-AGCCTGTGGAAAGACATGCTT-3′，下游引物序列：5′-TCAAACACTGTGGGCACATAC-3′；Rho-kinaseα上游引物序列：5′-TGCCAAGACCAAGGA-3′，下游引物序列：5′-GAGGCGTCAGCAGACAGAT-3′；Rho-kinaseβ上游引物序列：5′-TGCCTCATCGTCTTCA-3′，下游引物序列：5′-GCCCTTAATGTCCACGATTTC-3′。

1.2.9Western blot檢測cleaved caspase-3、 Bax、Bcl-2、RhoA、Rho-kinaseα和Rho-kinaseβ 蛋白表達(dá)水平 提取腦組織海馬區(qū)中總蛋白，采用BCA蛋白檢測試劑盒進(jìn)行定量。將25 μg蛋白質(zhì)樣品用12% SDS凝膠電泳分離，并轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯膜，5%牛血清白蛋白封閉過夜，用兔抗大鼠cleaved caspase-3(1∶1 000)、 Bax(1∶1 000)、Bcl-2(1∶1 000)、RhoA (1∶1 000)、Rho-kinaseα單克隆抗體(1∶2 000)和Rho-kinaseβ單克隆抗體(1∶1 000)4℃孵育2 h，然后與山羊抗兔二抗(1∶1 000)在4℃的搖床上搖1 h，ECL曝光，Quantity One軟件分析目標(biāo)蛋白質(zhì)的相對表達(dá)水平。

2 結(jié)果

2.1羥丁酸鈉改善CI/RI大鼠自發(fā)活動和學(xué)習(xí)能力 與假手術(shù)組相比，模型組大鼠 10 min 內(nèi)爬行經(jīng)過的格子數(shù)目明顯增多(P<0.01)，選擇正確次數(shù)明顯減少(P<0.01)；與模型組相比，給藥低劑量組大鼠 10 min 內(nèi)爬行經(jīng)過的格子數(shù)目、選擇正確次數(shù)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，給藥中劑量組大鼠10 min 內(nèi)爬行經(jīng)過的格子數(shù)目減少(P<0.05)，選擇正確次數(shù)增加(P<0.05)，尼莫地平組和給藥高劑量組大鼠10 min內(nèi)爬行經(jīng)過的格子數(shù)目明顯減少(P<0.01)，選擇正確次數(shù)明顯增加(P<0.01)，說明高劑量羥丁酸鈉同尼莫地平一樣，能夠改善CI/RI大鼠自發(fā)活動,見圖1A、B。

2.2羥丁酸鈉改善CI/RI大鼠腦水腫 與假手術(shù)組相比，模型組大鼠腦組織含水量明顯增多(P<0.01)；與模型組相比，給藥低劑量組大鼠腦組織含水量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，給藥中劑量組大鼠腦組織含水量減少(P<0.05)，尼莫地平組和給藥高劑量組大鼠腦組織含水量明顯減少(P<0.01)，說明羥丁酸鈉高劑量同尼莫地平一樣，能夠改善CI/RI大鼠腦水腫，見圖2。

2.3羥丁酸鈉改善CI/RI大鼠腦損傷 假手術(shù)組大鼠腦組織顯微結(jié)構(gòu)正常，神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)正常，排列整齊，細(xì)胞質(zhì)飽滿，細(xì)胞核清晰；模型組神經(jīng)細(xì)胞體積變小，細(xì)胞核出現(xiàn)皺縮，存在嚴(yán)重的炎癥因子浸潤；與模型組相比，給藥各組和尼莫地平組大鼠神經(jīng)細(xì)胞體積變小、細(xì)胞核皺縮和炎癥因子浸潤情況均有不同程度改善，見圖3。

2.4羥丁酸鈉改善CI/RI大鼠腦細(xì)胞凋亡 與假手術(shù)組相比，模型組大鼠腦組織細(xì)胞凋亡率明顯提高(P<0.01), cleaved caspase-3 和Bax 表達(dá)明顯上調(diào)、Bcl-2 表達(dá)明顯下調(diào)(P<0.01);與模型組相比，給藥低劑量組大鼠腦組織細(xì)胞凋亡率、cleaved caspase-3、Bax 和Bcl-2 表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),給藥中劑量組大鼠腦組織細(xì)胞凋亡率、cleaved caspase-3、 Bax 和Bcl-2表達(dá)水平降低(P<0.05),尼莫地平組和給藥高劑量組大鼠腦組織細(xì)胞凋亡率明顯降低(P<0.01), cleaved caspase-3 和Bax 表達(dá)明顯下調(diào)、Bcl-2表達(dá)明顯上調(diào)(P<0.01),說明高劑量羥丁酸鈉同尼莫地平一樣,能夠改善CI/RI大鼠腦細(xì)胞凋亡，見圖4。

圖1 各組大鼠自發(fā)活動和學(xué)習(xí)記憶能力 Fig.1 Spontaneous activity and learning and memory ability of rats in each group

圖3 HE染色觀察腦損傷情況(×400)Fig.3 Brain damage observed by HE staining(×400)

