SOX2在胰腺癌干細(xì)胞干性維持及對化療敏感性的作用及機制研究

陶 洪 吳福道 張小靜 胡 芳

(四川省達(dá)州市中心醫(yī)院腫瘤科，達(dá)州 635000)

胰腺癌是惡性程度最高的腫瘤之一，目前臨床治療手段有限，轉(zhuǎn)移快，死亡率高，對人類健康造成巨大威脅[1]。目前，早期胰腺癌患者主要采取手術(shù)治療，預(yù)后相對較好，然而絕大部分患者發(fā)現(xiàn)時已是中晚期，治療只能以放化療為主，控制率低，復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移率高，預(yù)后極差，此外，化療耐藥是導(dǎo)致胰腺癌治療效果不理想的重要原因[2-4]。近年來，醫(yī)學(xué)研究越來越精準(zhǔn)化，越來越多的證據(jù)表明腫瘤干細(xì)胞的存在是腫瘤復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移及耐藥的主要原因，然而腫瘤干細(xì)胞在腫瘤發(fā)病中的具體機制尚未完全闡明[5,6]。因此，進一步探討胰腺癌干細(xì)胞在干性維持及耐藥性中的作用機制，對于改善中晚期患者的預(yù)后極為重要。轉(zhuǎn)錄因子SOX2(sex determining region Y-box2)是SOX區(qū)域Y相關(guān)的HMG(high mobility group)蛋白家族成員之一，在哺乳動物的生長發(fā)育中起重要作用[7]。研究發(fā)現(xiàn)SOX2是干細(xì)胞自我更新維持多項分化潛能的重要因子，在乳腺癌、肝癌以及非小細(xì)胞肺癌等腫瘤中均出現(xiàn)差異表達(dá)，且通過調(diào)控腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲轉(zhuǎn)移等過程促進腫瘤細(xì)胞惡性進展，在腫瘤干細(xì)胞的干性維持中亦起著關(guān)鍵調(diào)控作用[8-13]。本研究以上述背景為基礎(chǔ)，以PCSC及胰腺癌細(xì)胞株P(guān)ACN-1為研究對象，通過多種實驗驗證SOX2在胰腺癌干細(xì)胞干性維持以及化療耐藥中的作用機制。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1試劑 胰腺癌細(xì)胞株P(guān)ACN-1(上海生命科學(xué)院細(xì)胞和生物化學(xué)研究所)；堿性成纖維細(xì)胞生長因子、表皮生長因子均購自(美國Gibco公司)；MTT增殖檢測、細(xì)胞凋亡檢測試劑盒(南京凱基生物技術(shù)有限公司)；RIPA組織裂解液(北京索萊寶科技有限公司)；蛋白濃度檢測試劑BCA液(美國Thermo公司)；Sh-SOX2 慢病毒(上海吉凱基因公司)；SOX2引物(廣州銳博生物科技有限公司)；兔抗人SOX2抗體(ab97959)、兔抗人Oct4抗體(ab181557)、兔抗人Nanog抗體(ab109250)、cyclinD1(ab16663)、兔抗人Caspase-3抗體(ab32351)、兔抗人Caspase-9抗體(ab32539)(abcam公司)；鼠抗人GAPDH抗體(60004-1-Ig，proteintech公司)；吉西他濱(江蘇倍達(dá)醫(yī)藥科技有限公司)。

1.1.2儀器 倒置顯微鏡(日本Olympus公司)；流式細(xì)胞儀(美國BD 公司)；高速離心機(德國Beckman公司)；恒溫?fù)u床(上海世平實驗設(shè)備有限公司)；凝膠電泳儀(美國Bio-Rad公司)；酶標(biāo)儀(美國Thermo公司)。

