中緬邊境惡性瘧原蟲AMA1蛋白結構域Ⅱ的單倍體型和抗體應答相關性分析

洪明陽 于園超 周 丹 曹雅明 朱曉彤

(中國醫(yī)科大學基礎醫(yī)學院免疫教研室，沈陽 110122)

2017年全球有219萬瘧疾病例，43.5萬人死于瘧疾感染[1]。裂殖子期原蟲表面抗原誘導產(chǎn)生的抗體可阻斷原蟲侵襲紅細胞，并促進宿主免疫系統(tǒng)的調(diào)理性吞噬和抗體依賴性細胞毒作用，從而抑制紅內(nèi)期原蟲裂體增殖并阻斷感染患者發(fā)病[2,3]。因此，紅內(nèi)期疫苗在預防發(fā)病和防治重癥瘧疾方面具有廣泛的應用前景，而裂殖子期原蟲抗原為理想的紅內(nèi)期疫苗靶位。

惡性瘧原蟲裂殖子頂端膜抗原1(Plasmodiumfalciparumapical membrane antigen 1，PfAMA1)位于微線體，在裂殖子侵襲紅細胞前釋放并介導侵襲過程[4,5]。PfAMA1蛋白誘導產(chǎn)生的抗體可阻斷裂殖子體外侵襲宿主紅細胞[6]。鼠和靈長類動物的瘧疾模型研究顯示，AMA1蛋白可誘導宿主產(chǎn)生種屬特異性保護性抗體應答[7]。瘧疾流行區(qū)患者體內(nèi)常具有自然獲得性AMA1抗體，且抗體水平與瘧疾臨床預防密切相關[8]。Ⅱ期臨床實驗顯示，PfAMA1疫苗對非洲馬里流行區(qū)1～6歲兒童的有效性為65%，提示其作為疫苗候選抗原的可行性[9]。然而，大樣本分析顯示，PfAMA1蛋白胞外區(qū)含60個多態(tài)性位點，在各流行區(qū)有200余種單倍體型[10,11]。紅內(nèi)期瘧疾疫苗候選抗原的多態(tài)性會限制其廣泛應用。因此，全面了解PfAMA1的抗原多樣性和免疫應答特點可為開發(fā)和應用PfAMA1疫苗提供必要的理論依據(jù)。

PfAMA1蛋白胞外區(qū)包含DomainⅠ(DⅠ，149-302 aa)、DomainⅡ(DⅡ，320-418 aa)和DomainⅢ(DⅢ，443-509 aa)三個子結構域[12]。抗DⅠ和DⅡ的抗體可阻斷裂殖子侵襲宿主紅細胞[13,14]。DⅡ結構域具有相對保守的氨基酸序列，其內(nèi)部環(huán)形區(qū)域中含有特異性抗原表位，可被抑制瘧原蟲入侵紅細胞的4G2單克隆抗體識別[6]。上述結果提示以DⅡ區(qū)域作為紅內(nèi)期疫苗候選靶點的可行性。目前，尚無中緬邊境惡性瘧原蟲流行區(qū)pfama1基因DⅡ結構域單倍體型和抗體應答特點的相關報道。本文通過對中緬邊境地區(qū)惡性瘧分離株pfama1基因的單倍體型進行分析，結合流行區(qū)患者血清的ELISA檢測結果，查找流行區(qū)優(yōu)勢單倍體型和其誘導產(chǎn)生的抗體亞類，旨在為我國惡性瘧紅內(nèi)期疫苗的研制和應用提供前期基礎。

1 材料與方法

1.1材料 6～8周齡雌性BALB/c小鼠(北京實驗動物研究所)；Plasmodiumfalciparum3D7株和基因組DNA(gDNA)由本教研室保存。pET32a載體(Millipore，USA)，Rosetta(DE)Competent Cell、TaKaRa MiniBEST Universal Genomic DNA Extraction kit、TaKaRa MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction kit(TaKaRa)；KOD-Plus Neo (ToYoBo)；限制性內(nèi)切酶NotⅠ和BamHⅠ(NEB)；Infusion連接酶(Vazyme)，LB broth(Gibco)，快速質(zhì)粒小提試劑盒(TIANGEN)；HisPurTMNi-NTA Magnetic Beads(ThermoFisher)；Protein A(Sigma)；Goat anti-Mouse IgG(H+L)、mouse anti-his tag mAb(Abcam)；Secondary Antibody HRP conjugated、PierceTMECL Plus Western blot Substrate、96孔板(ThermoFisher)；Due Set ELISA試劑盒(R&D)；辣根過氧化物酶結合的抗人IgG/IgG1/IgG2a/IgG3/IgG4抗體(Chemicon)。

