人類肝臟NK細(xì)胞與肝臟疾?、?/h1>
2020-07-13 05:26:12田志剛
中國(guó)免疫學(xué)雜志 2020年11期
程 明 孫 汭 田志剛 彭 慧
(中國(guó)科學(xué)技術(shù)大學(xué)免疫學(xué)研究所，合肥 230027)
肝臟是人體的代謝器官，在調(diào)節(jié)脂肪、糖類及碳水化合物的代謝平衡中發(fā)揮重要作用。肝臟穩(wěn)態(tài)的維持和生理功能的正常行使依賴于免疫系統(tǒng)的精細(xì)調(diào)控[1]。肝臟具有獨(dú)特的供血機(jī)制，其80%左右的血液供應(yīng)來(lái)源于門靜脈，其中來(lái)自于胃腸道的食物抗原、微生物及生物毒素等，使肝臟暴露于大量外來(lái)抗原之中[2]。一方面，肝臟需要識(shí)別有害抗原并引起適度的免疫反應(yīng)以清除有害抗原；另一方面，需要對(duì)食物抗原等無(wú)害物質(zhì)保持免疫耐受，避免產(chǎn)生過(guò)激的免疫反應(yīng)。這種免疫平衡的建立依賴于各類固有免疫和適應(yīng)性免疫細(xì)胞的參與。肝臟含有大量固有免疫細(xì)胞，包括巨噬細(xì)胞、自然殺傷T(natural killer T,NKT)細(xì)胞和自然殺傷(natural killer,NK)細(xì)胞等[3]。NK細(xì)胞在肝臟免疫中扮演重要角色，可通過(guò)天然殺傷和分泌細(xì)胞因子控制病毒感染和腫瘤的發(fā)生發(fā)展[4]。近來(lái)研究表明人類肝臟NK細(xì)胞和外周循環(huán)NK細(xì)胞之間存在諸多差異，本文回顧了人類NK細(xì)胞的基本生物學(xué)特性、NK細(xì)胞的肝臟區(qū)域免疫特征及其在不同肝臟疾病發(fā)生發(fā)展過(guò)程中所產(chǎn)生的影響。
1 人類NK細(xì)胞的基本生物學(xué)特征
1.1NK細(xì)胞的表型與功能 人類NK細(xì)胞是以CD3-CD56+為標(biāo)志的大顆粒淋巴細(xì)胞[5]。CD56也被稱為神經(jīng)細(xì)胞黏附分子，表達(dá)于人NK細(xì)胞和部分T細(xì)胞上[6]。小鼠NK細(xì)胞不表達(dá)CD56，自然細(xì)胞毒性受體(natural cytotoxicity receptor，NCR)家族成員NKp46是鑒別小鼠NK細(xì)胞的特異性標(biāo)志[7]。然而人類CD3-CD56+NK細(xì)胞低表達(dá)或不表達(dá)NKp46，提示NKp46不能作為人類與小鼠NK細(xì)胞的共同表征分子[6]，對(duì)于跨種系NK細(xì)胞表面共同標(biāo)志物的鑒定有待進(jìn)一步探索。
NK細(xì)胞作為免疫系統(tǒng)的重要組成部分，在對(duì)抗病原體感染和腫瘤免疫監(jiān)視中擔(dān)任著哨兵和前線防御者的角色。與T、B細(xì)胞不同，NK細(xì)胞不表達(dá)基因重排的抗原特異性受體，而是依賴一系列種系基因編碼的受體。NK細(xì)胞表面活化性受體(NKp46，NKp44、NKp30、NKG2D等)或抑制性受體(NKG2A、TIGIT、人抑制性KIR、小鼠Ly49受體等)與靶細(xì)胞上的相應(yīng)配體結(jié)合，從而傳遞活化或抑制信號(hào)，二者之間的信號(hào)平衡決定NK細(xì)胞能否被活化[8，9]。正常組織細(xì)胞由于高表達(dá)MHCⅠ類分子，可與NK細(xì)胞上的殺傷細(xì)胞免疫球蛋白樣受體(killer-cell immunoglobulin-like receptor,KIR)家族抑制性受體結(jié)合，傳遞抑制信號(hào)，從而免受NK細(xì)胞攻擊；而感染或轉(zhuǎn)化的細(xì)胞通常下調(diào)表達(dá)MHCⅠ類分子，盡管可以因此逃避MHCⅠ限制性T細(xì)胞的識(shí)別，但可減弱MHCⅠ類分子和NK細(xì)胞抑制性受體結(jié)合傳遞的抑制信號(hào)，使NK細(xì)胞激活并殺傷感染或轉(zhuǎn)化的細(xì)胞[10]。此外，NK細(xì)胞功能也受到細(xì)胞因子的調(diào)控，IFN-α/β、IL-2、IL-12、IL-15、IL-18和IFN-γ可啟動(dòng)NK細(xì)胞活化，而TGF-β、IL-10則可抑制NK細(xì)胞功能[11]。
NK細(xì)胞活化后可釋放穿孔素和顆粒酶等毒性物質(zhì)導(dǎo)致靶細(xì)胞裂解，也可通過(guò)表達(dá)凋亡相關(guān)受體的配體(Fasl、TRAIL、TNF)與靶細(xì)胞表面的DR5、Fas/CD95、TNF受體1等分子相結(jié)合，進(jìn)而激活靶細(xì)胞的凋亡程序[12]?；罨腘K細(xì)胞還能分泌包括IFN-γ在內(nèi)的多種細(xì)胞因子參與免疫調(diào)節(jié)[13]。
1.2人類NK細(xì)胞的早期發(fā)育 T、B細(xì)胞發(fā)育分化的研究已被廣泛報(bào)道，而對(duì)于人類NK細(xì)胞早期發(fā)育階段還知之甚少。傳統(tǒng)觀點(diǎn)認(rèn)為NK細(xì)胞來(lái)源于骨髓，骨髓基質(zhì)細(xì)胞提供造血干細(xì)胞向NK細(xì)胞發(fā)育所必需的細(xì)胞因子[14-16]。近來(lái)研究發(fā)現(xiàn)在淋巴結(jié)、胸腺及肝臟中存在具有NK細(xì)胞分化潛能的早期淋巴祖細(xì)胞，提示這些器官可能是部分NK細(xì)胞髓外發(fā)育分化的場(chǎng)所[17-19]。
NK細(xì)胞起源于造血干細(xì)胞(hematopoietic stem cells，HSC)，Lin-CD34+HSC向CD45RA+淋巴誘導(dǎo)多潛能祖細(xì)胞分化(lymphoid-primed multipotential progenitor，LMPP)[20]。在獲得CD38、CD7、CD10和細(xì)胞因子受體CD127(IL-7受體-α)的表達(dá)后，LMPP轉(zhuǎn)變?yōu)楣餐馨妥婕?xì)胞(common lymphoid progenitor，CLP)。CLP具有向Pro-B、Pre-T、NK祖細(xì)胞(NK cell progenitor，NKP)或其他固有淋巴細(xì)胞譜系發(fā)育的潛能，代表著淋巴細(xì)胞分化早期的關(guān)鍵分支點(diǎn)[21]。IL-15是NK細(xì)胞發(fā)育依賴的細(xì)胞因子，早期研究通過(guò)小鼠模型發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞因子受體CD122(IL-2/IL-15Rβ)是NK細(xì)胞譜系發(fā)育的標(biāo)志分子[22]，但近來(lái)在人的骨髓、臍帶血、扁桃體和胎兒組織中發(fā)現(xiàn)，Lin-CD34+CD38+CD123-CD45RA+CD7+CD10+CD127-NKP可以定向發(fā)育成NK細(xì)胞，與小鼠rNKP不同的是，這群細(xì)胞幾乎不表達(dá)CD122，但在體外特定細(xì)胞因子的誘導(dǎo)下能上調(diào)CD122的表達(dá)，提示在NKP向NK細(xì)胞分化過(guò)程中對(duì)IL-15的響應(yīng)可能需要環(huán)境因素的啟動(dòng)[21]。NKP進(jìn)一步獲得CD56的表達(dá)象征著成熟NK細(xì)胞的產(chǎn)生[6]。
1.3NK細(xì)胞的亞群及分布 根據(jù)CD56分子的表達(dá)將人類NK細(xì)胞分為CD56bright和CD56dim兩個(gè)亞群，它們具有不同的表型、定位和免疫功能。CD56brightNK細(xì)胞主要分布于次級(jí)淋巴組織和某些實(shí)體器官，高表達(dá)CD62L與趨化因子受體CCR7，這些分子介導(dǎo)淋巴細(xì)胞遷移與歸巢，可能對(duì)該亞群在體內(nèi)的分布具有重要意義，而CD56dimNK細(xì)胞缺乏這些分子的表達(dá)[23,24]。另外，兩個(gè)亞群在功能性受體的表達(dá)上存在差異，CD56brightNK細(xì)胞高表達(dá)NKG2A/CD94等抑制性受體，低表達(dá)KIR與FcγRⅢ(CD16)，而上述分子在CD56dimNK細(xì)胞上的表達(dá)模式與此相反[25,26]。此外，CD56brightNK細(xì)胞的細(xì)胞因子分泌能力較強(qiáng)，可產(chǎn)生高水平的IFN-γ與GM-CSF等細(xì)胞因子。體外實(shí)驗(yàn)表明，不同環(huán)境因素誘導(dǎo)下，CD56brightNK細(xì)胞偏好分泌不同類型的細(xì)胞因子，例如，IL-12和IL-18聯(lián)合刺激誘導(dǎo)CD56brightNK細(xì)胞產(chǎn)生IFN-γ、IL-15和IL-18刺激,誘導(dǎo)其產(chǎn)生GM-CSF，而IL-12和IL-15導(dǎo)致其分泌高水平的IL-10[23]。外周血中NK細(xì)胞以CD56dim亞群為主，該群體分泌細(xì)胞因子能力較弱而高表達(dá)FcγRⅢ，其通過(guò)含有免疫受體酪氨酸激活基序的相關(guān)亞基與抗體Fc段結(jié)合，介導(dǎo)抗體依賴的細(xì)胞毒作用(antibody-dependent cellular cytotoxicity，ADCC)[27]。
目前關(guān)于CD56bright和CD56dimNK細(xì)胞是否代表兩個(gè)功能亞群，亦或處于NK細(xì)胞的不同發(fā)育階段仍有爭(zhēng)議。有觀點(diǎn)認(rèn)為CD56brightNK細(xì)胞是CD56dimNK細(xì)胞的前體，且已找到介于這兩群細(xì)胞的中間細(xì)胞亞群[28,29]。然而，體外實(shí)驗(yàn)證明CD56dimNK細(xì)胞可向CD56brightNK細(xì)胞轉(zhuǎn)化[30]，且最近的研究提示這兩群細(xì)胞為終末分化細(xì)胞并來(lái)源于不同前體[31,32]。因此，關(guān)于這兩群細(xì)胞在發(fā)育路徑上的相關(guān)性仍需進(jìn)一步研究。考慮到NK細(xì)胞表面標(biāo)志物的表達(dá)易受環(huán)境因素影響而產(chǎn)生波動(dòng)，根據(jù)單一表面標(biāo)志物對(duì)NK細(xì)胞進(jìn)行亞群劃分可能并不準(zhǔn)確。