1.2方法

1.2.1PACN-1細(xì)胞分離和PCSC的培養(yǎng) 將液氮中取出的PACN-1置于37℃恒溫水浴鍋內(nèi)，使細(xì)胞快速復(fù)溫，待完全溶解后800 r/min離心3 min，棄上清，取1 ml含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基重懸后移至25 cm的小瓶中培養(yǎng)，以上操作均在超凈工作臺內(nèi)完成，待細(xì)胞長滿后轉(zhuǎn)移至無血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)(含有表皮生長因子和堿性成纖維細(xì)胞生長因子)。顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，2周左右時懸浮細(xì)胞腫瘤球開始形成，流式細(xì)胞儀分選CD133+的PCSC，無血清培養(yǎng)基中擴大培養(yǎng)。

1.2.2Sh-SOX2病毒轉(zhuǎn)染及穩(wěn)轉(zhuǎn)株篩選 取對數(shù)生長期的PCSC細(xì)胞接種至6孔板中，將包裝質(zhì)粒以及目的質(zhì)粒轉(zhuǎn)入293T中，48 h后收集病毒，按說明書將慢病毒轉(zhuǎn)染試劑polybrene與Sh-SOX2、Sh-NC轉(zhuǎn)染至細(xì)胞中，37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。8 h后更換新的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。2 μg/ml嘌呤霉素篩選出成功敲除SOX2的細(xì)胞株，擴大培養(yǎng)。此外，Rescue組先轉(zhuǎn)染Sh-SOX2，并構(gòu)建穩(wěn)轉(zhuǎn)株后，再轉(zhuǎn)入SOX2過表達(dá)質(zhì)粒(PcDNA3.1-SOX2)作為Rescue組。

1.2.3MTT檢測細(xì)胞增殖能力 取Sh-SOX2慢病毒轉(zhuǎn)染48 h后的各組細(xì)胞，0.25%胰酶消化后制成單細(xì)胞懸液，玻璃板計數(shù)后接種于96孔板(3000個/孔)，每個轉(zhuǎn)染組細(xì)胞設(shè)6個復(fù)孔，放至37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，分別在鋪板后第0、1、2、3、4、5天測定570 nm波長處各組細(xì)胞的吸光度 (OD值)。150 μl培養(yǎng)基中加入20 μl MTT工作液，培養(yǎng)箱中孵育6 h后待活細(xì)胞與MTT試劑完全結(jié)合后棄上清，DMSO溶解紫色結(jié)晶，測定OD值，重復(fù)3次。

1.2.4軟瓊脂克隆形成實驗檢測腫瘤細(xì)胞干性 取對數(shù)生長期的PCSC細(xì)胞，0.25%胰酶消化后離心，重懸，制成單細(xì)胞懸液。5%的瓊脂糖高溫滅菌后42℃水浴，加入9倍體積完全培養(yǎng)基混勻，使瓊脂糖終濃度為0.5%，取0.8 ml上述液體澆注至24孔板，室溫凝固。同時取0.6 ml 50℃的5%瓊脂糖加入9.4 ml 500個細(xì)胞的培養(yǎng)基中，迅速混勻，取0.8 ml鋪至底層凝脂，室溫凝固后放置細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每組設(shè)置2個復(fù)孔，在顯微鏡下觀察并拍照，細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)14～16 d。

1.2.5流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡 用無EDTA的胰酶消化轉(zhuǎn)染SOX2沉默慢病毒載體72 h后的各組細(xì)胞，PBS洗3次后，收集轉(zhuǎn)染組細(xì)胞，按照說明書分別加入Binding Buffer、7-ADD以及Annexin V-APC染液，混勻后室溫避光孵育10～15 min。流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率。

1.2.6Western blot檢測各組細(xì)胞CyclinD1、Caspase-3、Caspase-9蛋白的表達(dá)情況 收集各處理組(NC、Sh-SOX2及Rescue組)的PCSC細(xì)胞，加入120 μl 含有1%PMSF的RIPA細(xì)胞冰上裂解15 min后刮刀刮取細(xì)胞(超聲破碎儀裂解10 min)；離心(14 000 g，4℃，30 min)，BCA 法測定細(xì)胞蛋白濃度，SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳、濕轉(zhuǎn)、8%脫脂奶粉封閉3 h，一抗孵育過夜，二抗孵育2 h，TBST洗滌2次后，化學(xué)發(fā)光底物曝光條帶。GAPDH 作為內(nèi)參。

