響應(yīng)面法優(yōu)化凍綠果實黃酮提取工藝

張蕾,孫丹丹,孔冬梅

(山西大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院,山西 太原 030006)

凍綠(Rhamnusutilis)是我國分布較廣的一種落葉灌木或小喬木,隸屬于鼠李科鼠李屬。凍綠果實具有清熱利濕、消積通便的功效[1]。我國部分地區(qū)有將其果實和葉片用來助消化、解酒、保肝、抗病毒等民間應(yīng)用,但關(guān)于凍綠藥理作用或活性成分的研究鮮見報道。最近有研究發(fā)現(xiàn),凍綠莖的提取物可以明顯抑制大腸桿菌、痢疾桿菌、傷寒桿菌等致病菌,該研究還從其乙醇提取物中分離得到了槲皮素、墨沙酮、山萘素等8個化合物[2]。李碩等以凍綠種子為原料浸提油脂,并從中檢測到21種脂肪酸,其中含有豐富的人體必需的亞油酸和亞麻酸[3]。高霞等利用超聲輔助乙醇提取法測得凍綠葉含有高達35 mg/g的總黃酮,并推測這可能與凍綠葉較強的抗氧化功能和抑菌作用有關(guān)[4]。

鼠李屬植物中主要含有蒽醌[5-6]、蒽醌甙[7]、酚類[8]、黃酮[5,9-11]等化學(xué)成分。筆者的前期研究也表明,凍綠植株中含有豐富的黃酮類物質(zhì)。已知黃酮類化合物有抗氧化[12]、抗病毒[13]、保肝[14]、抗癌[15-16]、降低膽固醇[17]、改善血管通透性等生物活性及藥用價值[18-19],故研究凍綠黃酮具有一定的科學(xué)意義。目前未見凍綠果實黃酮相關(guān)方面的研究報道。本研究以凍綠果實為原料,采用響應(yīng)面法確定乙醇超聲輔助提取總黃酮工藝,并了解其含量,探討凍綠民間藥用的理論依據(jù),以期為凍綠資源的合理開發(fā)利用及其活性成分的深入研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

成熟的凍綠果實于2017年2月份采于山西省呂梁市交口縣石口鄉(xiāng)南山。

1.2 研究方法

1.2.1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

參考文獻[20]的方法稍加修改:稱取4 mg蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品,用體積百分數(shù)為60%乙醇配制成0.2 mg/mL的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液。精確量取該溶液、1、2、3、4、5 mL置于6支比色管中,每管加入體積百分數(shù)為5% NaNO2溶液0.3 mL,搖勻,靜置6 min;加入0.3 mL體積百分數(shù)為10% 硝酸鋁,搖勻,靜置6 min;加入體積百分數(shù)為4% NaOH溶液4 mL,搖勻;加入體積百分數(shù)為60%乙醇定容至10 mL,搖勻,靜置20 min,在510 nm下測定吸光度。以蘆丁溶液濃度為X軸,吸光度為Y軸,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,擬合得到線性回歸方程Y=10.286X+0.010 7,相關(guān)系數(shù)R2=0.999 2。

1.2.2 凍綠果實黃酮樣品溶液的制備

新鮮凍綠果實于電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱中40℃下烘干至恒重,粉碎機粉碎,過70目篩。稱量1 g粉末,加入一定體積的乙醇溶液,搖勻后放入數(shù)控超聲清洗儀中40 kHz功率下進行超聲提取,處理后的溶液在10 000 r/min條件下離心15 min;取上清液,加60%乙醇將體積定容到50 mL得樣品溶液。

1.2.3 單因素試驗設(shè)計

分別設(shè)定不同的液料比(15、20、25、30、35、40 mg/L)、乙醇濃度(40%、50%、60%、70%、80%、90%，體積百分數(shù)，下同)、提取溫度(20、30、40、50、60、70 ℃)和提取時間(10、20、30、40、50、60 min)對凍綠果實黃酮進行超聲提取,考察這4個因素對黃酮提取量的影響。所有試驗均重復(fù)3次。

1.2.4 響應(yīng)面法優(yōu)化凍綠果實黃酮的提取工藝

根據(jù)Box-Behnken中心組合設(shè)計原理,在單因素試驗結(jié)果的基礎(chǔ)上,用Desingn-Expert 8.0.6軟件設(shè)計響應(yīng)面試驗,試驗因素及水平見表1。

表1 響應(yīng)面試驗因素與水平

1.2.5 樣品溶液中黃酮含量的測定

取樣品溶液5 mL,加入60%乙醇溶液定容到10 mL,即稀釋2倍。取稀釋液1 mL,按照1.2.1的方法測定樣品溶液在510 nm波長下的吸光值。依據(jù)蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線計算出樣品溶液濃度c(mg/mL),再由以下公式(1)計算出凍綠果實黃酮提取量。