此外，根據(jù)CD27與CD11b的表達(dá)可將小鼠NK細(xì)胞成熟過(guò)程劃分為四個(gè)階段，其中雙陰性(CD27-CD11b-)NK細(xì)胞依次經(jīng)歷CD27+CD11b-、CD27+CD11b+階段成為終末成熟的CD27-CD11b+NK細(xì)胞[33,34]；人類NK細(xì)胞也可基于CD27與CD11b的表達(dá)分為不同亞群，各亞群具有獨(dú)特的功能，與CD56brightNK細(xì)胞相似，CD27+CD11b+/-NK細(xì)胞具有較強(qiáng)細(xì)胞因子分泌能力，CD27-CD11b+NK細(xì)胞與CD56dimNK細(xì)胞相似，展現(xiàn)出較高的細(xì)胞毒活性，而CD27-CD11b-NK細(xì)胞表現(xiàn)出不成熟的表型[35]。同時(shí)，與CD27+CD11b+NK細(xì)胞相比，CD27-CD11b+NK細(xì)胞產(chǎn)生IFN-γ的能力下降，提示NK細(xì)胞功能在成熟過(guò)程中受到調(diào)控[36]。NK細(xì)胞成熟過(guò)程伴隨多個(gè)表面分子上調(diào)或下調(diào)表達(dá)，某一組特定表面標(biāo)志物所定義的NK細(xì)胞發(fā)育階段往往與其他表面分子所定義的NK細(xì)胞亞群發(fā)生重疊，關(guān)于不同亞群之間存在的聯(lián)系有待進(jìn)一步探索。
2 肝臟NK細(xì)胞
2.1人類肝臟NK細(xì)胞基本特性 20世紀(jì)70年代大鼠肝臟NK細(xì)胞首次被描述為pit細(xì)胞，其直徑介于淋巴細(xì)胞與粒細(xì)胞之間，形狀不規(guī)則且多變[37]。早期研究表明，肝臟NK細(xì)胞與外周血NK細(xì)胞在表面分子表達(dá)、細(xì)胞因子分泌能力及細(xì)胞毒活性等方面存在差異[38]。例如，肝臟NK細(xì)胞低表達(dá)成熟相關(guān)的自身主要組織相容性復(fù)合體(major histocompatibility complex，MHC)分子的抑制性受體，高表達(dá)組織駐留標(biāo)志CD69[39]。此外，NK細(xì)胞在人體循環(huán)淋巴細(xì)胞中占5%～15%[28]，但占人類肝臟淋巴細(xì)胞數(shù)目的50%[40]。肝臟NK細(xì)胞的相對(duì)豐富性和獨(dú)特特征提示其對(duì)于肝臟穩(wěn)態(tài)維持可能具有重要意義[41]。
人類肝臟兩個(gè)主要NK細(xì)胞亞群CD56bright和CD56dimNK細(xì)胞比例相近，肝臟CD56dimNK細(xì)胞與外周血CD56dimNK細(xì)胞有較多共同的表型和功能特征，包括CD16、KIRs和細(xì)胞毒效應(yīng)分子的表達(dá)[39,42]。而肝臟CD56brightNK細(xì)胞在表面分子表達(dá)上與外周血CD56brightNK細(xì)胞有所不同，其組成性表達(dá)組織駐留標(biāo)志CD69與趨化因子受體CCR5、CXCR6，這種獨(dú)特的趨化因子受體表達(dá)譜可能對(duì)其選擇性定位于肝竇至關(guān)重要[43]。
2.2人類肝臟駐留NK細(xì)胞的發(fā)現(xiàn) 最近研究表明，肝臟NK細(xì)胞是異質(zhì)性群體，根據(jù)其遷移能力，人類與小鼠肝臟NK細(xì)胞可分為經(jīng)典NK(conventional NK,cNK)細(xì)胞與肝臟駐留NK(liver-resident NK,LrNK)細(xì)胞，前者通過(guò)血液循環(huán)在組織間遷移，而后者則保持組織駐留特性，二者在表型及功能分子表達(dá)上均存在顯著區(qū)別[40]。目前對(duì)于小鼠LrNK細(xì)胞和cNK細(xì)胞亞群的表型區(qū)分比較明確，根據(jù)細(xì)胞表面CD49a和CD49b (DX5)的表達(dá)差異可以將小鼠肝臟NK細(xì)胞分為兩個(gè)亞群：CD49a-CD49b+cNK細(xì)胞和CD49a+CD49b-LrNK細(xì)胞[44]。小鼠LrNK細(xì)胞約占肝臟NK細(xì)胞的50%，其高表達(dá)CD69、TRAIL、CXCR6等組織駐留標(biāo)志[44]。
人類LrNK細(xì)胞的表型特征與鼠中不完全相同，早期研究發(fā)現(xiàn)人類肝臟中存在CD3-CD56+CD49a+CD56brightNK細(xì)胞具有肝臟駐留特性，這群細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)與小鼠LrNK細(xì)胞相似，高表達(dá)T-bet低表達(dá)Eomes，但其在不同個(gè)體間的表達(dá)差異較大，且在肝臟NK細(xì)胞中占比很小[42]。最近發(fā)現(xiàn)CXCR6+或CD49e-NK細(xì)胞在人體肝臟中高度富集，但它們?cè)谕庵苎h(huán)NK細(xì)胞中占比很低，提示CXCR6和CD49e可能是區(qū)別人類LrNK細(xì)胞和cNK細(xì)胞的潛在標(biāo)志物；在轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)方面，人類循環(huán)NK細(xì)胞高表達(dá)T-bet低表達(dá)Eomes，而肝臟CXCR6+或CD49e-NK細(xì)胞低表達(dá)T-bet，而高表達(dá)Eomes[45-48](圖1)。這些結(jié)果提示人類LrNK細(xì)胞可能是由不同表型特征的細(xì)胞亞群組成的異質(zhì)性群體，其中部分表型分子在不同亞群重疊表達(dá)，有關(guān)人類肝臟駐留NK細(xì)胞的研究有待進(jìn)一步展開。目前關(guān)于不同NK細(xì)胞亞群之間的譜系關(guān)系及其在肝臟疾病進(jìn)程中的影響成為研究熱點(diǎn)[42,44]。
2.3人類肝臟ILC概述及其與NK細(xì)胞的關(guān)系 固有淋巴細(xì)胞(innate lymphoid cell,ILC)家族是高度異質(zhì)性的細(xì)胞群體[49]。根據(jù)產(chǎn)生Th1型、Th2型和Th17細(xì)胞相關(guān)細(xì)胞因子的能力和轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)特點(diǎn)，可將ILC分為三大類：1型ILC(group 1 ILC)，其表達(dá)轉(zhuǎn)錄因子T-bet并產(chǎn)生Th1型細(xì)胞因子IFN-γ， 包括cNK細(xì)胞，組織駐留NK細(xì)胞和ILC1；2型ILC(group 2 ILC)即ILC2，其產(chǎn)生Th2相關(guān)細(xì)胞因子，包括IL-5和IL-13并表達(dá)轉(zhuǎn)錄因子Bcl11b、Gata3及Rorα；3型ILC(group 3 ILC)，其與Th17細(xì)胞有相同的特征，包括轉(zhuǎn)錄因子Ahr和Rorγt的表達(dá)以及IL-17和IL-22的產(chǎn)生，主要包括ILC3和淋巴組織誘導(dǎo)(LTi)細(xì)胞[50]。穩(wěn)態(tài)下肝臟中存在的ILC主要為1型ILC，幾乎占所有ILC的95%， ILC2和ILC3數(shù)量較少，僅占所有ILC的5%[51]，關(guān)于不同ILC亞群在肝臟疾病中的功能研究已引起廣泛關(guān)注[52-54]。目前小鼠ILC發(fā)育路徑的研究較為系統(tǒng)，主流觀點(diǎn)認(rèn)為ILC成員都起源于CLP[55]，在Nfil3(E4bp4)調(diào)控下，CLP進(jìn)一步發(fā)育成為共同ILC前體(common innate lymphoid progenitors，CILP)，CILP在不同轉(zhuǎn)錄因子的引導(dǎo)下形成不同的發(fā)育路徑。其中，在Ets1和Eomes的調(diào)控下誘導(dǎo)CILP分化為cNK細(xì)胞；而Id2和Gata3的活化則會(huì)使CILP進(jìn)入另一條發(fā)育路徑，形成共同輔助固有淋巴樣細(xì)胞前體(common helper innate lymphoid progenitor，CHILP) 。在T-bet等轉(zhuǎn)錄因子作用下，PLZF+的 CHILP會(huì)最終發(fā)育形成包括ILC1在內(nèi)的各個(gè)ILC亞群[56]，但不能發(fā)育為cNK細(xì)胞。
圖1 人類肝臟NK細(xì)胞亞群的表型及功能Fig.1 Phenotype and function of human liver NK cell subsetsNote:Human liver NK cells contain cNK cells and LrNK cells.cNK cells express CD49e and circulate through the blood.In contrast,LrNK cells express CXCR6,CD69 and other tissue-resident molecules,but lack CD49e expression,and do not participate in blood circulation.LrNK cells and cNK cells also differ in expression of effector molecules and transcription factors.