1.2方法

1.2.1樣本采集和基因組DNA提取 2013～2015年，于中緬邊境地區(qū)采集30例惡性瘧原蟲感染患者指尖血制備血樣干濾紙片，另外收集123例惡性瘧原蟲感染患者血清樣本及非瘧疾流行區(qū)43例正常人血清樣本。TaKaRa MiniBEST Universal Genomic DNA Extraction試劑盒提取血樣干濾紙片gDNA。

1.2.2pfama1基因DⅡ區(qū)域的PCR擴增和測序 采用引物pfama1_DⅡF (5′-GAATGTAGTTGATAAC-TGGG-3′)和pfama1_DⅡR(5′-GCTCTTTTTTCTT-CCCCCC-3′) 擴增pfama1基因(PlasmoDB ID:PF3D7_1133400)的DⅡ結構域。反應體系：10×KOD-Plus Neo 緩沖液1 μl，2 mmol/L dNTPs 1 μl，25 mmol/L MgSO40.8 μl，10 μmol/L 引物各 0.25 μl，KOD-Plus Neo 0.2單位，基因組DNA 模板1.0 μl。反應條件：95℃變性5 min；95℃變性15 s，56℃退火15 s，68℃ 延伸60 s，44個循環(huán)；68℃延伸5 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)TaKaRa MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction試劑盒純化后，送華大基因公司測序。

1.2.3DⅡ重組蛋白表達和免疫血清制備 采用PfAMA1-DⅡ-BamHⅠ F(5′-cgcggatccTGTGAAG-ATATACCACATGTAAATG-3′)和PfAMA1-DⅡ-NotⅠ R(5′-ttttccttttgcggccgcATCTAACATTTCATCATTT-CTTGAATTTG-3′)引物擴增pfama1基因DⅡ區(qū)域。純化PCR產(chǎn)物后，采用Infusion連接酶連接入BamHⅠ和NotⅠ酶切線性化的pET32a(+)載體，構建pET32a(+)-PfAMA1-DⅡ表達載體，轉化入Rosetta(DE)Competent Cell宿主菌，質(zhì)粒小提并測序鑒定。

PfAMA1-DⅡ重組蛋白(rPfAMA1-DⅡ)經(jīng)1 mmol/L IPTG 20℃過夜誘導表達。HisPurTMNi-NTA Magnetic Beads純化后，采用10%的SDS-PAGE電泳分離。半干法轉膜，5%脫脂奶粉封閉，TBS-T漂洗后，采用抗his標簽抗體(1∶2 000)標記和HRP標記的山羊抗小鼠IgG抗體分別標記一抗和二抗。ECL發(fā)光方法檢測。

6～8周齡BALB/c小鼠，隔周皮下免疫50 μg rPfAMA1-DⅡ重組蛋白(首次免疫采用完全弗氏佐劑，二次和三次免疫采用不完全弗氏佐劑)制備多克隆抗體。3次免疫后第10天收集小鼠血清，采用Protein A純化。Western blot方法檢測抗PfAMAI-DⅡ免疫血清的特異性。采用ELISA法檢測血清中抗體滴度。

1.2.4惡性瘧原蟲體外裂殖子侵襲抑制實驗 常規(guī)方法體外培養(yǎng)惡性瘧原蟲[15]，并采用40% 和70% percoll分離液提取晚期成熟的裂殖體期原蟲，調(diào)整培養(yǎng)體系中原蟲血癥為1%后置于24孔板中培養(yǎng)(紅細胞壓積2.5%，總體系2 ml)。在對照組(NC)和免疫組(DⅡ)中分別加入正常小鼠IgG抗體和抗PfAMA1-DⅡ純化后的免疫血清，濃度梯度：1.5 mg/ml，0.75 mg/ml 和0.31 mg/ml。各實驗組每個濃度梯度設3個復孔。培養(yǎng)10 h后，姬姆薩染色計數(shù)原蟲血癥(P)。裂殖子侵襲抑制率=100-(DⅡ組原蟲血癥均值/NC組原蟲血癥均值)× 100%。

1.2.5序列比對和單倍體型分析 以3D7株為參照，MEGA7.0軟件分析30例中緬邊境樣本pfama1基因DⅡ區(qū)域序列[16]。DnaSP v6軟件計算單倍型(number of haplotypes,H)和單倍型多樣度(haplotype diversity，Hd)[17]。