(1)

1.3 數(shù)據(jù)處理

單因素試驗數(shù)據(jù)用Excel 2016和Origin 8.0軟件處理,結(jié)果以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(SE)表示,響應(yīng)面試驗結(jié)果用Design-Expert 8.0.6軟件分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗結(jié)果

2.1.1 液料比對凍綠果實黃酮提取量的影響

在不同液料比條件下,用60%的乙醇對凍綠果實粉末在20℃下超聲處理20 min,黃酮提取量隨液料比的變化趨勢如圖1(A)所示?？芍?隨著液料比的增加,黃酮的提取量先增大后減小,當(dāng)液料比為35∶1時,黃酮提取量最大。這是因為當(dāng)液料比較小時,隨著液料比的增加,凍綠果實粉末與提取液的接觸面增加,黃酮類物質(zhì)向溶劑溶出的阻力減小,使得提取液中溶解的黃酮含量增加。當(dāng)液料比達到35∶1后繼續(xù)增大,可能會因為過多的溶劑對超聲波產(chǎn)生一定的吸收,或因溶劑體積過大而影響傳質(zhì)過程,從而導(dǎo)致提取液中的黃酮類物質(zhì)不增反降[21]。所以，35∶1的液料比較適宜。

2.1.2 乙醇濃度對凍綠果實黃酮提取量的影響

按35 mg/L的液料比加入不同濃度的乙醇,在40℃下對凍綠果實粉末超聲處理20 min,黃酮提取量隨乙醇濃度的變化見圖1(B)?？梢钥闯?當(dāng)乙醇濃度為40%～60%時,凍綠果實黃酮的提取量隨乙醇濃度的增加緩慢增大,當(dāng)乙醇體積百分數(shù)達到70%時,黃酮提取量迅速達到最高,之后隨著乙醇濃度提高,黃酮提取量又迅速下降。這主要是由于提取劑隨著乙醇濃度的變化其極性發(fā)生變化,只有在適當(dāng)極性下才能保證提取劑中黃酮的溶解量達到最大。因此,乙醇濃度為70%時較利于凍綠果實黃酮的提取。

圖1 各單因素對凍綠果實黃酮提取量的影響

2.1.3 提取溫度對凍綠果實黃酮提取量的影響

將35 mL體積百分數(shù)為70%的乙醇溶液加入1 g凍綠粉末中,在不同溫度下超聲處理20 min，結(jié)果見圖1(C)。由圖1(C)可知,隨著提取溫度的升高,黃酮提取量也在增加,40℃時黃酮提取量達最大,超過40℃后溫度越高黃酮提取量越小。這可能是由于分子運動會隨溫度升高而加快,從而使黃酮類化合物的溶解度增加,但過高的溫度又會使熱敏性的黃酮類化合物結(jié)構(gòu)遭到破壞[22],使得溶液中總黃酮含量降低。因此，提取溫度控制在40℃左右比較適宜。

2.1.4 提取時間對凍綠果實黃酮提取量的影響

1 g凍綠粉末中加入70%的乙醇溶液35 mL,并在40℃下進行超聲提取，結(jié)果見圖1(D)。由圖1(D)可知,隨著提取時間的增加,凍綠黃酮的提取量先增加后減少,20 min時黃酮提取量達最大。這是因為黃酮類物質(zhì)的充分溶出需要足夠的時間,但過長時間的超聲作用可能使部分黃酮類成分發(fā)生降解。因此,選擇提取時間20 min比較適宜。

2.2 響應(yīng)面試驗結(jié)果

響應(yīng)面試驗方案和結(jié)果如表2所示。

2.2.1 模型建立與顯著性分析

對試驗結(jié)果經(jīng)過二次回歸擬合后,得出回歸方程如下:

Y=61.70+5.24A-0.85B-2.32C-1.63D-1.25AB+2.53AC+0.86AD+2.52BC+0.63BD+0.43CD-5.60A2-1.07B2-5.29C2-3.78D2

對上述回歸模型進行方差分析,結(jié)果見表3。模型R2=0.9876,說明響應(yīng)值和自變量之間的關(guān)系顯著,模型與實際試驗值擬合較好。模型P<0.000 1,表明該方程模型達到極顯著水平。失擬項P=0.328 3>0.100 0,表明該回歸模型良好擬合了試驗結(jié)果,試驗誤差小。因此,可用這個回歸模型分析和預(yù)測超聲輔助提取凍綠果實黃酮量的結(jié)果。

各項方差分析表明,一次項B、C和D對試驗結(jié)果影響極顯著(P<0.01),根據(jù)F值可知,各因素對黃酮提取量的影響由大到小依次為:提取時間>提取溫度>乙醇體積百分數(shù)>液料比。二次項中AB、AC和BC對試驗結(jié)果影響極顯著(P<0.01),AD對試驗結(jié)果影響顯著(P<0.05)。平方項各值均對試驗結(jié)果有極顯著影響(P<0.01)。