目前，ILC1的界定較為模糊，與NK細(xì)胞亞群存在重疊。ILC1最初以功能特點(diǎn)來(lái)定義，用來(lái)描述能分泌IFN-γ但不具備細(xì)胞毒作用的ILC，與Th1細(xì)胞相似。近年來(lái)對(duì)ILC亞群發(fā)育源頭的追蹤研究發(fā)現(xiàn)，小鼠ILC1由CHILP發(fā)育而來(lái)，且不依賴轉(zhuǎn)錄因子Eomes[13]；而NK細(xì)胞兼具IFN-γ分泌能力和殺傷功能，是CD8+T細(xì)胞在固有免疫中的對(duì)應(yīng)組分，其發(fā)育依賴轉(zhuǎn)錄因子Eomes[57]。然而，目前尚無(wú)特定表型分子或轉(zhuǎn)錄因子能將1型ILC中不具備細(xì)胞毒作用的群體區(qū)分出來(lái)。在功能上，LrNK細(xì)胞盡管和cNK細(xì)胞相似，具有較強(qiáng)的殺傷功能[40]，但LrNK細(xì)胞在發(fā)育路徑上與cNK細(xì)胞不同，與黏膜ILC1相似，其發(fā)育依賴T-bet而不依賴Eomes，因此LrNK細(xì)胞也被稱作肝臟ILC1[56]。人類中有兩個(gè)ILC1亞群已被報(bào)道：①在扁桃體和腸上皮中發(fā)現(xiàn)的CD103+上皮內(nèi)ILC1(intraepithelial ILC1，ieILC1)[58]；②產(chǎn)生IFN-γ但缺乏細(xì)胞殺傷功能的CD127+ILC1[59]。其中CD127+ILC1與CD56brightNK細(xì)胞均表達(dá)CXCR3、CD127等表面分子。另外通過(guò)轉(zhuǎn)錄組學(xué)和表觀遺傳學(xué)研究比較循環(huán)NK細(xì)胞和ieILC1發(fā)現(xiàn)， CD56dim細(xì)胞與CD56bright細(xì)胞幾乎沒有關(guān)聯(lián)，而CD56bright細(xì)胞與ieILC1存在一定的親緣關(guān)系[57]。因此，人類ILC1可能并不代表與NK細(xì)胞完全不同的譜系，而是具備某種特定功能狀態(tài)的細(xì)胞亞群(例如分泌IFN-γ)。
盡管目前普遍認(rèn)為ILC1與cNK細(xì)胞在發(fā)育譜系上不同，但近來(lái)研究發(fā)現(xiàn)腫瘤微環(huán)境高水平的TGF-β促進(jìn)CD49a-CD49b+Eomes+cNK細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)镃D49a+CD49b-EomesintILC1最終導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的免疫逃逸[60]，提示在特定環(huán)境下cNK細(xì)胞可轉(zhuǎn)變?yōu)镮LC1，因此，ILC1與cNK細(xì)胞究竟是兩個(gè)完全獨(dú)立的細(xì)胞亞群還是不同環(huán)境下呈現(xiàn)的不同狀態(tài)，這仍有待進(jìn)一步研究。
3 肝臟NK細(xì)胞與肝臟疾病
大量研究表明NK細(xì)胞對(duì)于肝臟的免疫防御和疾病控制至關(guān)重要。一方面NK細(xì)胞在抗病毒感染、延緩肝纖維化進(jìn)程和抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)中對(duì)機(jī)體發(fā)揮有利作用，另一方面也能導(dǎo)致肝細(xì)胞損傷，并負(fù)調(diào)適應(yīng)性免疫系統(tǒng)抗病毒應(yīng)答，從而對(duì)機(jī)體產(chǎn)生不利影響。
3.1病毒性肝炎
3.1.1乙型肝炎病毒感染 全世界約有2.4億人感染乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)[61,62]。HBV感染可導(dǎo)致多種肝臟疾病，如急性自限性肝炎、暴發(fā)性肝炎伴肝功能衰竭、慢性肝炎、肝硬化和肝細(xì)胞癌[61,63]。盡管適應(yīng)性免疫反應(yīng)被認(rèn)為是決定HBV感染進(jìn)程的關(guān)鍵因素[64]，但在HBV感染的早期或免疫清除階段，NK細(xì)胞表現(xiàn)出活化的表型和增強(qiáng)的效應(yīng)功能[65,66]，且NK細(xì)胞來(lái)源的IFN-γ可有效阻止HBV的持續(xù)感染[67]，說(shuō)明在感染早期NK細(xì)胞對(duì)于疾病控制至關(guān)重要。值得注意的是，激活的NK細(xì)胞在抗病毒過(guò)程中可能造成肝臟損傷[65]。NK細(xì)胞履行其作為固有免疫細(xì)胞職責(zé)的同時(shí)，也參與調(diào)節(jié)適應(yīng)性免疫應(yīng)答。HBV感染小鼠模型中，肝臟NK細(xì)胞通過(guò)分泌IFN-γ來(lái)介導(dǎo)CD8+T細(xì)胞的活化，且發(fā)揮這一作用的主要是cNK細(xì)胞，而NKG2A+LrNK細(xì)胞可能對(duì)cNK細(xì)胞IFN-γ的分泌起抑制作用[68,69]。這提示IFN-γ對(duì)于NK細(xì)胞抗病毒非常重要，其既可以直接抑制HBV復(fù)制[70]，又可以激活適應(yīng)性免疫系統(tǒng)從而控制疾病發(fā)展。然而，HBV患者外周血抑制性單核細(xì)胞通過(guò)PD-L1/HLA-E分別與NK細(xì)胞上PD-1/CD94相互作用誘導(dǎo)產(chǎn)生調(diào)節(jié)性NK細(xì)胞，其分泌IL-10抑制適應(yīng)性免疫應(yīng)答[71]。此外，NK細(xì)胞還能通過(guò)腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體(tumor necrosis factor-related apoptosis inducing ligand，TRAIL)的信號(hào)通路來(lái)調(diào)節(jié)病毒特異性CD8+T 細(xì)胞，表達(dá)TRAIL死亡受體2(TRAIL-R2)的HBV特異性CD8+T細(xì)胞與NK細(xì)胞表面TRAIL相互作用，導(dǎo)致病毒特異性CD8+T細(xì)胞凋亡[72,73]。由于LrNK細(xì)胞組成性高表達(dá)TRAIL[74]，提示LrNK細(xì)胞可能是通過(guò)TRAIL信號(hào)負(fù)調(diào)T細(xì)胞功能的主要因素。
慢性乙型肝炎(chronic hepatitis B,CHB)患者體內(nèi)，NK細(xì)胞上調(diào)表達(dá)抑制性受體，下調(diào)表達(dá)活化性受體，因而處于功能低下的狀態(tài)。Siglec-9作為一種MHCⅠ類分子非依賴的抑制性受體，選擇性表達(dá)于CD56dimNK細(xì)胞，CHB患者肝細(xì)胞上Siglec-9配體表達(dá)上調(diào)，增強(qiáng)NK細(xì)胞抑制性信號(hào)，使NK細(xì)胞分泌細(xì)胞因子能力降低，通過(guò)抗體阻斷Siglec-9信號(hào)通路增強(qiáng)NK細(xì)胞效應(yīng)功能可能有助于控制HBV感染[75]。另外CHB患者外周血NK細(xì)胞高表達(dá)NKG2A，處于免疫抑制狀態(tài)。通過(guò)HBV小鼠模型對(duì)此現(xiàn)象進(jìn)行探索發(fā)現(xiàn)，小鼠肝臟調(diào)節(jié)性CD4+T細(xì)胞分泌的IL-10可誘導(dǎo)NK細(xì)胞表達(dá)NKG2A，阻斷NKG2A可以逆轉(zhuǎn)NK細(xì)胞的耐受狀態(tài)，增強(qiáng)其細(xì)胞毒作用，進(jìn)而促進(jìn)HBV清除，相同現(xiàn)象在人類NK細(xì)胞上也得到驗(yàn)證[76，77]。此外，CHB患者體內(nèi)高水平的TGF-β導(dǎo)致NK細(xì)胞上活化性受體NKG2D、2B4表達(dá)下調(diào)，NK細(xì)胞殺傷活性減弱[78]。這些結(jié)果說(shuō)明CHB患者體內(nèi)免疫抑制性細(xì)胞因子對(duì)于NK細(xì)胞的表型及功能具有塑造作用，并且針對(duì)NK細(xì)胞高表達(dá)的抑制性受體使用相應(yīng)抗體阻斷可以有效逆轉(zhuǎn)NK細(xì)胞的抑制狀態(tài)從而控制疾病的發(fā)展。
在CHB感染中，不同的NK細(xì)胞亞群所起的作用可能并不相同，產(chǎn)生IFN-γ的NK細(xì)胞限制了病毒感染，而偏向于細(xì)胞毒功能的NK細(xì)胞一方面殺傷感染細(xì)胞延緩疾病進(jìn)程，但同時(shí)可能加重肝臟損傷和限制抗病毒T細(xì)胞反應(yīng)來(lái)加速疾病進(jìn)展。此外，在慢性HBV感染過(guò)程中，NK細(xì)胞上調(diào)表達(dá)相關(guān)抑制性受體表現(xiàn)出功能低下的狀態(tài)，這是否是為了平衡NK細(xì)胞可能造成肝臟損傷的一種補(bǔ)償措施，這些受體的表達(dá)變化是具有亞群特異性還是普遍發(fā)生的現(xiàn)象依然有待探索。
3.1.2丙型肝炎病毒感染 全世界超過(guò)1.85億人為丙型肝炎病毒(hepatitis c virus,HCV)慢性感染患者[79]。在HCV感染過(guò)程中，只有15%～20%的成人自發(fā)清除病毒，大部分發(fā)展為慢性感染患者，其中一部分感染患者進(jìn)一步發(fā)展為肝硬化和肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)[80]。NK細(xì)胞對(duì)于HCV感染的控制同樣重要，早期研究證實(shí)，編碼 NK細(xì)胞抑制性受體KIR2DL3及其配體HLA-C1的基因與HCV感染的自發(fā)緩解有關(guān)[81]。這種現(xiàn)象的一個(gè)可能解釋是KIR2DL3與HLA-C1相互作用介導(dǎo)的NK細(xì)胞抑制可能比其他KIR-HLA所介導(dǎo)的抑制作用弱。而KIRs家族的活化性受體KIR3DS1分子與配體HLA-F結(jié)合后可以激活NK細(xì)胞的功能。在HCV感染者原代肝組織中，HLA-F在HCV感染細(xì)胞表達(dá)上調(diào)，體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)KIR3DS1+NK細(xì)胞相較于KIR3DS1-NK細(xì)胞展示出更強(qiáng)的抑制HCV復(fù)制的能力，提示KIR3DS1和HLA-F之間的相互作用有助于NK細(xì)胞控制HCV感染[82]。上述研究說(shuō)明KIRs及其HLA配體的表達(dá)模式影響NK細(xì)胞抵抗HCV感染的能力。
