miR-199a-5p靶向PDCD5基因調(diào)控幼年類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞的增殖和凋亡

符藝影 許志有 韓 萍 董戰(zhàn)玲 鄭詩華 王小花

(海口市第三人民醫(yī)院兒科，海口 571100)

幼年型類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(juvenile rheumatoid arthritis，JRA)是一種以慢性關(guān)節(jié)炎為主要特征的小兒時(shí)期常見的結(jié)締組織病，對(duì)兒童危害較大，發(fā)病率大約7/10萬[1]。近來的研究表明軟骨細(xì)胞在抑制RA的軟骨破壞中具有重要作用[2]，理解軟骨細(xì)胞增殖和凋亡的分子機(jī)制可能為RA的治療提供新的潛在治療思路。

研究表明，miR-199a-5p在大鼠脊髓缺血/再灌注損傷(IRI)中表達(dá)降低，七氟烷可通過增加miR-199a-5p表達(dá)，減少細(xì)胞凋亡，保護(hù)大鼠脊髓細(xì)胞[3]。miR-199a-5p在小鼠肝臟IRI模型中表達(dá)明顯下調(diào)，其能夠在缺氧/復(fù)氧過程中對(duì)細(xì)胞起到保護(hù)作用[4]。而miR-199a-5p在RA中對(duì)軟骨細(xì)胞是否有保護(hù)作用還不清楚。通過TargetScan預(yù)測(cè)，PDCD5的3′UTR序列中含有與miR-199a-5p互補(bǔ)的核苷酸序列，可能是miR-199a-5p的下游靶基因。程序化細(xì)胞死亡5(programmed cell death 5,PDCD5)在骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)，可能參與骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞的凋亡過程[5]。PDCD5在SD大鼠腦IRI損傷后海馬組織中、H/R損傷的心肌細(xì)胞和I/R后的心肌細(xì)胞中表達(dá)升高，抑制PDCD5的表達(dá)，可抑制細(xì)胞凋亡或增加細(xì)胞存活率[6-8]。miR-199a-5p在RA軟骨細(xì)胞中的表達(dá)、對(duì)其影響以及miR-199a-5p與PDCD5在RA中的關(guān)系還尚未可知。

本課題研究miR-199a-5p影響RA軟骨細(xì)胞增殖、凋亡的分子機(jī)制，并探討PDCD5在此過程中的作用，以期為RA的臨床治療提供新的方向。

1 資料與方法

1.1資料

1.1.1一般資料 人RA軟骨細(xì)胞和人正常軟骨細(xì)胞由分離培養(yǎng)所得，樣本采用?？谑械谌嗣襻t(yī)院骨科10例RA患者行人工關(guān)節(jié)置換術(shù)廢棄的關(guān)節(jié)軟骨標(biāo)本[男6例，女4例，年齡5～9歲，平均年齡(6.1±1.52)歲]和4例因下肢損毀性創(chuàng)傷手術(shù)廢棄的膝正常關(guān)節(jié)軟骨標(biāo)本[男2例，女2例，年齡4～10歲，平均年齡(7.0±2.94)歲]，與所有患者家屬簽訂知情同意書，RA患者的臨床診斷特征均符合美國風(fēng)濕病學(xué)會(huì)標(biāo)準(zhǔn)。

1.1.2主要試劑 高糖DMEM培養(yǎng)基和胎牛血清(FBS)購自美國Gibco公司；胰蛋白酶Trypsin、四氮唑藍(lán)(MTT)和二甲基亞砜(DMSO)購自Sigma-Aldrich公司；抗PDCD5抗體、抗CyclinD1抗體、抗p21抗體、抗p27抗體、抗Bcl-2抗體、抗Bax抗體、抗cleaved-caspase3抗體和抗GAPDH抗體購自英國Abcam公司；引物、miR-199a-5p模擬物(miR-199a-5p)、抑制劑(anti-miR-199a-5p)、PDCD5的過表達(dá)載體(pcDNA-PDCD5)、干擾物(si-PDCD5)、空載體和陰性對(duì)照(miR-NC、anti-miR-NC和si-NC)及雙熒光載體的構(gòu)建購自上海吉瑪制藥有限公司；雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)購自美國Promega公司；Ⅱ型膠原酶、TRIzol試劑、real-time PCR 試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒(RT-PCR)、Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑購自美國Invitrogen公司；流式細(xì)胞儀和凋亡檢測(cè)試劑盒購自美國BD公司；光學(xué)顯微鏡、全自動(dòng)酶標(biāo)儀、發(fā)光儀及Real-time PCR儀購自美國Bio-Rad公司。