表2 響應(yīng)面試驗設(shè)計方案及結(jié)果

2.2.2 響應(yīng)面交互作用分析

根據(jù)回歸模型繪制出交互因素響應(yīng)面圖(圖2)。

曲面的陡峭程度反映了響應(yīng)值對操作條件變化的敏感程度。由圖2可以看出,四個因素中兩兩之間存在一定交互作用。結(jié)合表3可知,雖然單因素液料比對黃酮提取量的影響不顯著,但液料比與其他任一因素的交互作用都達到顯著水平,同時單因素提取時間對黃酮提取量的影響最大,但它與提取溫度和與乙醇濃度之間的交互作用并未達到顯著水平,顯示不同工藝條件與黃酮提取量之間存在一種復(fù)雜的非線性關(guān)系。等高線的圓心處是響應(yīng)值存在極值的操作條件。

表3 回歸方程方差分析

2.2.3 工藝確定及模型驗證

用Design-Expert 軟件對上述模型進行分析,得出最佳理論點為液料比35.06(mL:g)、乙醇體積百分數(shù)65.44%、提取溫度38.25℃和提取時間18.45 min,此時得到凍綠果實黃酮提取量的理論最大值為62.57 mg/g干重。為方便操作,將各理論點分別調(diào)整為液料比35(mL:g),乙醇體積百分數(shù)65%、提取溫度38 ℃,提取時間18 min,進行3次平行驗證試驗,實際得到黃酮提取量平均值為62.36 mg/g干重,與理論最大值接近，說明回歸模型可以較好地反映出凍綠果實黃酮提取的最佳條件。

3 討論

已有研究表明,鼠李屬的植物普遍含有黃酮類物質(zhì),且不同部位黃酮含量會有一定差異。Ye等對新疆鼠李(R.songorica)黃酮含量測定的結(jié)果顯示,總黃酮在不同部位的分布情況為果實(11.41%)>葉片(2.42%)>莖(1.10%)[9]。本研究在凍綠果實中提取到黃酮含量為62.36 mg/g干重,遠高于高霞在葉片中提取到的黃酮含量35.07 mg/g干重[4],這一點與新疆鼠李的結(jié)果類似。除了物種和部位的不同外,提取工藝可能是造成不同部位黃酮含量差異的另一個因素,總黃酮成分構(gòu)成復(fù)雜,植物體不同部位所適合的提取工藝可能會有所不同,而同一部位使用不同方法提取效果也會有所差異[23]。菠蘿蜜(Artocarpusheterophyllus)果皮黃酮提取研究發(fā)現(xiàn),在最優(yōu)工藝條件下,酶法提取黃酮類化合物得率和純度均高于有機溶劑浸提法,提取物的抗氧化性也是前者強于后者[24]。本研究所用成熟果實和高霞研究中所用幼嫩葉片是不同季節(jié)采自同一地點的凍綠種群,且均是用超聲輔助乙醇溶劑的方法提取黃酮[4],所以取材部位和采集時間是造成二者黃酮含量差異的主要原因。從已有報道來看,由于植物種類、取材部位、提取方法、采集時間等內(nèi)外因素的不同,不同植物材料提取所得黃酮含量往往有較大差異,如均以材料干重計,灰棗(Zizyphusjujubecv. Huizao)果肉總黃酮含量僅為3.266 mg/g[25],苦參(Sophoraflavescens)種子總黃酮含量約13.49 mg/g[26],銀杏(Ginkgobiloba)葉和牡丹(Paeoniasuffruticasa)種皮的黃酮含量分別為55.4[27]和74.839 mg/g[17],金花葵(Hibiscusmanihot)花中總黃酮含量則高達126.67 mg/g[28]。本研究所得凍綠果實總黃酮含量處于中等水平。

圖2 各因素交互作用對凍綠果實黃酮提取量影響的響應(yīng)面圖

4 結(jié)論

對凍綠果實黃酮提取工藝進行探究,采用超聲輔助乙醇提取法,單因素試驗考察了不同因素對提取量的影響,進一步的響應(yīng)面試驗得到了可預(yù)測黃酮提取量的二次回歸模型。模型分析表明,凍綠果實黃酮超聲輔助提取最優(yōu)的工藝條件為液料比35(mL:g)、乙醇體積百分數(shù)65%、提取溫度38 ℃、提取時間18 min。在該條件下,凍綠果實黃酮實際提取量為62.36 mg/g干重,與理論值62.57 mg/g干重基本吻合。該工藝條件可為凍綠資源的開發(fā)利用提供理論參考。

致謝感謝山西省呂梁市交口縣衛(wèi)明診所的衛(wèi)明大夫在凍綠果實采集過程中所提供的幫助。