NK細(xì)胞在HCV感染的急性期被激活，其活化性受體NKG2D表達(dá)上調(diào)，IFN-γ分泌能力和細(xì)胞毒作用增強(qiáng)，從而殺傷HCV感染的肝細(xì)胞[83]。而在慢性HCV患者中，NK細(xì)胞展現(xiàn)出功能上的二分法：增強(qiáng)的細(xì)胞毒效應(yīng)及減弱的細(xì)胞因子分泌能力[84]。慢性HCV感染階段，NK細(xì)胞高表達(dá)NKp30、NKp44、NKp46及NKG2D等活化性受體[84-86]，這可能有助于提高HCV感染過(guò)程中NK細(xì)胞的毒效應(yīng)功能。另外患者肝臟NK細(xì)胞高表達(dá)TRAIL可誘導(dǎo)HCV感染的肝細(xì)胞凋亡，從而控制HCV的感染[86,87]。NK細(xì)胞上TRAIL的表達(dá)受到多種因素的調(diào)控，來(lái)自慢性HCV感染患者病變肝臟組織中的IL-26上調(diào)NK細(xì)胞上TRAIL的表達(dá)[88]；而單核細(xì)胞來(lái)源的IL-18結(jié)合蛋白a(IL18BPa)與IL-36受體拮抗劑(IL36RA)可以抑制NK細(xì)胞表達(dá)TRAIL[89]。來(lái)自肝臟微環(huán)境中的其他因素對(duì)NK細(xì)胞的功能調(diào)控同樣重要，HCV感染的肝細(xì)胞或單核來(lái)源的細(xì)胞可以通過(guò)OX40L-OX40軸與NK細(xì)胞直接接觸誘導(dǎo)其活化[90]。近來(lái)關(guān)于microRNA的研究發(fā)現(xiàn)，HCV感染者中microRNA-155的重組導(dǎo)致NK細(xì)胞下調(diào)表達(dá)T-bet/Tim-3并產(chǎn)生IFN-γ，促進(jìn)HCV的清除[91]。以上結(jié)果表明，在慢性HCV感染過(guò)程中，NK細(xì)胞呈現(xiàn)出較強(qiáng)的細(xì)胞毒作用對(duì)HCV的控制起到一定促進(jìn)作用，同時(shí)也存在造成肝臟損傷的風(fēng)險(xiǎn)。NK細(xì)胞在慢性疾病中受到多種環(huán)境因素的調(diào)控可能有利于其在控制疾病進(jìn)程與造成肝臟損傷之間找到平衡點(diǎn)。
此外，目前關(guān)于HCV的研究當(dāng)中，NK細(xì)胞的功能分析主要通過(guò)外周血NK細(xì)胞來(lái)完成，由于人類肝組織標(biāo)本難以獲取，針對(duì)HCV慢性感染小鼠模型中NK細(xì)胞的研究顯得尤為重要。在模擬HCV感染的挪威大鼠肝炎病毒感染模型中，肝臟NK細(xì)胞的數(shù)量及IFN-γ的產(chǎn)生在病毒感染后都顯著增加，且擴(kuò)增的細(xì)胞主要是cNK細(xì)胞，而LrNK細(xì)胞的數(shù)量保持穩(wěn)定。在NK細(xì)胞清除3 d后，病毒血癥明顯加重，但病毒清除能力和肝損傷的程度并沒有發(fā)生顯著改變[92]。因此，該模型中NK細(xì)胞在感染早期起到了一定抗病毒作用，但后期病毒的清除可能并不主要依賴于NK細(xì)胞。構(gòu)建表達(dá)人的occludin蛋白及CD81的近交系ICR小鼠HCV持續(xù)性感染模型發(fā)現(xiàn)，肝臟CD49b+cNK細(xì)胞高表達(dá)抑制性受體NKG2A，促進(jìn)CD8+T細(xì)胞應(yīng)答的能力受到抑制，使得機(jī)體不能有效清除HCV[93]。NK細(xì)胞在兩種模型中相反的作用可能與建模過(guò)程和疾病研究的時(shí)間點(diǎn)有關(guān)。隨著對(duì)NK細(xì)胞的認(rèn)識(shí)逐漸深入，研究不同肝臟NK細(xì)胞亞群在HCV感染中所扮演的角色將成為趨勢(shì)[94]。
3.2肝纖維化 肝纖維化是以膠原蛋白為代表的細(xì)胞外基質(zhì)蛋白過(guò)度積累所致，而膠原蛋白主要來(lái)自活化的肝星狀細(xì)胞(hepatic stellate cells,HSC)、門靜脈成纖維細(xì)胞和骨髓來(lái)源的肌成纖維細(xì)胞，可由各種慢性肝臟疾病引發(fā)[95]。NK細(xì)胞在肝臟纖維化過(guò)程中扮演了雙重角色，一方面NK細(xì)胞可以通過(guò)NKG2D、NKp30或TRAIL依賴的途徑殺死應(yīng)激的肝細(xì)胞，加重肝損傷[96]；另一方面，NK細(xì)胞可通過(guò)產(chǎn)生IFN-γ直接誘導(dǎo)HSC凋亡，也可通過(guò)TRAIL殺傷活化的HSC，從而抑制纖維化進(jìn)展[97,98]。
肝纖維化是HBV/HCV相關(guān)性肝損傷的終末期表現(xiàn)，CHB患者的外周血與肝臟中出現(xiàn)高比例的KLRG1+NK細(xì)胞，其表面高表達(dá)的TRAIL可以結(jié)合HSC表面的DR5，從而誘導(dǎo)HSC的凋亡。同時(shí)，HSC所產(chǎn)生的骨橋蛋白與KLRG1+NK細(xì)胞表面CD44相互結(jié)合，從而促進(jìn)KLRG1+NK細(xì)胞產(chǎn)生IFN-γ，延緩肝纖維化的發(fā)展[99]。此外，慢性HCV感染所誘導(dǎo)的肝臟炎癥環(huán)境可能會(huì)導(dǎo)致肝臟較低的氧氣水平[100]，而組織中的低氧環(huán)境已被證明可以調(diào)節(jié)NK細(xì)胞的功能[101]。但研究發(fā)現(xiàn)，在體外低氧環(huán)境下，NK細(xì)胞活化性受體NKp46、NKG2D表達(dá)下調(diào)，分泌IFN-γ和抗病毒能力下降，而殺傷活化的HSC的能力幾乎不受影響，提示低氧環(huán)境對(duì)NK細(xì)胞分泌細(xì)胞因子和殺傷HSC的能力影響程度不同[102]。上述研究說(shuō)明，在慢性HBV/HCV感染向肝纖維化進(jìn)展的過(guò)程中，NK細(xì)胞對(duì)于HSC的殺傷作用可有效延緩疾病的進(jìn)程，其內(nèi)在機(jī)理和調(diào)控因素值得進(jìn)一步探究。
3.3腫瘤 肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是最常見的原發(fā)性肝癌，其發(fā)生發(fā)展與HBV、HCV的慢性感染以及脂肪肝的疾病進(jìn)展有關(guān)[103]。近十年來(lái)，肺癌、結(jié)腸癌和前列腺癌等癌癥的發(fā)病率都有所下降，而肝癌的發(fā)病率逐年上升，已成為全球癌癥相關(guān)死亡的主要原因之一[104]。與其他器官相比，NK細(xì)胞在健康肝臟中富集，肝臟NK細(xì)胞殺傷活性的增強(qiáng)對(duì)肝臟腫瘤的免疫監(jiān)測(cè)不可或缺。其中NK細(xì)胞活化性受體NKG2D對(duì)NK細(xì)胞識(shí)別和清除腫瘤具有非常重要的作用[105]，但肝癌組織NKG2D配體表達(dá)下調(diào)，從而逃避NK細(xì)胞的免疫監(jiān)視，靶向轉(zhuǎn)錄抑制因子EZH2可上調(diào)NKG2D配體的表達(dá)，從而增強(qiáng)NK細(xì)胞對(duì)肝癌細(xì)胞的殺傷作用[106]。除了細(xì)胞間直接接觸，活化的NK細(xì)胞產(chǎn)生IFN-γ對(duì)于抗腫瘤免疫同樣具有積極作用[107]。然而，在HBV轉(zhuǎn)基因小鼠模型中，肝臟NK細(xì)胞來(lái)源的IFN-γ通過(guò)EpCAM-EMT軸卻促進(jìn)了HCC的發(fā)生[108]，這提示NK細(xì)胞產(chǎn)生的IFN-γ可能在慢性炎癥向HCC轉(zhuǎn)化中起促進(jìn)作用，而在后期發(fā)揮抗腫瘤作用。
在HCC患者中，多種細(xì)胞作用于NK細(xì)胞影響其抗腫瘤功能。肝癌患者髓系來(lái)源的抑制細(xì)胞(MDSCs)以接觸依賴的方式直接抑制NK細(xì)胞的細(xì)胞毒作用和細(xì)胞因子的產(chǎn)生[109]。此外，腫瘤微環(huán)境中CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞增多，可能抑制腫瘤浸潤(rùn)的NK細(xì)胞產(chǎn)生IFN-γ并減弱其殺傷能力[107]。而經(jīng)過(guò)多靶點(diǎn)激酶抑制劑索拉非尼處理的巨噬細(xì)胞與NK細(xì)胞共培養(yǎng)可以誘導(dǎo)NK細(xì)胞的活化與擴(kuò)增[110]。HCC的發(fā)生過(guò)程往往伴隨抑制性細(xì)胞的產(chǎn)生，這些細(xì)胞通過(guò)直接接觸或者分泌細(xì)胞因子的方式負(fù)調(diào)免疫系統(tǒng)中的效應(yīng)細(xì)胞，進(jìn)而加速HCC的進(jìn)程。針對(duì)細(xì)胞間復(fù)雜調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的研究對(duì)于了解NK細(xì)胞在腫瘤發(fā)生發(fā)展中功能狀態(tài)的變化尤為必要。
免疫卡控點(diǎn)阻斷療法是近年來(lái)腫瘤治療領(lǐng)域的重要突破，基于逆轉(zhuǎn)NK細(xì)胞功能耗竭的免疫卡控點(diǎn)療法可能為HCC的治療提供新思路。HCC患者肝組織中，NKG2A高表達(dá)的CD56dimNK細(xì)胞與瘤內(nèi)肝癌組織表達(dá)的NKG2A配體HLA-E相互作用，使NK細(xì)胞功能耗竭，并與不良愈后相關(guān)[111]。對(duì)HCC患者樣本進(jìn)行相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，編碼CD96和LAG-3等抑制性卡控點(diǎn)受體的基因在CD49a+NK細(xì)胞上的表達(dá)水平顯著高于CD49a-NK細(xì)胞，研究表明，CD96和LAG-3在免疫細(xì)胞上的高表達(dá)使其呈現(xiàn)一種功能耗竭表型從而造成了腫瘤的免疫逃逸[112,113]，CD49a+NK細(xì)胞在肝臟腫瘤中的積累可能會(huì)導(dǎo)致疾病狀況惡化和愈后較差[114]。此外，小鼠LrNK細(xì)胞高表達(dá)的抑制性受體PD-L1與肝臟T細(xì)胞表面的PD-1結(jié)合進(jìn)而抑制適應(yīng)性免疫應(yīng)答，通過(guò)阻斷PD-1-PD-L1軸可有效恢復(fù)T細(xì)胞功能[74]。這些發(fā)現(xiàn)為HCC臨床治療提供了新的靶標(biāo)。同時(shí)，免疫卡控點(diǎn)阻斷通過(guò)增加免疫系統(tǒng)的活性可能會(huì)產(chǎn)生炎癥副作用[115]，所以，進(jìn)行免疫卡控點(diǎn)阻斷治療的患者需要進(jìn)行多方面的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估以降低臨床治療可能帶來(lái)的負(fù)面影響。
圖2 人類肝臟NK細(xì)胞與肝臟疾病的關(guān)系
Fig.2 Relationship between human liver NK cells and liver disease
Note: Human liver NK cells play an important role in the development of HBV/HCV infection,liver fibrosis and hepatocellular carcinoma (HCC).During acute hepatovirus infection,activated NK cells kill virus-infected target cells and release effector cytokines to control virus infection,but over-activation of NK cells may cause liver damage.However,in chronic infectious disease and HCC,NK cells gradually become exhausted with disease progression.