1.2方法

1.2.1軟骨細(xì)胞分離和培養(yǎng)[9]細(xì)胞分離：將上述關(guān)節(jié)軟骨組織置于含1%青-鏈霉素的PBS溶液中，無菌條件下避開增生骨贅表面的薄層纖維軟骨，將軟骨組織剪成約1 mm3的軟骨塊，PBS清洗2遍，收集軟骨塊，加入約5倍體積的含0.25%胰蛋白酶和10%FBS的DMEM培養(yǎng)液(含1%青-鏈霉素)，37℃孵育消化30 min，棄消化，加入含0.2%Ⅱ型膠原酶和10%FBS的DMEM培養(yǎng)液(含1%青-鏈霉素)，37℃搖床振蕩消化約16 h，離心，棄上清，用高糖DMEM培養(yǎng)液洗滌3遍，經(jīng)200目鋼網(wǎng)過濾，即為處理好的軟骨細(xì)胞。

細(xì)胞培養(yǎng)：用含10%FBS的高糖DMEM培養(yǎng)液(添加100 U/ml青霉素+100 μg/ml鏈霉素)，在飽和濕度的37℃ 5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每48 h換一次培養(yǎng)液，待細(xì)胞鋪滿瓶底或融合度達(dá)80%～90%時(shí)收集細(xì)胞和消化傳代。

1.2.2細(xì)胞轉(zhuǎn)染 將軟骨細(xì)胞用培養(yǎng)液稀釋至1×106個(gè)/ml，接種于6孔板中，細(xì)胞培養(yǎng)至融合度達(dá)80%～90% 時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。用無血清OptiMEM培養(yǎng)液稀釋Lipofectamine 2000、miR-199a-5p模擬物(miR-199a-5p)、抑制劑(anti-miR-199a-5p)、PDCD5的過表達(dá)載體(pcDNA-PDCD5)、干擾物(si-PDCD5)、空載體和陰性對(duì)照(miR-NC、anti-miR-NC和si-NC)及雙熒光載體，然后取等體積脂質(zhì)體與等體積各組載體或片段混合，室溫孵育20 min，加入培養(yǎng)好的軟骨細(xì)胞中，混勻后繼續(xù)培養(yǎng)，6 h后換成完全培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)染48 h，收集細(xì)胞驗(yàn)證轉(zhuǎn)染效果，進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.3qRT-PCR檢測(cè)RNA的表達(dá) 收集各組軟骨細(xì)胞，用TRIzol提取細(xì)胞總RNA，-80℃保存。然后按照反轉(zhuǎn)錄PCR試劑盒說明書合成cDNA，以合成的cDNA為模板，按照 real-time PCR的說明書進(jìn)行qRT-PCR反應(yīng)，合成PDCD5 mRNA和miR-199a-5p，反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃5 min；95℃40 s、58℃45 s、72℃45 s，40個(gè)循環(huán)；72℃10 min。用2-ΔΔCt方法進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

1.2.4MTT實(shí)驗(yàn)測(cè)定細(xì)胞活性 收集培養(yǎng)好的軟骨細(xì)胞，消化細(xì)胞，用培養(yǎng)液稀釋細(xì)胞為1×104個(gè)/ml，按照每孔200 μl細(xì)胞/孔接種于96微孔板中，繼續(xù)培養(yǎng)，分別在24 h、48 h、72 h進(jìn)行 MTT 實(shí)驗(yàn)，每孔加入 20 μl MTT溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄上清，然后每孔加入150 μl DMSO，室溫振蕩孵育10 min，酶標(biāo)儀測(cè)定OD490 nm處的吸光度(A)值。