1.2.6抗體及其亞類的ELISA檢測 采用酶聯(lián)免疫吸附試驗檢測總IgG及IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。0.5 μg/孔PfAMA1-DⅡ重組蛋白包被96孔板，4℃過夜。1%牛血清白蛋白(BSA)封閉2 h后，采用含0.5% Tween-20的PBS緩沖液(0.5% Tween-20/PBS)洗滌5次。每孔加入100 μl稀釋血清(總IgG，1∶200倍稀釋血清；IgG各亞類，1∶50倍稀釋血清)，37℃下孵育2 h后，采用0.5% Tween-20/PBS洗滌5次，100 μl/孔HRP結合的抗人IgG 和各亞類二抗(1∶4 000)37℃ 孵育2 h，0.5% Tween-20/PBS洗板5次后，加入50 μl/孔底物(KPL，USA)避光反應5 min，2 mol/L硫酸終止反應。492 nm處讀取吸光度。負截止值定義為陰性對照樣品的平均值加上陰性對照樣本的兩倍標準差。抗體水平高于負截止值被認為是陽性。

1.3統(tǒng)計學處理 采用Graph Pad Prism 6.0軟件和SPSS16.0軟件進行統(tǒng)計學分析。ELISA抗體滴度組間差異采用Student′st檢驗。IgG和其亞類的組間差異采用單向非參數(shù)Kruskal-Wallis檢驗?？贵w水平與單倍體型間相關性分析采用Spearman相關檢驗。P<0.05表示差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1PfAMA1-DⅡ重組蛋白表達情況和免疫血清檢測 本研究中成功構建了pET32a (+)-PfAMA1-DⅡ 原核表達載體，采用1 mmol/L IPTG過夜誘導后，SDS-PAGE電泳分析可見大量可溶性PfAMA1-DⅡ重組蛋白(rPfAMA1-DⅡ，～74.8 kD)的表達(圖1A)。使用HisPurTMNi-NTA柱純化重組蛋白，并對洗脫及透析后的樣品進行Western blot 檢測，可清晰看到目標蛋白條帶約74.8 kD(圖1A)。檢測其蛋白純度>80%，調(diào)整濃度為1.5 mg/ml(圖1A)。Western blot實驗顯示，rPfAMA1-DⅡ重組蛋白免疫小鼠后提純獲得的免疫血清(3 mg/ml)可檢測到rPfAMA1-DⅡ(圖1B)。ELISA實驗顯示，抗-PfAMA1-DⅡ免疫血清抗體滴度為1∶6 400(圖1C)。

2.2惡性瘧原蟲裂殖子侵襲抑制實驗 與正常鼠IgG處理組相比，抗PfAMA1-DⅡ抗體可顯著抑制惡性瘧原蟲裂殖子侵襲宿主紅細胞，其抑制作用呈劑量依賴性。當抗PfAMA1-DⅡ抗體量達到2 mg/ml時，抑制率>85%，提示抗PfAMA1-DⅡ結構域的抗體對宿主具有保護性作用(表1)。

2.3中緬邊境流行區(qū)pfama1-DⅡ區(qū)域單倍體型多樣性和單倍體型頻率分析 本研究成功擴增了30例惡性瘧原蟲分離株pfama1基因的D Ⅱ 區(qū)域297 bp 長度片段。30例惡性瘧原蟲分離株PfAMA1基因D Ⅱ 分屬 9個單倍體型(H)，單倍型多樣度(Hd)為0.88，H4為優(yōu)勢單倍體型，頻率為26.7%(表2)。

2.4中緬邊境流行區(qū)123例惡性瘧原蟲感染患者血清樣本信息 2013～2015年于中緬邊境地區(qū)采集123例惡性瘧原蟲感染患者血清樣本。患者年齡1～71歲(中位年齡24歲)，15歲以上的病例樣本約為84.55%，75.61%為男性患者(表3)。86.18%的患者有發(fā)熱癥狀(腋窩溫度>37.5℃)，75.3%的患者在發(fā)熱后3 d內(nèi)有抗瘧藥物治療史，7.32%的患者有重癥瘧疾臨床癥狀(表3)?；颊叩臒o性期原蟲密度均值9 860 μl-1(表3)。

圖1 PfAMA1-DⅡ重組蛋白表達情況和免疫原性檢測Fig.1 Expression of recombinant PfAMA1-DⅡ protein and detection of its immunogenicityNote: A.Detection of recombinant PfAMA1-DⅡ protein expression.The left panel shows the coomassie brilliant blue staining result of recombinant PfAMA1-DⅡ protein.The right panel shows the Western blot results of recombinant PfAMA1-DⅡ protein.Probed with anti-His tag mAb (1∶2 000 dilutions)；B.Western blot detection of the specificity of anti-PfAMA1-DⅡ sera；C.ELISA assay for antibody titer detection of anti-PfAMA1-DⅡ serum.Arrows indicate recombinant PfAMA1-DⅡ proteins,～74.8 kD.**.P<0.01;***.P<0.001.