4 總結(jié)與展望
肝臟作為最大的實(shí)體器官，具有獨(dú)特的免疫學(xué)特性，肝臟含有包括NK細(xì)胞在內(nèi)的大量淋巴細(xì)胞[116]，穩(wěn)態(tài)下肝臟NK細(xì)胞與外周NK細(xì)胞顯著不同，其表現(xiàn)出獨(dú)特的表型和功能特征且具有肝臟特異性[41,117]。以往研究表明肝臟NK細(xì)胞在病毒性肝炎、肝纖維化和肝癌等疾病的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用(圖2)。對(duì)于肝臟疾病患者的肝臟NK細(xì)胞進(jìn)行表型與功能的全面研究為肝臟疾病治療提供了新思路。目前，關(guān)于人類與小鼠肝臟NK細(xì)胞亞群的研究又將NK細(xì)胞進(jìn)一步劃分為cNK細(xì)胞和LrNK細(xì)胞[40,44]，探索不同肝臟NK細(xì)胞亞群在肝臟疾病中的分工可能成為未來(lái)的研究熱點(diǎn)。此外，在慢性噬肝病毒感染和肝癌發(fā)生發(fā)展的過(guò)程中，NK細(xì)胞往往處于免疫抑制的狀態(tài)，針對(duì)NK細(xì)胞上的抑制性受體開發(fā)相關(guān)阻斷抗體或拮抗劑，可以逆轉(zhuǎn)NK細(xì)胞的耗竭狀態(tài)并恢復(fù)NK細(xì)胞的功能，從而控制疾病的發(fā)展；然而NK細(xì)胞的過(guò)度活化可能誘使肝細(xì)胞死亡，加重肝臟損傷，因此，在評(píng)估免疫卡控點(diǎn)阻斷療法時(shí)，需要綜合考慮NK細(xì)胞潛在的價(jià)值和風(fēng)險(xiǎn)。
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程 明 孫 汭 田志剛 彭 慧
(中國(guó)科學(xué)技術(shù)大學(xué)免疫學(xué)研究所，合肥 230027)
肝臟是人體的代謝器官，在調(diào)節(jié)脂肪、糖類及碳水化合物的代謝平衡中發(fā)揮重要作用。肝臟穩(wěn)態(tài)的維持和生理功能的正常行使依賴于免疫系統(tǒng)的精細(xì)調(diào)控[1]。肝臟具有獨(dú)特的供血機(jī)制，其80%左右的血液供應(yīng)來(lái)源于門靜脈，其中來(lái)自于胃腸道的食物抗原、微生物及生物毒素等，使肝臟暴露于大量外來(lái)抗原之中[2]。一方面，肝臟需要識(shí)別有害抗原并引起適度的免疫反應(yīng)以清除有害抗原；另一方面，需要對(duì)食物抗原等無(wú)害物質(zhì)保持免疫耐受，避免產(chǎn)生過(guò)激的免疫反應(yīng)。這種免疫平衡的建立依賴于各類固有免疫和適應(yīng)性免疫細(xì)胞的參與。肝臟含有大量固有免疫細(xì)胞，包括巨噬細(xì)胞、自然殺傷T(natural killer T,NKT)細(xì)胞和自然殺傷(natural killer,NK)細(xì)胞等[3]。NK細(xì)胞在肝臟免疫中扮演重要角色，可通過(guò)天然殺傷和分泌細(xì)胞因子控制病毒感染和腫瘤的發(fā)生發(fā)展[4]。近來(lái)研究表明人類肝臟NK細(xì)胞和外周循環(huán)NK細(xì)胞之間存在諸多差異，本文回顧了人類NK細(xì)胞的基本生物學(xué)特性、NK細(xì)胞的肝臟區(qū)域免疫特征及其在不同肝臟疾病發(fā)生發(fā)展過(guò)程中所產(chǎn)生的影響。
1 人類NK細(xì)胞的基本生物學(xué)特征
1.1NK細(xì)胞的表型與功能 人類NK細(xì)胞是以CD3-CD56+為標(biāo)志的大顆粒淋巴細(xì)胞[5]。CD56也被稱為神經(jīng)細(xì)胞黏附分子，表達(dá)于人NK細(xì)胞和部分T細(xì)胞上[6]。小鼠NK細(xì)胞不表達(dá)CD56，自然細(xì)胞毒性受體(natural cytotoxicity receptor，NCR)家族成員NKp46是鑒別小鼠NK細(xì)胞的特異性標(biāo)志[7]。然而人類CD3-CD56+NK細(xì)胞低表達(dá)或不表達(dá)NKp46，提示NKp46不能作為人類與小鼠NK細(xì)胞的共同表征分子[6]，對(duì)于跨種系NK細(xì)胞表面共同標(biāo)志物的鑒定有待進(jìn)一步探索。
NK細(xì)胞作為免疫系統(tǒng)的重要組成部分，在對(duì)抗病原體感染和腫瘤免疫監(jiān)視中擔(dān)任著哨兵和前線防御者的角色。與T、B細(xì)胞不同，NK細(xì)胞不表達(dá)基因重排的抗原特異性受體，而是依賴一系列種系基因編碼的受體。NK細(xì)胞表面活化性受體(NKp46，NKp44、NKp30、NKG2D等)或抑制性受體(NKG2A、TIGIT、人抑制性KIR、小鼠Ly49受體等)與靶細(xì)胞上的相應(yīng)配體結(jié)合，從而傳遞活化或抑制信號(hào)，二者之間的信號(hào)平衡決定NK細(xì)胞能否被活化[8，9]。正常組織細(xì)胞由于高表達(dá)MHCⅠ類分子，可與NK細(xì)胞上的殺傷細(xì)胞免疫球蛋白樣受體(killer-cell immunoglobulin-like receptor,KIR)家族抑制性受體結(jié)合，傳遞抑制信號(hào)，從而免受NK細(xì)胞攻擊；而感染或轉(zhuǎn)化的細(xì)胞通常下調(diào)表達(dá)MHCⅠ類分子，盡管可以因此逃避MHCⅠ限制性T細(xì)胞的識(shí)別，但可減弱MHCⅠ類分子和NK細(xì)胞抑制性受體結(jié)合傳遞的抑制信號(hào)，使NK細(xì)胞激活并殺傷感染或轉(zhuǎn)化的細(xì)胞[10]。此外，NK細(xì)胞功能也受到細(xì)胞因子的調(diào)控，IFN-α/β、IL-2、IL-12、IL-15、IL-18和IFN-γ可啟動(dòng)NK細(xì)胞活化，而TGF-β、IL-10則可抑制NK細(xì)胞功能[11]。
NK細(xì)胞活化后可釋放穿孔素和顆粒酶等毒性物質(zhì)導(dǎo)致靶細(xì)胞裂解，也可通過(guò)表達(dá)凋亡相關(guān)受體的配體(Fasl、TRAIL、TNF)與靶細(xì)胞表面的DR5、Fas/CD95、TNF受體1等分子相結(jié)合，進(jìn)而激活靶細(xì)胞的凋亡程序[12]?；罨腘K細(xì)胞還能分泌包括IFN-γ在內(nèi)的多種細(xì)胞因子參與免疫調(diào)節(jié)[13]。
1.2人類NK細(xì)胞的早期發(fā)育 T、B細(xì)胞發(fā)育分化的研究已被廣泛報(bào)道，而對(duì)于人類NK細(xì)胞早期發(fā)育階段還知之甚少。傳統(tǒng)觀點(diǎn)認(rèn)為NK細(xì)胞來(lái)源于骨髓，骨髓基質(zhì)細(xì)胞提供造血干細(xì)胞向NK細(xì)胞發(fā)育所必需的細(xì)胞因子[14-16]。近來(lái)研究發(fā)現(xiàn)在淋巴結(jié)、胸腺及肝臟中存在具有NK細(xì)胞分化潛能的早期淋巴祖細(xì)胞，提示這些器官可能是部分NK細(xì)胞髓外發(fā)育分化的場(chǎng)所[17-19]。
NK細(xì)胞起源于造血干細(xì)胞(hematopoietic stem cells，HSC)，Lin-CD34+HSC向CD45RA+淋巴誘導(dǎo)多潛能祖細(xì)胞分化(lymphoid-primed multipotential progenitor，LMPP)[20]。在獲得CD38、CD7、CD10和細(xì)胞因子受體CD127(IL-7受體-α)的表達(dá)后，LMPP轉(zhuǎn)變?yōu)楣餐馨妥婕?xì)胞(common lymphoid progenitor，CLP)。CLP具有向Pro-B、Pre-T、NK祖細(xì)胞(NK cell progenitor，NKP)或其他固有淋巴細(xì)胞譜系發(fā)育的潛能，代表著淋巴細(xì)胞分化早期的關(guān)鍵分支點(diǎn)[21]。IL-15是NK細(xì)胞發(fā)育依賴的細(xì)胞因子，早期研究通過(guò)小鼠模型發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞因子受體CD122(IL-2/IL-15Rβ)是NK細(xì)胞譜系發(fā)育的標(biāo)志分子[22]，但近來(lái)在人的骨髓、臍帶血、扁桃體和胎兒組織中發(fā)現(xiàn)，Lin-CD34+CD38+CD123-CD45RA+CD7+CD10+CD127-NKP可以定向發(fā)育成NK細(xì)胞，與小鼠rNKP不同的是，這群細(xì)胞幾乎不表達(dá)CD122，但在體外特定細(xì)胞因子的誘導(dǎo)下能上調(diào)CD122的表達(dá)，提示在NKP向NK細(xì)胞分化過(guò)程中對(duì)IL-15的響應(yīng)可能需要環(huán)境因素的啟動(dòng)[21]。NKP進(jìn)一步獲得CD56的表達(dá)象征著成熟NK細(xì)胞的產(chǎn)生[6]。
1.3NK細(xì)胞的亞群及分布 根據(jù)CD56分子的表達(dá)將人類NK細(xì)胞分為CD56bright和CD56dim兩個(gè)亞群，它們具有不同的表型、定位和免疫功能。CD56brightNK細(xì)胞主要分布于次級(jí)淋巴組織和某些實(shí)體器官，高表達(dá)CD62L與趨化因子受體CCR7，這些分子介導(dǎo)淋巴細(xì)胞遷移與歸巢，可能對(duì)該亞群在體內(nèi)的分布具有重要意義，而CD56dimNK細(xì)胞缺乏這些分子的表達(dá)[23,24]。另外，兩個(gè)亞群在功能性受體的表達(dá)上存在差異，CD56brightNK細(xì)胞高表達(dá)NKG2A/CD94等抑制性受體，低表達(dá)KIR與FcγRⅢ(CD16)，而上述分子在CD56dimNK細(xì)胞上的表達(dá)模式與此相反[25,26]。此外，CD56brightNK細(xì)胞的細(xì)胞因子分泌能力較強(qiáng)，可產(chǎn)生高水平的IFN-γ與GM-CSF等細(xì)胞因子。體外實(shí)驗(yàn)表明，不同環(huán)境因素誘導(dǎo)下，CD56brightNK細(xì)胞偏好分泌不同類型的細(xì)胞因子，例如，IL-12和IL-18聯(lián)合刺激誘導(dǎo)CD56brightNK細(xì)胞產(chǎn)生IFN-γ、IL-15和IL-18刺激,誘導(dǎo)其產(chǎn)生GM-CSF，而IL-12和IL-15導(dǎo)致其分泌高水平的IL-10[23]。外周血中NK細(xì)胞以CD56dim亞群為主，該群體分泌細(xì)胞因子能力較弱而高表達(dá)FcγRⅢ，其通過(guò)含有免疫受體酪氨酸激活基序的相關(guān)亞基與抗體Fc段結(jié)合，介導(dǎo)抗體依賴的細(xì)胞毒作用(antibody-dependent cellular cytotoxicity，ADCC)[27]。