1.2.5流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率 將轉(zhuǎn)染后的各組軟骨細(xì)胞培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長期，用培養(yǎng)液稀釋細(xì)胞為1×105個(gè)/ml，接種于24孔板中，繼續(xù)培養(yǎng)72 h，收集細(xì)胞PBS緩沖液洗滌2次，根據(jù)Annexin V/PI kit說明書操作，用100 μl標(biāo)記緩沖液重懸細(xì)胞，然后加入5 μl膜聯(lián)蛋白V-FITC(Annexin V-FITC)和 10 μl碘化丙啶(propidium iodide,PI)，室溫避光20 min，加入400 μl標(biāo)記緩沖液，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)分析細(xì)胞凋亡率。

1.2.6雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)實(shí)驗(yàn) 按照1.2.2的方法將構(gòu)建好的PDCD5野生型(WT-PDCD5)和突變型(MUT-PDCD5)雙熒光素酶報(bào)告載體，然后分別與miR-NC或miR-199a-5p共轉(zhuǎn)染培養(yǎng)好的軟骨細(xì)胞，轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)48 h，收集細(xì)胞，加入裂解緩沖液，室溫裂解20 min，離心收集上清，加入熒光素酶底物，發(fā)光儀檢測(cè)熒光素酶活性。以海腎熒光素酶活性為內(nèi)參照，計(jì)算相對(duì)螢火蟲熒光素酶活性。

1.2.7Western blot實(shí)驗(yàn) 收集各組軟骨細(xì)胞，加入RIPA裂解液，室溫裂解30 min，超聲破碎細(xì)胞，離心收集蛋白，檢測(cè)蛋白濃度。然后進(jìn)行SDS-PAGE，轉(zhuǎn)PVDF膜，脫脂奶粉室溫封閉2 h，分別加入一抗，抗CDCA5抗體(1∶1 000)、CyclinD1抗體(1∶1 000)、p21抗體(1∶1 000)、p27抗體(1∶1 500)、抗Bcl-2抗體(1∶1 000)、抗Bax抗體(1∶1 200)、抗cleaved-caspase3抗體(1∶1 000)和抗GAPDH抗體(1∶2 000)，4℃孵育過夜。洗膜2次，然后加入稀釋的二抗，室溫孵育2 h。以GAPDH為內(nèi)參照，分析蛋白水平。

2 結(jié)果

2.1miR-199a-5p和PDCD5在RA軟骨細(xì)胞和正常軟骨細(xì)胞中的表達(dá) qRT-PCR和Western blot結(jié)果表明，與normal組相比，在RA組軟骨細(xì)胞中miR-199a-5p的表達(dá)量顯著降低(P<0.05)，而PDCD5 mRNA和蛋白表達(dá)量則顯著升高(P<0.05)，見圖1。

2.2miR-199a-5p過表達(dá)可促進(jìn)RA軟骨細(xì)胞增殖 結(jié)果表明，與normal組相比，RA組miR-199a-5p表達(dá)量下降(P<0.05)，促增殖蛋白CyclinD1表達(dá)下降(P<0.05)，增殖負(fù)調(diào)控蛋白p21和p27表達(dá)量上升(P<0.05)，軟骨細(xì)胞增殖活性顯著下降(P<0.05)；與RA+miR-NC組相比，RA+miR-199a-5p組的miR-199a-5p表達(dá)量顯著升高(P<0.05)，CyclinD1表達(dá)上升(P<0.05)，p21和p27表達(dá)量降低(P<0.05)，軟骨細(xì)胞增殖活性顯著升高(P<0.05)，見圖2。