圖4 各組大鼠腦細(xì)胞凋亡情況Fig.4 Brain cell apoptosis of rats in each group

2.5羥丁酸鈉抑制CI/RI大鼠Rho/Rho 激酶信號通路 與假手術(shù)組相比,模型組大鼠腦組織中RhoA、Rho-kinaseα和Rho-kinaseβ mRNA 表達(dá)、蛋白表達(dá)明顯上調(diào)(P<0.01);與模型組相比,尼莫地平組和給藥低劑量組大鼠腦組織中RhoA、Rho-kinaseα和Rho-kinaseβ mRNA 表達(dá)、蛋白表達(dá)水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),給藥中劑量組大鼠腦組織中RhoA、Rho-kinaseα和Rho-kinaseβ mRNA 表達(dá)、蛋白表達(dá)下調(diào)(P<0.05),給藥高劑量組大鼠腦組織中RhoA、Rho-kinaseα和Rho-kinaseβ mRNA 表達(dá)、蛋白表達(dá)明顯下調(diào)(P<0.01),說明高劑量羥丁酸鈉可抑制CI/RI大鼠Rho/Rho 激酶信號通路，見圖5。

圖5 各組大鼠RhoA、Rho-kinaseα和Rho-kinaseβ 表達(dá)Fig.5 RhoA,Rho-kinaseα and Rho-kinaseβ expressions of rats in each group

圖6 羥丁酸鈉對CI/RI大鼠腦損傷的影響

2.6羥丁酸鈉通過Rho/Rho激酶信號通路減輕CI/RI大鼠腦損傷 與模型組相比，給藥高劑量組大鼠10 min內(nèi)爬行經(jīng)過的格子數(shù)目、腦含水量及腦組織凋亡率明顯降低(P<0.01)，選擇正確次數(shù)明顯增多(P<0.01)，腦損傷明顯減輕，水仙環(huán)素組大鼠10 min內(nèi)爬行經(jīng)過的格子數(shù)目、腦含水量及腦組織凋亡率明顯提高(P<0.01)，選擇正確的次數(shù)明顯減少(P<0.01)，腦損傷明顯加重；與給藥高劑量組相比，給藥高劑量+水仙環(huán)素組大鼠10 min內(nèi)爬行經(jīng)過的格子數(shù)目、腦含水量及腦組織凋亡率明顯提高(P<0.01)，選擇正確次數(shù)明顯減少(P<0.01)，腦損傷明顯加重，說明羥丁酸鈉通過Rho/Rho激酶信號通路減輕CI/RI大鼠腦損傷，見圖6。

3 討論

腦缺血是神經(jīng)內(nèi)科常見疾病，主要治療方式為溶栓，但血液再灌注會大腦繼發(fā)性損傷，CI/RI損傷是導(dǎo)致成年患者死亡和殘疾的最常見病理，療效不理想[12-14]。因此，急需闡明藥物對CI/RI的作用及機(jī)制。

羥丁酸鈉是常用麻醉藥物，起效慢、毒性小、無鎮(zhèn)痛和肌松作用，用于誘導(dǎo)麻醉和維持麻醉，是中樞神經(jīng)抑制性遞質(zhì)γ-羥基丁酸的中間代謝產(chǎn)物，通過γ-羥基丁酸調(diào)節(jié)通道使神經(jīng)細(xì)胞膜超級化、降低神經(jīng)元興奮性、減少CI/RI損傷[15，16]。研究表明，羥丁酸鈉不僅具有較強(qiáng)的氧自由基清除及抗脂質(zhì)過氧化作用，還可抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡，保護(hù)腦組織[17]。本研究發(fā)現(xiàn)，羥丁酸鈉能夠改善CI/RI損傷大鼠自發(fā)活動情況、記憶能力、腦水腫、腦損傷、腦細(xì)胞凋亡，并抑制Rho/Rho激酶信號通路。

Rho/Rho激酶信號通路是體內(nèi)普遍存在的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，通過調(diào)節(jié)細(xì)胞肌動蛋白骨架的聚合狀態(tài)，參與調(diào)控細(xì)胞增殖與凋亡、細(xì)胞形態(tài)維持、基因轉(zhuǎn)錄、細(xì)胞黏附與遷移、平滑肌收縮等生物學(xué)行為，參與多種疾病發(fā)生發(fā)展，還可通路通過調(diào)節(jié)神經(jīng)細(xì)胞遷移、增殖、軸突引導(dǎo)和再生，參與阿爾茨海默病、中風(fēng)、癲癇等神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)生，在缺血，缺氧和炎癥條件下，Rho/Rho激酶信號通路被異常激活[18-20]。本研究發(fā)現(xiàn)，Rho/Rho激酶信號通路激活劑水仙環(huán)素能夠降低CI/RI損傷大鼠自發(fā)活動情況、記憶能力，增加腦水腫、腦損傷、腦細(xì)胞凋亡。抑制Rho/Rho激酶信號通路能夠減輕缺血再灌注損傷[6]。本研究發(fā)現(xiàn)，添加Rho/Rho激酶信號通路激活劑水仙環(huán)素能夠逆轉(zhuǎn)羥丁酸鈉對CI/RI損傷大鼠自發(fā)活動情況、記憶能力、腦水腫、腦損傷、腦細(xì)胞凋亡的改善，說明羥丁酸鈉通過Rho/Rho激酶信號通路改善CI/RI大鼠自發(fā)活動情況、記憶能力、腦水腫、腦損傷、腦細(xì)胞凋亡。綜上所述，羥丁酸鈉通過抑制Rho/Rho激酶信號通路減輕大鼠腦損傷，為CI/RI治療提供參考。