目前關(guān)于CD56bright和CD56dimNK細(xì)胞是否代表兩個(gè)功能亞群，亦或處于NK細(xì)胞的不同發(fā)育階段仍有爭(zhēng)議。有觀點(diǎn)認(rèn)為CD56brightNK細(xì)胞是CD56dimNK細(xì)胞的前體，且已找到介于這兩群細(xì)胞的中間細(xì)胞亞群[28,29]。然而，體外實(shí)驗(yàn)證明CD56dimNK細(xì)胞可向CD56brightNK細(xì)胞轉(zhuǎn)化[30]，且最近的研究提示這兩群細(xì)胞為終末分化細(xì)胞并來(lái)源于不同前體[31,32]。因此，關(guān)于這兩群細(xì)胞在發(fā)育路徑上的相關(guān)性仍需進(jìn)一步研究。考慮到NK細(xì)胞表面標(biāo)志物的表達(dá)易受環(huán)境因素影響而產(chǎn)生波動(dòng)，根據(jù)單一表面標(biāo)志物對(duì)NK細(xì)胞進(jìn)行亞群劃分可能并不準(zhǔn)確。
此外，根據(jù)CD27與CD11b的表達(dá)可將小鼠NK細(xì)胞成熟過(guò)程劃分為四個(gè)階段，其中雙陰性(CD27-CD11b-)NK細(xì)胞依次經(jīng)歷CD27+CD11b-、CD27+CD11b+階段成為終末成熟的CD27-CD11b+NK細(xì)胞[33,34]；人類NK細(xì)胞也可基于CD27與CD11b的表達(dá)分為不同亞群，各亞群具有獨(dú)特的功能，與CD56brightNK細(xì)胞相似，CD27+CD11b+/-NK細(xì)胞具有較強(qiáng)細(xì)胞因子分泌能力，CD27-CD11b+NK細(xì)胞與CD56dimNK細(xì)胞相似，展現(xiàn)出較高的細(xì)胞毒活性，而CD27-CD11b-NK細(xì)胞表現(xiàn)出不成熟的表型[35]。同時(shí)，與CD27+CD11b+NK細(xì)胞相比，CD27-CD11b+NK細(xì)胞產(chǎn)生IFN-γ的能力下降，提示NK細(xì)胞功能在成熟過(guò)程中受到調(diào)控[36]。NK細(xì)胞成熟過(guò)程伴隨多個(gè)表面分子上調(diào)或下調(diào)表達(dá)，某一組特定表面標(biāo)志物所定義的NK細(xì)胞發(fā)育階段往往與其他表面分子所定義的NK細(xì)胞亞群發(fā)生重疊，關(guān)于不同亞群之間存在的聯(lián)系有待進(jìn)一步探索。
2 肝臟NK細(xì)胞
2.1人類肝臟NK細(xì)胞基本特性 20世紀(jì)70年代大鼠肝臟NK細(xì)胞首次被描述為pit細(xì)胞，其直徑介于淋巴細(xì)胞與粒細(xì)胞之間，形狀不規(guī)則且多變[37]。早期研究表明，肝臟NK細(xì)胞與外周血NK細(xì)胞在表面分子表達(dá)、細(xì)胞因子分泌能力及細(xì)胞毒活性等方面存在差異[38]。例如，肝臟NK細(xì)胞低表達(dá)成熟相關(guān)的自身主要組織相容性復(fù)合體(major histocompatibility complex，MHC)分子的抑制性受體，高表達(dá)組織駐留標(biāo)志CD69[39]。此外，NK細(xì)胞在人體循環(huán)淋巴細(xì)胞中占5%～15%[28]，但占人類肝臟淋巴細(xì)胞數(shù)目的50%[40]。肝臟NK細(xì)胞的相對(duì)豐富性和獨(dú)特特征提示其對(duì)于肝臟穩(wěn)態(tài)維持可能具有重要意義[41]。
人類肝臟兩個(gè)主要NK細(xì)胞亞群CD56bright和CD56dimNK細(xì)胞比例相近，肝臟CD56dimNK細(xì)胞與外周血CD56dimNK細(xì)胞有較多共同的表型和功能特征，包括CD16、KIRs和細(xì)胞毒效應(yīng)分子的表達(dá)[39,42]。而肝臟CD56brightNK細(xì)胞在表面分子表達(dá)上與外周血CD56brightNK細(xì)胞有所不同，其組成性表達(dá)組織駐留標(biāo)志CD69與趨化因子受體CCR5、CXCR6，這種獨(dú)特的趨化因子受體表達(dá)譜可能對(duì)其選擇性定位于肝竇至關(guān)重要[43]。
2.2人類肝臟駐留NK細(xì)胞的發(fā)現(xiàn) 最近研究表明，肝臟NK細(xì)胞是異質(zhì)性群體，根據(jù)其遷移能力，人類與小鼠肝臟NK細(xì)胞可分為經(jīng)典NK(conventional NK,cNK)細(xì)胞與肝臟駐留NK(liver-resident NK,LrNK)細(xì)胞，前者通過(guò)血液循環(huán)在組織間遷移，而后者則保持組織駐留特性，二者在表型及功能分子表達(dá)上均存在顯著區(qū)別[40]。目前對(duì)于小鼠LrNK細(xì)胞和cNK細(xì)胞亞群的表型區(qū)分比較明確，根據(jù)細(xì)胞表面CD49a和CD49b (DX5)的表達(dá)差異可以將小鼠肝臟NK細(xì)胞分為兩個(gè)亞群：CD49a-CD49b+cNK細(xì)胞和CD49a+CD49b-LrNK細(xì)胞[44]。小鼠LrNK細(xì)胞約占肝臟NK細(xì)胞的50%，其高表達(dá)CD69、TRAIL、CXCR6等組織駐留標(biāo)志[44]。
人類LrNK細(xì)胞的表型特征與鼠中不完全相同，早期研究發(fā)現(xiàn)人類肝臟中存在CD3-CD56+CD49a+CD56brightNK細(xì)胞具有肝臟駐留特性，這群細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)與小鼠LrNK細(xì)胞相似，高表達(dá)T-bet低表達(dá)Eomes，但其在不同個(gè)體間的表達(dá)差異較大，且在肝臟NK細(xì)胞中占比很小[42]。最近發(fā)現(xiàn)CXCR6+或CD49e-NK細(xì)胞在人體肝臟中高度富集，但它們?cè)谕庵苎h(huán)NK細(xì)胞中占比很低，提示CXCR6和CD49e可能是區(qū)別人類LrNK細(xì)胞和cNK細(xì)胞的潛在標(biāo)志物；在轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)方面，人類循環(huán)NK細(xì)胞高表達(dá)T-bet低表達(dá)Eomes，而肝臟CXCR6+或CD49e-NK細(xì)胞低表達(dá)T-bet，而高表達(dá)Eomes[45-48](圖1)。這些結(jié)果提示人類LrNK細(xì)胞可能是由不同表型特征的細(xì)胞亞群組成的異質(zhì)性群體，其中部分表型分子在不同亞群重疊表達(dá)，有關(guān)人類肝臟駐留NK細(xì)胞的研究有待進(jìn)一步展開。目前關(guān)于不同NK細(xì)胞亞群之間的譜系關(guān)系及其在肝臟疾病進(jìn)程中的影響成為研究熱點(diǎn)[42,44]。
2.3人類肝臟ILC概述及其與NK細(xì)胞的關(guān)系 固有淋巴細(xì)胞(innate lymphoid cell,ILC)家族是高度異質(zhì)性的細(xì)胞群體[49]。根據(jù)產(chǎn)生Th1型、Th2型和Th17細(xì)胞相關(guān)細(xì)胞因子的能力和轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)特點(diǎn)，可將ILC分為三大類：1型ILC(group 1 ILC)，其表達(dá)轉(zhuǎn)錄因子T-bet并產(chǎn)生Th1型細(xì)胞因子IFN-γ， 包括cNK細(xì)胞，組織駐留NK細(xì)胞和ILC1；2型ILC(group 2 ILC)即ILC2，其產(chǎn)生Th2相關(guān)細(xì)胞因子，包括IL-5和IL-13并表達(dá)轉(zhuǎn)錄因子Bcl11b、Gata3及Rorα；3型ILC(group 3 ILC)，其與Th17細(xì)胞有相同的特征，包括轉(zhuǎn)錄因子Ahr和Rorγt的表達(dá)以及IL-17和IL-22的產(chǎn)生，主要包括ILC3和淋巴組織誘導(dǎo)(LTi)細(xì)胞[50]。穩(wěn)態(tài)下肝臟中存在的ILC主要為1型ILC，幾乎占所有ILC的95%， ILC2和ILC3數(shù)量較少，僅占所有ILC的5%[51]，關(guān)于不同ILC亞群在肝臟疾病中的功能研究已引起廣泛關(guān)注[52-54]。目前小鼠ILC發(fā)育路徑的研究較為系統(tǒng)，主流觀點(diǎn)認(rèn)為ILC成員都起源于CLP[55]，在Nfil3(E4bp4)調(diào)控下，CLP進(jìn)一步發(fā)育成為共同ILC前體(common innate lymphoid progenitors，CILP)，CILP在不同轉(zhuǎn)錄因子的引導(dǎo)下形成不同的發(fā)育路徑。其中，在Ets1和Eomes的調(diào)控下誘導(dǎo)CILP分化為cNK細(xì)胞；而Id2和Gata3的活化則會(huì)使CILP進(jìn)入另一條發(fā)育路徑，形成共同輔助固有淋巴樣細(xì)胞前體(common helper innate lymphoid progenitor，CHILP) 。在T-bet等轉(zhuǎn)錄因子作用下，PLZF+的 CHILP會(huì)最終發(fā)育形成包括ILC1在內(nèi)的各個(gè)ILC亞群[56]，但不能發(fā)育為cNK細(xì)胞。
圖1 人類肝臟NK細(xì)胞亞群的表型及功能Fig.1 Phenotype and function of human liver NK cell subsetsNote:Human liver NK cells contain cNK cells and LrNK cells.cNK cells express CD49e and circulate through the blood.In contrast,LrNK cells express CXCR6,CD69 and other tissue-resident molecules,but lack CD49e expression,and do not participate in blood circulation.LrNK cells and cNK cells also differ in expression of effector molecules and transcription factors.