2.3過表達(dá)miR-199a-5p可抑制RA軟骨細(xì)胞凋亡 流式細(xì)胞術(shù)和Western blot結(jié)果表明，與normal組相比，RA組軟骨細(xì)胞凋亡率顯著上升(P<0.05)，抗凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)降低(P<0.05)，凋亡蛋白Bax和cleaved-caspase3表達(dá)量上升(P<0.05)；與RA+miR-NC組相比，RA+miR-199a-5p組軟骨細(xì)胞凋亡率顯著下降(P<0.05)，抗凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)升高(P<0.05)，凋亡蛋白Bax和cleaved-caspase3表達(dá)量降低(P<0.05)，見圖3。

2.4抑制PDCD5表達(dá)可促進(jìn)RA軟骨細(xì)胞增殖和抑制細(xì)胞凋亡 結(jié)果表明，與normal組相比，RA組的PDCD5蛋白表達(dá)量顯著升高(P<0.05)，CyclinD1表達(dá)降低(P<0.05)，p21表達(dá)量升高(P<0.05)，抗凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)降低(P<0.05)，凋亡蛋白Bax表達(dá)量上升(P<0.05)，細(xì)胞增殖活性降低(P<0.05)，凋亡率顯著升高(P<0.05)；與RA+si-NC組相比，RA+si-PDCD5組的PDCD5蛋白表達(dá)量降低(P<0.05)，CyclinD1表達(dá)升高(P<0.05)，p21表達(dá)量降低(P<0.05)，抗凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)升高(P<0.05)，凋亡蛋白Bax表達(dá)量降低(P<0.05)，細(xì)胞增殖活性升高(P<0.05)，凋亡率顯著降低(P<0.05)，見圖4。

圖1 miR-199a-5p和PDCD5在RA軟骨細(xì)胞和正常軟骨細(xì)胞中的表達(dá)Fig.1 Expression levels of miR-199a-5p and PDCD5 in RA chondrocytes and normal chondrocytesNote: A.Expression levels of miR-199a-5p in RA chondrocytes and normal chondrocytes；B.Expression levels of PDCD5 mRNA in RA chondrocyte and normal chondrocytes；C and D.Expression levels of PDCD5 protein in RA chondrocyte and normal chondrocytes,*.P<0.05 vs Normal group.

圖2 過表達(dá)miR-199a-5p對(duì)RA軟骨細(xì)胞增殖的影響Fig.2 Effect of overexpression of miR-199a-5p on proliferation of RA chondrocytesNote: A.Relative expression of miR-199a-5p in RA chondrocyte；B.Effect of overexpression of miR-199a-5p on proliferation of RA chondrocytes；C and D.Effect of overexpression of miR-199a-5p on the expression of proliferation-related proteins in chondrocytes,*.P<0.05 vs normal group；#.P<0.05 vs RA+miR-NC group.

圖3 miR-199a-5p過表達(dá)對(duì)RA軟骨細(xì)胞凋亡的影響Fig.3 Effect of overexpression of miR-199a-5p on apoptosis of RA chondrocytesNote: A.Flow cytometry was used to detect apoptosis of chondrocyte；B.Effects of overexpression of miR-199a-5p on cell apoptosis in RA chondrocyte；C and D.Effect of miR-199a-5p overexpression on the expression of apoptosis-related proteins in RA chondrocytes,*.P<0.05 vs normal group；#.P<0.05 vs RA+miR-NC group.

2.5miR-199a-5p靶向調(diào)控PDCD5的表達(dá) 通過Targetscan預(yù)測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，PDCD5的3′UTR序列中含有與miR-199a-5p互補(bǔ)的核苷酸序列，見圖5A。

圖4 過表達(dá)PDCD5對(duì)RA軟骨細(xì)胞增殖、凋亡的影響Fig.4 Effects of overexpression PDCD5 on proliferation and apoptosis of RA Note: A.Expression levels of proteins in chondrocyte detected by Western blot；B.Relative expression of PDCD5 protein in RA chondrocyte；C and D.Effects of inhibition of PDCD5 on cell proliferation and the expression of proliferation-related proteins in RA chondrocyte；E and F.Effects of inhibition of PDCD5 on cell apoptosis and the expression of apoptosis-related proteins in RA chondrocyte,*.P<0.05 vs miR-NC group；#.P<0.05 vs RA+si-NC group.