2 結(jié)果

2.1PCSC的篩選及鑒定 將PACN-1腫瘤球利用流式細(xì)胞儀篩選出CD133+細(xì)胞，并將CD133+細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)后收集足量細(xì)胞提取蛋白，結(jié)果顯示CD133+細(xì)胞中干性相關(guān)基因Oct4、Nanog的表達(dá)顯著高于CD133-細(xì)胞中的表達(dá)，表明篩選成功。此外SOX2蛋白在CD133+的細(xì)胞中的表達(dá)顯著升高，見圖1，提示CD133+細(xì)胞為PCSC細(xì)胞。

2.2MTT檢測抑制PCSC中SOX2的表達(dá)對細(xì)胞增殖能力影響 與對照組相比，Sh-SOX2組細(xì)胞增殖能力顯著降低，過表達(dá)SOX2后，增殖能力得到恢復(fù)，見圖2，SOX2促進胰腺癌干細(xì)胞增殖。

圖1 Western blot檢測流式細(xì)胞篩選CD133+和CD133-細(xì)胞中干性相關(guān)基因(Oct4、Nanog)及SOX2蛋白的表達(dá)Fig.1 Expression of stemness related genes (Oct4,Nanog) and SOX2 protein in CD133+ and CD133- cells screened by flow cytometry detected by Western blot

圖2 MTT檢測SOX2對細(xì)胞增殖活性的影響Fig.2 Effect of Sox2 on cell proliferation by MTT Note: Compared with Sh-NC,*.P<0.05；compared with Sh-SOX2,#.P<0.05.

圖3 軟瓊脂克隆實驗檢測SOX2表達(dá)對PCSC干性的影響Fig.3 Effect of SOX2 expression on stemness of PCSC detected by soft agar assay

2.3軟瓊脂克隆實驗檢測SOX2對PCSC干性的影響 軟瓊脂克隆實驗顯示Sh-SOX2組細(xì)胞的克隆形成能力顯著降低(P<0.05)，見圖3。

2.4MTT檢測各組對吉西他濱的耐藥性 2 μg/ml吉西他濱處理48 h后，檢測并統(tǒng)計各組細(xì)胞的IC50值，結(jié)果提示，與對照組相比，Sh-SOX2組細(xì)胞的IC50值明顯降低，與Sh-SOX2組相比，Rescue組細(xì)胞的IC50值部分恢復(fù)(P<0.05)，見圖4。

2.5流式檢測吉西他濱干預(yù)后各組細(xì)胞的凋亡比

例 2 μg/ml吉西他濱處理48 h后，流式細(xì)胞儀檢測各組細(xì)胞的凋亡率，結(jié)果提示，與對照組相比，Sh-SOX2組細(xì)胞的凋亡率明顯升高，與Sh-SOX2組相比，Rescue組細(xì)胞的凋亡率明顯降低，見圖5。

圖4 MTT法檢測SOX2對吉西他濱IC50值Fig.4 Detection of IC50 value of SOX2 to gemcitabine by MTTNote: Compared with Sh-NC，*.P<0.05.