目前，ILC1的界定較為模糊，與NK細(xì)胞亞群存在重疊。ILC1最初以功能特點(diǎn)來(lái)定義，用來(lái)描述能分泌IFN-γ但不具備細(xì)胞毒作用的ILC，與Th1細(xì)胞相似。近年來(lái)對(duì)ILC亞群發(fā)育源頭的追蹤研究發(fā)現(xiàn)，小鼠ILC1由CHILP發(fā)育而來(lái)，且不依賴轉(zhuǎn)錄因子Eomes[13]；而NK細(xì)胞兼具IFN-γ分泌能力和殺傷功能，是CD8+T細(xì)胞在固有免疫中的對(duì)應(yīng)組分，其發(fā)育依賴轉(zhuǎn)錄因子Eomes[57]。然而，目前尚無(wú)特定表型分子或轉(zhuǎn)錄因子能將1型ILC中不具備細(xì)胞毒作用的群體區(qū)分出來(lái)。在功能上，LrNK細(xì)胞盡管和cNK細(xì)胞相似，具有較強(qiáng)的殺傷功能[40]，但LrNK細(xì)胞在發(fā)育路徑上與cNK細(xì)胞不同，與黏膜ILC1相似，其發(fā)育依賴T-bet而不依賴Eomes，因此LrNK細(xì)胞也被稱作肝臟ILC1[56]。人類中有兩個(gè)ILC1亞群已被報(bào)道：①在扁桃體和腸上皮中發(fā)現(xiàn)的CD103+上皮內(nèi)ILC1(intraepithelial ILC1，ieILC1)[58]；②產(chǎn)生IFN-γ但缺乏細(xì)胞殺傷功能的CD127+ILC1[59]。其中CD127+ILC1與CD56brightNK細(xì)胞均表達(dá)CXCR3、CD127等表面分子。另外通過(guò)轉(zhuǎn)錄組學(xué)和表觀遺傳學(xué)研究比較循環(huán)NK細(xì)胞和ieILC1發(fā)現(xiàn)， CD56dim細(xì)胞與CD56bright細(xì)胞幾乎沒有關(guān)聯(lián)，而CD56bright細(xì)胞與ieILC1存在一定的親緣關(guān)系[57]。因此，人類ILC1可能并不代表與NK細(xì)胞完全不同的譜系，而是具備某種特定功能狀態(tài)的細(xì)胞亞群(例如分泌IFN-γ)。
盡管目前普遍認(rèn)為ILC1與cNK細(xì)胞在發(fā)育譜系上不同，但近來(lái)研究發(fā)現(xiàn)腫瘤微環(huán)境高水平的TGF-β促進(jìn)CD49a-CD49b+Eomes+cNK細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)镃D49a+CD49b-EomesintILC1最終導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的免疫逃逸[60]，提示在特定環(huán)境下cNK細(xì)胞可轉(zhuǎn)變?yōu)镮LC1，因此，ILC1與cNK細(xì)胞究竟是兩個(gè)完全獨(dú)立的細(xì)胞亞群還是不同環(huán)境下呈現(xiàn)的不同狀態(tài)，這仍有待進(jìn)一步研究。
3 肝臟NK細(xì)胞與肝臟疾病
大量研究表明NK細(xì)胞對(duì)于肝臟的免疫防御和疾病控制至關(guān)重要。一方面NK細(xì)胞在抗病毒感染、延緩肝纖維化進(jìn)程和抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)中對(duì)機(jī)體發(fā)揮有利作用，另一方面也能導(dǎo)致肝細(xì)胞損傷，并負(fù)調(diào)適應(yīng)性免疫系統(tǒng)抗病毒應(yīng)答，從而對(duì)機(jī)體產(chǎn)生不利影響。
3.1病毒性肝炎
3.1.1乙型肝炎病毒感染 全世界約有2.4億人感染乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)[61,62]。HBV感染可導(dǎo)致多種肝臟疾病，如急性自限性肝炎、暴發(fā)性肝炎伴肝功能衰竭、慢性肝炎、肝硬化和肝細(xì)胞癌[61,63]。盡管適應(yīng)性免疫反應(yīng)被認(rèn)為是決定HBV感染進(jìn)程的關(guān)鍵因素[64]，但在HBV感染的早期或免疫清除階段，NK細(xì)胞表現(xiàn)出活化的表型和增強(qiáng)的效應(yīng)功能[65,66]，且NK細(xì)胞來(lái)源的IFN-γ可有效阻止HBV的持續(xù)感染[67]，說(shuō)明在感染早期NK細(xì)胞對(duì)于疾病控制至關(guān)重要。值得注意的是，激活的NK細(xì)胞在抗病毒過(guò)程中可能造成肝臟損傷[65]。NK細(xì)胞履行其作為固有免疫細(xì)胞職責(zé)的同時(shí)，也參與調(diào)節(jié)適應(yīng)性免疫應(yīng)答。HBV感染小鼠模型中，肝臟NK細(xì)胞通過(guò)分泌IFN-γ來(lái)介導(dǎo)CD8+T細(xì)胞的活化，且發(fā)揮這一作用的主要是cNK細(xì)胞，而NKG2A+LrNK細(xì)胞可能對(duì)cNK細(xì)胞IFN-γ的分泌起抑制作用[68,69]。這提示IFN-γ對(duì)于NK細(xì)胞抗病毒非常重要，其既可以直接抑制HBV復(fù)制[70]，又可以激活適應(yīng)性免疫系統(tǒng)從而控制疾病發(fā)展。然而，HBV患者外周血抑制性單核細(xì)胞通過(guò)PD-L1/HLA-E分別與NK細(xì)胞上PD-1/CD94相互作用誘導(dǎo)產(chǎn)生調(diào)節(jié)性NK細(xì)胞，其分泌IL-10抑制適應(yīng)性免疫應(yīng)答[71]。此外，NK細(xì)胞還能通過(guò)腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體(tumor necrosis factor-related apoptosis inducing ligand，TRAIL)的信號(hào)通路來(lái)調(diào)節(jié)病毒特異性CD8+T 細(xì)胞，表達(dá)TRAIL死亡受體2(TRAIL-R2)的HBV特異性CD8+T細(xì)胞與NK細(xì)胞表面TRAIL相互作用，導(dǎo)致病毒特異性CD8+T細(xì)胞凋亡[72,73]。由于LrNK細(xì)胞組成性高表達(dá)TRAIL[74]，提示LrNK細(xì)胞可能是通過(guò)TRAIL信號(hào)負(fù)調(diào)T細(xì)胞功能的主要因素。
慢性乙型肝炎(chronic hepatitis B,CHB)患者體內(nèi)，NK細(xì)胞上調(diào)表達(dá)抑制性受體，下調(diào)表達(dá)活化性受體，因而處于功能低下的狀態(tài)。Siglec-9作為一種MHCⅠ類分子非依賴的抑制性受體，選擇性表達(dá)于CD56dimNK細(xì)胞，CHB患者肝細(xì)胞上Siglec-9配體表達(dá)上調(diào)，增強(qiáng)NK細(xì)胞抑制性信號(hào)，使NK細(xì)胞分泌細(xì)胞因子能力降低，通過(guò)抗體阻斷Siglec-9信號(hào)通路增強(qiáng)NK細(xì)胞效應(yīng)功能可能有助于控制HBV感染[75]。另外CHB患者外周血NK細(xì)胞高表達(dá)NKG2A，處于免疫抑制狀態(tài)。通過(guò)HBV小鼠模型對(duì)此現(xiàn)象進(jìn)行探索發(fā)現(xiàn)，小鼠肝臟調(diào)節(jié)性CD4+T細(xì)胞分泌的IL-10可誘導(dǎo)NK細(xì)胞表達(dá)NKG2A，阻斷NKG2A可以逆轉(zhuǎn)NK細(xì)胞的耐受狀態(tài)，增強(qiáng)其細(xì)胞毒作用，進(jìn)而促進(jìn)HBV清除，相同現(xiàn)象在人類NK細(xì)胞上也得到驗(yàn)證[76，77]。此外，CHB患者體內(nèi)高水平的TGF-β導(dǎo)致NK細(xì)胞上活化性受體NKG2D、2B4表達(dá)下調(diào)，NK細(xì)胞殺傷活性減弱[78]。這些結(jié)果說(shuō)明CHB患者體內(nèi)免疫抑制性細(xì)胞因子對(duì)于NK細(xì)胞的表型及功能具有塑造作用，并且針對(duì)NK細(xì)胞高表達(dá)的抑制性受體使用相應(yīng)抗體阻斷可以有效逆轉(zhuǎn)NK細(xì)胞的抑制狀態(tài)從而控制疾病的發(fā)展。
在CHB感染中，不同的NK細(xì)胞亞群所起的作用可能并不相同，產(chǎn)生IFN-γ的NK細(xì)胞限制了病毒感染，而偏向于細(xì)胞毒功能的NK細(xì)胞一方面殺傷感染細(xì)胞延緩疾病進(jìn)程，但同時(shí)可能加重肝臟損傷和限制抗病毒T細(xì)胞反應(yīng)來(lái)加速疾病進(jìn)展。此外，在慢性HBV感染過(guò)程中，NK細(xì)胞上調(diào)表達(dá)相關(guān)抑制性受體表現(xiàn)出功能低下的狀態(tài)，這是否是為了平衡NK細(xì)胞可能造成肝臟損傷的一種補(bǔ)償措施，這些受體的表達(dá)變化是具有亞群特異性還是普遍發(fā)生的現(xiàn)象依然有待探索。
3.1.2丙型肝炎病毒感染 全世界超過(guò)1.85億人為丙型肝炎病毒(hepatitis c virus,HCV)慢性感染患者[79]。在HCV感染過(guò)程中，只有15%～20%的成人自發(fā)清除病毒，大部分發(fā)展為慢性感染患者，其中一部分感染患者進(jìn)一步發(fā)展為肝硬化和肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)[80]。NK細(xì)胞對(duì)于HCV感染的控制同樣重要，早期研究證實(shí)，編碼 NK細(xì)胞抑制性受體KIR2DL3及其配體HLA-C1的基因與HCV感染的自發(fā)緩解有關(guān)[81]。這種現(xiàn)象的一個(gè)可能解釋是KIR2DL3與HLA-C1相互作用介導(dǎo)的NK細(xì)胞抑制可能比其他KIR-HLA所介導(dǎo)的抑制作用弱。而KIRs家族的活化性受體KIR3DS1分子與配體HLA-F結(jié)合后可以激活NK細(xì)胞的功能。在HCV感染者原代肝組織中，HLA-F在HCV感染細(xì)胞表達(dá)上調(diào)，體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)KIR3DS1+NK細(xì)胞相較于KIR3DS1-NK細(xì)胞展示出更強(qiáng)的抑制HCV復(fù)制的能力，提示KIR3DS1和HLA-F之間的相互作用有助于NK細(xì)胞控制HCV感染[82]。上述研究說(shuō)明KIRs及其HLA配體的表達(dá)模式影響NK細(xì)胞抵抗HCV感染的能力。
NK細(xì)胞在HCV感染的急性期被激活，其活化性受體NKG2D表達(dá)上調(diào)，IFN-γ分泌能力和細(xì)胞毒作用增強(qiáng)，從而殺傷HCV感染的肝細(xì)胞[83]。而在慢性HCV患者中，NK細(xì)胞展現(xiàn)出功能上的二分法：增強(qiáng)的細(xì)胞毒效應(yīng)及減弱的細(xì)胞因子分泌能力[84]。慢性HCV感染階段，NK細(xì)胞高表達(dá)NKp30、NKp44、NKp46及NKG2D等活化性受體[84-86]，這可能有助于提高HCV感染過(guò)程中NK細(xì)胞的毒效應(yīng)功能。另外患者肝臟NK細(xì)胞高表達(dá)TRAIL可誘導(dǎo)HCV感染的肝細(xì)胞凋亡，從而控制HCV的感染[86,87]。NK細(xì)胞上TRAIL的表達(dá)受到多種因素的調(diào)控，來(lái)自慢性HCV感染患者病變肝臟組織中的IL-26上調(diào)NK細(xì)胞上TRAIL的表達(dá)[88]；而單核細(xì)胞來(lái)源的IL-18結(jié)合蛋白a(IL18BPa)與IL-36受體拮抗劑(IL36RA)可以抑制NK細(xì)胞表達(dá)TRAIL[89]。來(lái)自肝臟微環(huán)境中的其他因素對(duì)NK細(xì)胞的功能調(diào)控同樣重要，HCV感染的肝細(xì)胞或單核來(lái)源的細(xì)胞可以通過(guò)OX40L-OX40軸與NK細(xì)胞直接接觸誘導(dǎo)其活化[90]。近來(lái)關(guān)于microRNA的研究發(fā)現(xiàn)，HCV感染者中microRNA-155的重組導(dǎo)致NK細(xì)胞下調(diào)表達(dá)T-bet/Tim-3并產(chǎn)生IFN-γ，促進(jìn)HCV的清除[91]。以上結(jié)果表明，在慢性HCV感染過(guò)程中，NK細(xì)胞呈現(xiàn)出較強(qiáng)的細(xì)胞毒作用對(duì)HCV的控制起到一定促進(jìn)作用，同時(shí)也存在造成肝臟損傷的風(fēng)險(xiǎn)。NK細(xì)胞在慢性疾病中受到多種環(huán)境因素的調(diào)控可能有利于其在控制疾病進(jìn)程與造成肝臟損傷之間找到平衡點(diǎn)。