圖5 miR-199a-5p和PDCD5在RA軟骨細(xì)胞中的調(diào)控關(guān)系Fig.5 Regulatory relationship between miR-199a-5p and PDCD5 in RA Note: A.The sequence of PDCD5 3′UTR contains complementary nucleotide sequences with miR-199a-5p；B.Dual luciferase reporter assay；C and D.miR-199a-5p regulates the expression of PDCD5 protein,*.P<0.05 vs miR-NC group,#.P<0.05 vs anti-miR-NC group.

雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)結(jié)果如圖5B所示，與miR-NC組相比，miR-199a-5p組野生型WT-PDCD5的螢火蟲熒光素酶相對(duì)活性顯著下降(P<0.05)，而突變型MUT-PDCD5的螢火蟲熒光素酶相對(duì)活性沒有顯著變化。Western blot結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與miR-NC組相比，miR-199a-5p組的PDCD5表達(dá)量顯著降低(P<0.05)；與anti-miR-NC組相比，anti-miR-199a-5p組的PDCD5表達(dá)量顯著上升(P<0.05)，見圖5C、D。

圖6 過表達(dá)PDCD5逆轉(zhuǎn)了miR-199a-5p過表達(dá)對(duì)RA軟骨細(xì)胞增殖和凋亡的影響Fig.6 Overexpression of PDCD5 reversed effect of miR-199a-5p overexpression on proliferation and apoptosis of RA chondrocytesNote: A.Expression levels of proteins in chondrocyte detected by Western blot；B.Relative expression of PDCD5 protein in RA chondrocyte；C and D.Overexpression of PDCD5 reversed the effects of miR-199a-5p overexpression on proliferation and the expression of proliferation-related proteins of RA chondrocyte；E and F.Overexpression of PDCD5 reversed the effects of miR-199a-5p overexpression on apoptosis and the expression apoptosis-related proteins of RA chondrocyte.*.P<0.05 vs RA+miR-NC group；#.P<0.05 vs RA+miR-199a-5p+pcDNA group.

2.6PDCD5過表達(dá)逆轉(zhuǎn)了miR-199a-5p過表達(dá)對(duì)RA軟骨細(xì)胞增殖和凋亡的作用 結(jié)果顯示，與RA+miR-NC組相比，RA+miR-199a-5p組軟骨細(xì)胞中PDCD5表達(dá)量顯著下降(P<0.05)，增殖相關(guān)蛋白CyclinD1表達(dá)升高(P<0.05)，p21表達(dá)下降(P<0.05)，細(xì)胞增殖活性顯著升高(P<0.05)，抗凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)升高(P<0.05)，凋亡蛋白Bax表達(dá)下降(P<0.05)，細(xì)胞凋亡率顯著降低(P<0.05)；與RA+miR-199a-5p+pcDNA組相比，RA+miR-199a-5p+pcDNA-PDCD5組PDCD5表達(dá)量顯著升高(P<0.05)，CyclinD1表達(dá)下降(P<0.05)，p21表達(dá)升高(P<0.05)，細(xì)胞增殖活性顯著降低(P<0.05)，抗凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)降低(P<0.05)，凋亡蛋白Bax表達(dá)升高(P<0.05)，細(xì)胞凋亡率顯著升高(P<0.05)。見圖6。

3 討論

JRA比成人RA具有更多、更突出的全身癥狀，導(dǎo)致約20%患者關(guān)節(jié)永久損害和嚴(yán)重殘疾[10]，軟骨和骨組織的結(jié)構(gòu)損傷以及由此造成的關(guān)節(jié)破壞是RA的一個(gè)顯著特征[11]，闡明軟骨損傷和修復(fù)機(jī)制有助于理解RA發(fā)病機(jī)制，也有助于改進(jìn)現(xiàn)有的診斷和治療方法。