表1 抗-PfAMA1-DⅡ抑制裂殖子侵襲能力檢測

Tab.1 Analysis of anti-PfAMA1-DⅡ inhibition ability of merozoite invasion

Purified IgG conc.Inhibition of invasion (%)No.1No.2No.31.5 mg/ml9288790.75 mg/ml8575570.31 mg/ml17219

表2 中緬邊境地區(qū)30例惡性瘧原蟲分離株pfama1基因單倍體型頻率分析

Tab.2 Haplotype frequency ofPlasmodiumfalciparumin 30pfama1 isolates from China-Myanmar border area

HaplotypeNo.of sequencesFrequency (%)H1413.3H2310.0H3310.0H4826.7H5413.3H626.7H713.3H8413.3H913.3

表3 中緬邊境地區(qū)惡性瘧原蟲急性感染病例(n=123)

Tab.3 Description of acute infection cases withPlasmodiumfalciparumin China-Myanmar border areas (n=123)

IndexNumber (median)% (range)GenderMale 9375.61Female 3024.39Age distribution<10 years43.2510-15 years118.94>15 years10484.55 Missing information43.25Parasitological dataAsexual parasitemia[mean(SD)]9 86014 667Fever prevalence10686.18MalariaSevere malaria symptom97.32

2.5IgG及其亞類的ELISA檢測結果和單倍體型相關性分析 本研究檢測了123例惡性瘧原蟲感染患者血清樣本對PfAMA1-DⅡ蛋白的IgG抗體及其亞類產(chǎn)生水平。與正常對照組相比，45.1%(55/122)的惡性瘧原蟲患者血清中含有高水平抗PfAMA1-DⅡ的IgG抗體產(chǎn)生，提示惡性瘧原蟲感染患者體內(nèi)可產(chǎn)生抗PfAMA1抗體(P<0.000 1，圖2A)。IgG抗體亞類分析顯示，58.82%(60/102)的患者血清中IgG1抗體反應為陽性，27.4%(34/124)

表4 中緬邊境地區(qū)H4和H5單倍體型產(chǎn)生的抗體反應比較

Tab.4 Antibody response between H4 and H5 in China-Mynamar border isolates

Note：1)P<0.01.

圖3 中緬邊境地區(qū)PfAMA1-DⅡ抗原H4和H5單倍體型產(chǎn)生IgG4抗體水平的相關性分析Fig.3 Correlation of IgG4 antibody response to H4 and H5 of PfAMA1-DⅡ antigen in China-Myanmar border area

的患者血清中IgG2抗體反應為陽性， 38.5%(47/122)的患者血清中IgG3抗體反應為陽性，27.1%(33/122)的患者血清中IgG4抗體反應為陽性(圖2B～E)。上述結果提示，中緬邊境流行區(qū)惡性瘧感染患者血清中對PfAMA1-DⅡ的抗體反應以IgG1和IgG3抗體亞類為主。此外，在22份具有基因組DNA樣本的陽性血清樣本中，檢測到4種不同的單倍型(H1、H4、H5和H8的頻率分別為1.9%、75.0%、19.2%和3.8%)。中緬邊境人群血清中抗PfAMA1蛋白的IgG1和IgG3抗體反應對兩個主要單倍型H4和H5差異具有統(tǒng)計學意義(表4)。其中，惡性瘧原蟲感染患者體內(nèi)IgG4抗體水平與H4和H5單倍體型顯著相關(r=0.844，P<0.01，圖3)。

3 討論

中國正處于消滅瘧疾的邊緣時期，但邊境地區(qū)人口流動所致瘧疾再傳播，非洲和東南亞輸入性瘧疾的威脅均使衛(wèi)生部于2020年在全國范圍內(nèi)消滅瘧疾的計劃面臨嚴峻挑戰(zhàn)[18]。目前廣泛研究的紅內(nèi)期瘧疾疫苗候選抗原均具有多態(tài)性，限制了上述抗原制備的疫苗在不同流行區(qū)間廣泛應用。了解瘧疾疫苗候選抗原的多態(tài)性及其與抗瘧保護性免疫應答之間的關聯(lián)，可為瘧疾疫苗的研制提供理論依據(jù)。