此外，目前關(guān)于HCV的研究當(dāng)中，NK細(xì)胞的功能分析主要通過(guò)外周血NK細(xì)胞來(lái)完成，由于人類肝組織標(biāo)本難以獲取，針對(duì)HCV慢性感染小鼠模型中NK細(xì)胞的研究顯得尤為重要。在模擬HCV感染的挪威大鼠肝炎病毒感染模型中，肝臟NK細(xì)胞的數(shù)量及IFN-γ的產(chǎn)生在病毒感染后都顯著增加，且擴(kuò)增的細(xì)胞主要是cNK細(xì)胞，而LrNK細(xì)胞的數(shù)量保持穩(wěn)定。在NK細(xì)胞清除3 d后，病毒血癥明顯加重，但病毒清除能力和肝損傷的程度并沒有發(fā)生顯著改變[92]。因此，該模型中NK細(xì)胞在感染早期起到了一定抗病毒作用，但后期病毒的清除可能并不主要依賴于NK細(xì)胞。構(gòu)建表達(dá)人的occludin蛋白及CD81的近交系ICR小鼠HCV持續(xù)性感染模型發(fā)現(xiàn)，肝臟CD49b+cNK細(xì)胞高表達(dá)抑制性受體NKG2A，促進(jìn)CD8+T細(xì)胞應(yīng)答的能力受到抑制，使得機(jī)體不能有效清除HCV[93]。NK細(xì)胞在兩種模型中相反的作用可能與建模過(guò)程和疾病研究的時(shí)間點(diǎn)有關(guān)。隨著對(duì)NK細(xì)胞的認(rèn)識(shí)逐漸深入，研究不同肝臟NK細(xì)胞亞群在HCV感染中所扮演的角色將成為趨勢(shì)[94]。
3.2肝纖維化 肝纖維化是以膠原蛋白為代表的細(xì)胞外基質(zhì)蛋白過(guò)度積累所致，而膠原蛋白主要來(lái)自活化的肝星狀細(xì)胞(hepatic stellate cells,HSC)、門靜脈成纖維細(xì)胞和骨髓來(lái)源的肌成纖維細(xì)胞，可由各種慢性肝臟疾病引發(fā)[95]。NK細(xì)胞在肝臟纖維化過(guò)程中扮演了雙重角色，一方面NK細(xì)胞可以通過(guò)NKG2D、NKp30或TRAIL依賴的途徑殺死應(yīng)激的肝細(xì)胞，加重肝損傷[96]；另一方面，NK細(xì)胞可通過(guò)產(chǎn)生IFN-γ直接誘導(dǎo)HSC凋亡，也可通過(guò)TRAIL殺傷活化的HSC，從而抑制纖維化進(jìn)展[97,98]。
肝纖維化是HBV/HCV相關(guān)性肝損傷的終末期表現(xiàn)，CHB患者的外周血與肝臟中出現(xiàn)高比例的KLRG1+NK細(xì)胞，其表面高表達(dá)的TRAIL可以結(jié)合HSC表面的DR5，從而誘導(dǎo)HSC的凋亡。同時(shí)，HSC所產(chǎn)生的骨橋蛋白與KLRG1+NK細(xì)胞表面CD44相互結(jié)合，從而促進(jìn)KLRG1+NK細(xì)胞產(chǎn)生IFN-γ，延緩肝纖維化的發(fā)展[99]。此外，慢性HCV感染所誘導(dǎo)的肝臟炎癥環(huán)境可能會(huì)導(dǎo)致肝臟較低的氧氣水平[100]，而組織中的低氧環(huán)境已被證明可以調(diào)節(jié)NK細(xì)胞的功能[101]。但研究發(fā)現(xiàn)，在體外低氧環(huán)境下，NK細(xì)胞活化性受體NKp46、NKG2D表達(dá)下調(diào)，分泌IFN-γ和抗病毒能力下降，而殺傷活化的HSC的能力幾乎不受影響，提示低氧環(huán)境對(duì)NK細(xì)胞分泌細(xì)胞因子和殺傷HSC的能力影響程度不同[102]。上述研究說(shuō)明，在慢性HBV/HCV感染向肝纖維化進(jìn)展的過(guò)程中，NK細(xì)胞對(duì)于HSC的殺傷作用可有效延緩疾病的進(jìn)程，其內(nèi)在機(jī)理和調(diào)控因素值得進(jìn)一步探究。
3.3腫瘤 肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是最常見的原發(fā)性肝癌，其發(fā)生發(fā)展與HBV、HCV的慢性感染以及脂肪肝的疾病進(jìn)展有關(guān)[103]。近十年來(lái)，肺癌、結(jié)腸癌和前列腺癌等癌癥的發(fā)病率都有所下降，而肝癌的發(fā)病率逐年上升，已成為全球癌癥相關(guān)死亡的主要原因之一[104]。與其他器官相比，NK細(xì)胞在健康肝臟中富集，肝臟NK細(xì)胞殺傷活性的增強(qiáng)對(duì)肝臟腫瘤的免疫監(jiān)測(cè)不可或缺。其中NK細(xì)胞活化性受體NKG2D對(duì)NK細(xì)胞識(shí)別和清除腫瘤具有非常重要的作用[105]，但肝癌組織NKG2D配體表達(dá)下調(diào)，從而逃避NK細(xì)胞的免疫監(jiān)視，靶向轉(zhuǎn)錄抑制因子EZH2可上調(diào)NKG2D配體的表達(dá)，從而增強(qiáng)NK細(xì)胞對(duì)肝癌細(xì)胞的殺傷作用[106]。除了細(xì)胞間直接接觸，活化的NK細(xì)胞產(chǎn)生IFN-γ對(duì)于抗腫瘤免疫同樣具有積極作用[107]。然而，在HBV轉(zhuǎn)基因小鼠模型中，肝臟NK細(xì)胞來(lái)源的IFN-γ通過(guò)EpCAM-EMT軸卻促進(jìn)了HCC的發(fā)生[108]，這提示NK細(xì)胞產(chǎn)生的IFN-γ可能在慢性炎癥向HCC轉(zhuǎn)化中起促進(jìn)作用，而在后期發(fā)揮抗腫瘤作用。
在HCC患者中，多種細(xì)胞作用于NK細(xì)胞影響其抗腫瘤功能。肝癌患者髓系來(lái)源的抑制細(xì)胞(MDSCs)以接觸依賴的方式直接抑制NK細(xì)胞的細(xì)胞毒作用和細(xì)胞因子的產(chǎn)生[109]。此外，腫瘤微環(huán)境中CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞增多，可能抑制腫瘤浸潤(rùn)的NK細(xì)胞產(chǎn)生IFN-γ并減弱其殺傷能力[107]。而經(jīng)過(guò)多靶點(diǎn)激酶抑制劑索拉非尼處理的巨噬細(xì)胞與NK細(xì)胞共培養(yǎng)可以誘導(dǎo)NK細(xì)胞的活化與擴(kuò)增[110]。HCC的發(fā)生過(guò)程往往伴隨抑制性細(xì)胞的產(chǎn)生，這些細(xì)胞通過(guò)直接接觸或者分泌細(xì)胞因子的方式負(fù)調(diào)免疫系統(tǒng)中的效應(yīng)細(xì)胞，進(jìn)而加速HCC的進(jìn)程。針對(duì)細(xì)胞間復(fù)雜調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的研究對(duì)于了解NK細(xì)胞在腫瘤發(fā)生發(fā)展中功能狀態(tài)的變化尤為必要。
免疫卡控點(diǎn)阻斷療法是近年來(lái)腫瘤治療領(lǐng)域的重要突破，基于逆轉(zhuǎn)NK細(xì)胞功能耗竭的免疫卡控點(diǎn)療法可能為HCC的治療提供新思路。HCC患者肝組織中，NKG2A高表達(dá)的CD56dimNK細(xì)胞與瘤內(nèi)肝癌組織表達(dá)的NKG2A配體HLA-E相互作用，使NK細(xì)胞功能耗竭，并與不良愈后相關(guān)[111]。對(duì)HCC患者樣本進(jìn)行相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，編碼CD96和LAG-3等抑制性卡控點(diǎn)受體的基因在CD49a+NK細(xì)胞上的表達(dá)水平顯著高于CD49a-NK細(xì)胞，研究表明，CD96和LAG-3在免疫細(xì)胞上的高表達(dá)使其呈現(xiàn)一種功能耗竭表型從而造成了腫瘤的免疫逃逸[112,113]，CD49a+NK細(xì)胞在肝臟腫瘤中的積累可能會(huì)導(dǎo)致疾病狀況惡化和愈后較差[114]。此外，小鼠LrNK細(xì)胞高表達(dá)的抑制性受體PD-L1與肝臟T細(xì)胞表面的PD-1結(jié)合進(jìn)而抑制適應(yīng)性免疫應(yīng)答，通過(guò)阻斷PD-1-PD-L1軸可有效恢復(fù)T細(xì)胞功能[74]。這些發(fā)現(xiàn)為HCC臨床治療提供了新的靶標(biāo)。同時(shí)，免疫卡控點(diǎn)阻斷通過(guò)增加免疫系統(tǒng)的活性可能會(huì)產(chǎn)生炎癥副作用[115]，所以，進(jìn)行免疫卡控點(diǎn)阻斷治療的患者需要進(jìn)行多方面的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估以降低臨床治療可能帶來(lái)的負(fù)面影響。
圖2 人類肝臟NK細(xì)胞與肝臟疾病的關(guān)系
Fig.2 Relationship between human liver NK cells and liver disease
Note: Human liver NK cells play an important role in the development of HBV/HCV infection,liver fibrosis and hepatocellular carcinoma (HCC).During acute hepatovirus infection,activated NK cells kill virus-infected target cells and release effector cytokines to control virus infection,but over-activation of NK cells may cause liver damage.However,in chronic infectious disease and HCC,NK cells gradually become exhausted with disease progression.
4 總結(jié)與展望
肝臟作為最大的實(shí)體器官，具有獨(dú)特的免疫學(xué)特性，肝臟含有包括NK細(xì)胞在內(nèi)的大量淋巴細(xì)胞[116]，穩(wěn)態(tài)下肝臟NK細(xì)胞與外周NK細(xì)胞顯著不同，其表現(xiàn)出獨(dú)特的表型和功能特征且具有肝臟特異性[41,117]。以往研究表明肝臟NK細(xì)胞在病毒性肝炎、肝纖維化和肝癌等疾病的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用(圖2)。對(duì)于肝臟疾病患者的肝臟NK細(xì)胞進(jìn)行表型與功能的全面研究為肝臟疾病治療提供了新思路。目前，關(guān)于人類與小鼠肝臟NK細(xì)胞亞群的研究又將NK細(xì)胞進(jìn)一步劃分為cNK細(xì)胞和LrNK細(xì)胞[40,44]，探索不同肝臟NK細(xì)胞亞群在肝臟疾病中的分工可能成為未來(lái)的研究熱點(diǎn)。此外，在慢性噬肝病毒感染和肝癌發(fā)生發(fā)展的過(guò)程中，NK細(xì)胞往往處于免疫抑制的狀態(tài)，針對(duì)NK細(xì)胞上的抑制性受體開發(fā)相關(guān)阻斷抗體或拮抗劑，可以逆轉(zhuǎn)NK細(xì)胞的耗竭狀態(tài)并恢復(fù)NK細(xì)胞的功能，從而控制疾病的發(fā)展；然而NK細(xì)胞的過(guò)度活化可能誘使肝細(xì)胞死亡，加重肝臟損傷，因此，在評(píng)估免疫卡控點(diǎn)阻斷療法時(shí)，需要綜合考慮NK細(xì)胞潛在的價(jià)值和風(fēng)險(xiǎn)。
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