圖5 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡Fig.5 Apoptosis was detected by flow cytometry

圖6 Western blot檢測各處理組Caspase-3及Caspase-9蛋白的表達(dá)水平Fig.6 Western blot was used to detect expression level of Caspase-3 and Caspase-9 in each treatment group

2.6Western blot檢測SOX2對CSC凋亡蛋白Caspase-3、Caspase-9表達(dá)的影響 與對照組相比，Sh-SOX2組Caspase-3及Caspase-9表達(dá)水平顯著升高，Rescue組較Sh-SOX2組Caspase-3及Caspase-9表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)，見圖6。

3 討論

胰腺癌是死亡率最高的惡性腫瘤之一，患者5年生存率僅約8%，胰腺導(dǎo)管腺癌是其最常見的類型，且早期診斷率低、惡性程度高、易發(fā)生放化療抵抗[14]。研究發(fā)現(xiàn)，吉西他濱耐藥是導(dǎo)致胰腺癌化療失敗的主要原因。因此，進一步闡明胰腺癌患者吉西他濱耐藥機制對于提高中晚期患者療效，改善患者預(yù)后至關(guān)重要。干細(xì)胞是機體中存在的一群具有自我更新及多項分化潛能的細(xì)胞。近年來，多項研究提示腫瘤干細(xì)胞的存在是導(dǎo)致腫瘤復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移的主要原因，且與化療耐藥密切相關(guān)。有研究發(fā)現(xiàn)胰腺癌中也存在腫瘤干細(xì)胞，但其在胰腺癌中的作用機制尚未完全闡明。腫瘤干細(xì)胞的存在是導(dǎo)致腫瘤無法根治的主要原因[15，16]。因此，尋找腫瘤干細(xì)胞致癌及化療耐藥的具體機制將為腫瘤治療提供新的策略。

SOX2是機體重要的轉(zhuǎn)錄因子，屬于SOX基因家族的一員，在機體的生長發(fā)育、神經(jīng)發(fā)育及血細(xì)胞形成等過程中均起重要作用[17]。研究發(fā)現(xiàn)SOX2是一個腫瘤細(xì)胞干性相關(guān)基因，在腫瘤細(xì)胞增殖以及侵襲轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要調(diào)節(jié)作用。Yao等[18]發(fā)現(xiàn)SOX2可促進三陰乳腺癌的增殖及侵襲轉(zhuǎn)移；Wei等[19]發(fā)現(xiàn)SOX2可通過調(diào)控PI3K/AKT通路促進膽管癌細(xì)胞的增殖及侵襲轉(zhuǎn)移。研究發(fā)現(xiàn)SOX2與肝細(xì)胞癌干細(xì)胞干性相關(guān)，且與胃癌干細(xì)胞增殖相關(guān)[20，21]。SOX2可通過調(diào)控細(xì)胞周期相關(guān)蛋白CyclinD1、cmyc等加快細(xì)胞周期，可通過抑制凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)抑制細(xì)胞凋亡[22]。Caspase-3與Caspase-9為含半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶家族成員[23]。因此，本研究假設(shè)在胰腺癌中，SOX2可能與胰腺癌干細(xì)胞干性及吉西他濱化療耐藥相關(guān)，且該功能的實現(xiàn)是通過調(diào)控細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白實現(xiàn)的。本研究通過懸浮腫瘤球形成實驗從人胰腺癌細(xì)胞系PACN-1中分離出CD133+的PCSC，采用Western blot技術(shù)、軟瓊脂克隆實驗、慢病毒沉默技術(shù)、MTT實驗、流式細(xì)胞凋亡檢測技術(shù)等來證明設(shè)想。結(jié)果提示：SOX2與胰腺癌干細(xì)胞干性維持以及吉西他濱化療耐藥顯著相關(guān)。且SOX2通過調(diào)控Caspase-3及Caspase-9蛋白進而調(diào)控細(xì)胞凋亡、介導(dǎo)胰腺癌細(xì)胞吉西他濱耐藥。

綜上所述，SOX2在CD133+的胰腺癌干細(xì)胞中顯著高表達(dá)，抑制其表達(dá)可以顯著降低胰腺癌細(xì)胞干性，降低其對吉西他濱的耐藥性，機制可能是通過作用于凋亡相關(guān)蛋白Caspase-3、Caspase-9的表達(dá)。本研究為治療胰腺癌提供新的策略，SOX2可能成為胰腺癌治療的潛在靶點。