惡性瘧原蟲裂殖子抗原產(chǎn)生的自然獲得性抗體在流行區(qū)宿主抵御瘧疾感染中發(fā)揮重要作用[19]。在瘧疾低密度流行區(qū)患者體內(nèi)檢測到高水平的抗裂殖子蛋白抗體，提示裂殖子抗原具有良好的免疫原性[19]。與前期研究結果一致，在瘧疾低密度流行的中緬邊境地區(qū)，于45.1%的患者血清中檢測到抗PfAMA1的IgG抗體。此普遍存在于瘧疾感染患者體內(nèi)的抗體反應可能是由前次感染后存留的抗原特異性記憶B細胞被激活所致[20]。同時，多項研究發(fā)現(xiàn)瘧疾流行區(qū)患者血清中抗AMA1的IgG1和IgG3抗體水平隨年齡增長逐漸升高，且與瘧疾發(fā)病率下降相關，提示調(diào)理性抗體在預防臨床瘧疾中的重要保護作用[21,22]。有研究報道抗裂殖子抗原MSP3和GLURP R2的IgG2和IgG4抗體產(chǎn)生可預防重癥臨床瘧疾發(fā)生[23]。但PfAMA1蛋白誘導產(chǎn)生的IgG2和IgG4抗體在宿主抵抗瘧疾感染中的作用尚存在爭議。有研究提示，由于缺乏激活細胞毒性細胞的能力，患者體內(nèi)抗AMA1的IgG2和IgG4抗體水平與阻斷瘧疾感染后的保護性免疫機制相關[24]。另有研究表明，IgG2和IgG4抗體與降低瘧疾發(fā)病率相關[25]。本研究結果顯示，PfAMA1蛋白DⅡ抗體可體外阻斷裂殖子侵襲宿主紅細胞，且中緬邊境流行區(qū)患者體內(nèi)產(chǎn)生的抗PfAMA1-DⅡ抗體以IgG1和IgG3為主，提示以PfAMA1-DⅡ抗原制備紅內(nèi)期疫苗可誘導患者體內(nèi)保護性免疫應答。

早期研究顯示AMA1所誘導的保護性作用是單倍體型特異性的，但由于對AMA1單倍體型多樣性尚缺乏廣泛性的研究，現(xiàn)有的AMA1疫苗都是基于惡性瘧原蟲標準株3D7和/或FVO株AMA1序列，從而限制了AMA1疫苗的地域性應用價值[26,27]。前期對中緬邊境瘧疾流行區(qū)pfama1基因的多態(tài)性分析顯示，中緬邊境流行區(qū)樣本中無3D7株相同基因型，且與FVO株相同的單倍體型僅占流行區(qū)總單倍體型的5%[19]。本研究中檢測到的優(yōu)勢單倍體型H4(頻率：26.7%)與2011至2012年間普查檢測到的優(yōu)勢單倍體型H3基因序列一致，提示同一單倍體型仍廣泛流行于中緬邊境流行區(qū)[28]。聯(lián)合同一流行區(qū)患者血清學結果分析顯示，H1(頻率：1.9%)、H4(75.0%)、H5(19.2%)和H8(3.8%)感染的惡性瘧原蟲患者血清中抗體可與3D7型PfAMA1-DⅡ重組蛋白發(fā)生交叉反應，提示3D7型AMA1疫苗在中緬邊境流行區(qū)具有部分保護性效果。此外，本研究發(fā)現(xiàn)單倍體型H4和H5誘導宿主保護性免疫應答能力差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，且IgG4抗體產(chǎn)生水平與H4和H5單倍體型顯著相關。鑒于H4為中緬邊境流行區(qū)優(yōu)勢單倍體型，可誘導IgG1和IgG3為主導的保護性免疫應答，上述結果提示以H4作為中緬邊境地區(qū)惡性瘧原蟲紅內(nèi)期潛在的疫苗候選有可能性。

綜上，本研究發(fā)現(xiàn)PfAMA1-DⅡ區(qū)域具有強免疫原性，其誘導產(chǎn)生的保護性抗體以調(diào)理性抗體IgG1和IgG3為主。且研究發(fā)現(xiàn)患者體內(nèi)的保護性抗體與3D7型PfAMA1-DⅡ重組蛋白具有交叉反應，提示以3D7株為背景的PfAMA1疫苗在中緬邊境流行區(qū)具有保護性效果。同時，研究顯示H4可誘導產(chǎn)生IgG抗體及其亞類，提示以此單倍體型制備PfAMA1紅內(nèi)期疫苗在中緬邊境流行區(qū)可能獲得良好的保護性效果。然而，中緬邊境地區(qū)AMA1抗原的單倍型多樣性，各單倍體型與IgG抗體亞類產(chǎn)生水平間的相關性及各IgG抗體亞類對惡性瘧原蟲生長抑制的作用效果仍需大樣本廣泛研究，從而進行綜合評價。