大量研究表明，miRNAs在RA患者的外周血、滑膜組織、滑膜成纖維細(xì)胞和滑膜液中異常表達(dá)，參與調(diào)控RASFs的增殖、凋亡和侵襲[12]，但在軟骨細(xì)胞中的研究較少。miR-199a在人惡性腫瘤中異常表達(dá)，miR-199a-5p在大鼠腦缺血再灌注損傷和大鼠潰瘍性結(jié)腸炎中表達(dá)上調(diào)，藥物可通過下調(diào)miR-199a-5p改善炎癥損傷[13-15]。miR-199a-5p在中樞神經(jīng)系統(tǒng)慢性炎癥性脫髓鞘疾病的多發(fā)性硬化(mulitple sclerosis，MS)患者血清中表達(dá)下調(diào)，可能作為MS患者復(fù)發(fā)鑒別的診斷指標(biāo)[16]。有研究表明，在中藥治療的骨關(guān)節(jié)炎的關(guān)節(jié)軟骨中miR-199a-5p表達(dá)升高[17]。miR-199a-5p在RA中的表達(dá)情況和作用尚不清楚。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在JRA軟骨細(xì)胞中miR-199a-5p表達(dá)量顯著降低，過表達(dá)miR-199a-5p可促進(jìn)JRA軟骨細(xì)胞增殖，抑制JRA軟骨細(xì)胞凋亡，說明miR-199a-5p在JRA中具有重要作用。

本研究通過生物信息學(xué)預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)，PDCD5的3′UTR中含有與miR-199a-5p互補(bǔ)的核苷酸序列，提示miR-199a-5p與PDCD5之間可能存在結(jié)合位點(diǎn)或調(diào)控關(guān)系，PDCD5在RA中可能也有調(diào)控作用。PDCD5在細(xì)胞凋亡和旁體細(xì)胞死亡中起重要作用，在培養(yǎng)基中添加外源重組PDCD5也能增強(qiáng)特定刺激引起程序性細(xì)胞死亡[18]。有研究表明，PDCD5還可通過PDCD5-TIP60-FOXP3通路促進(jìn)調(diào)節(jié)T細(xì)胞功能，參與免疫調(diào)節(jié)[19]。Wang等[20]發(fā)現(xiàn)，PDCD5在RA患者血漿和滑膜液中表達(dá)上調(diào)，與滑膜液中TNF-α表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，在血漿中與C反應(yīng)蛋白和血沉呈負(fù)相關(guān)。RA患者血清和滑膜液中PDCD5水平與IL-17水平呈負(fù)相關(guān)[21]，過表達(dá)PDCD5可促進(jìn)雷公藤甲素誘導(dǎo)的RA成纖維樣滑膜細(xì)胞凋亡，PDCD5影響RA發(fā)病機(jī)制[22]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，PDCD5在JRA軟骨細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)，抑制PDCD5表達(dá)可促進(jìn)JRA軟骨細(xì)胞增殖并抑制凋亡，與上述結(jié)果呼應(yīng)[22]。

本研究通過雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)和Western blot進(jìn)一步確認(rèn)，miR-199a-5p靶向調(diào)控PDCD5的表達(dá)，過表達(dá)PDCD5逆轉(zhuǎn)了miR-199a-5p過表達(dá)對(duì)軟骨細(xì)胞增殖和凋亡的作用，驗(yàn)證了兩者在JRA軟骨細(xì)胞中的調(diào)控關(guān)系。

本研究闡述了miR-199a-5p在JRA軟骨細(xì)胞靶向調(diào)控PDCD5的表達(dá)，影響軟骨細(xì)胞增殖和凋亡，在JRA發(fā)病機(jī)制中具有重要作用。綜上，本研究為JRA分子靶向治療提供了新的研究方向，miR-199a-5p和PDCD5有望成為JRA潛在治療靶點(diǎn)。