抗PVY 云煙87 定向改良新品種“云煙301”的選育及特征特性

劉勇，黃昌軍，曾建敏，肖炳光，于海芹，李永平

云南省煙草農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院/國家煙草基因工程研究中心，昆明 650021

烤煙品種云煙87 是云南省煙草農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院選育的優(yōu)良品種，具有生態(tài)適用性好、易栽易烤等優(yōu)點[1]，原煙清香型風(fēng)格突出，被卷煙工業(yè)企業(yè)廣泛接受，連續(xù)10 多年為我國烤煙主栽品種。云煙87 年均種植面積達(dá)600 萬畝（40 萬公頃），但云煙87 易感馬鈴薯Y 病毒?。≒otato virus Y，PVY）。PVY 是我國煙草上的重要病害，每年造成的損失位列十大煙草侵染性病害名單前列[2-3]。我國受PVY 威脅烤煙面積年均300 萬畝（20 萬公頃）。生產(chǎn)上主要采取治蟲防病、藥劑防治等措施防治，防治效果不高。局部地區(qū)PVY 暴發(fā)的情況仍然時有發(fā)生，PVY 的防控仍然是煙葉生產(chǎn)中的一個熱點和難點[4-8]。種植抗病品種是防控PVY 的經(jīng)濟有效手段，但前提條件是抗病品種的抗性高、生態(tài)適應(yīng)性好且無產(chǎn)量質(zhì)量劣勢。目前，我國缺乏高抗PVY 的自育主栽品種，國外引進(jìn)的高抗PVY 烤煙雜交種，如：NC55、NC102，由于生態(tài)適用性等原因，種植面積占PVY 危害面積的比重較小，由于雄性不育也不能作為育種親本利用。我國審定的烤煙新品種多，但主栽品種一直是云煙87、K326 等。主要原因是新審定品種的栽培烘烤特性、原料風(fēng)格特征和感官質(zhì)量與特定產(chǎn)區(qū)原有主栽品種存在較大差異，工農(nóng)業(yè)適應(yīng)調(diào)整的風(fēng)險和成本較大。采用常規(guī)雜交、系譜選育方法，難以達(dá)到定向改良主栽品種抗性的目標(biāo)。

《煙草基因組計劃重大專項》實施為烤煙主栽品種定向改良創(chuàng)造了技術(shù)條件。項目組在“十二五”期間克隆了煙草感PVY 的eIF4E1 基因[9-10]（va 位點缺失eIF4E1 基因表現(xiàn)為抗?。?、開發(fā)出基因功能分子標(biāo)記[11]、鑒定出抗PVY 種質(zhì)資源。鄭州煙草研究院等單位研發(fā)出栽培煙草全基因組芯片。在《煙草基因組計劃重大專項》的部署下，確定育種目標(biāo)為定向改良云煙87 的PVY 抗性，滿足我國PVY 危害較重地區(qū)煙葉生產(chǎn)穩(wěn)定發(fā)展和工業(yè)企業(yè)對優(yōu)良品種的需求。

抗PVY 云煙87 的定向改良育種過程如下：采用常規(guī)雜交和分子標(biāo)記輔助選擇將va 位點導(dǎo)入云煙87，通過4 次回交恢復(fù)云煙87 的遺傳背景。獲得BC4F2后，通過連續(xù)田間株系比較，篩選株型、農(nóng)藝性狀類似云煙87 株系（BC4F5）。然后采用煙草全基因組芯片進(jìn)行遺傳背景檢測，篩選出遺傳背景恢復(fù)率最高的單株，自交收獲品系BC4F6。再進(jìn)行品系比較、生產(chǎn)試驗、農(nóng)業(yè)評審、工業(yè)驗證和審定。

抗PVY 云煙87 新品種“云煙301”保留了云煙87 品種優(yōu)良栽培烘烤特性、風(fēng)格特征和感官質(zhì)量，能低成本高效綠色防控PVY 病害，農(nóng)業(yè)上易栽易烤好收購，工業(yè)上知根知底不必改配方，具有良好的推廣應(yīng)用前景。

1 選育過程

親本來源：母本為云煙87，其系譜為K326×云煙二號，云煙二號的系譜為G-28×紅花大金元。父本為攜帶va 位點的種質(zhì)資源RY2 衍生的育種中間材料。RY2 具有美國烤煙系譜，具有高抗PVY 的優(yōu)點，在水肥條件較差的情況下長勢偏弱、氣候斑較重。前期利用RY2 與云煙85（簡稱Y85）雜交，獲得抗PVY 的F2單株（以Y85×RY2/F2表示）。

圖1 云煙301 選育過程Fig. 1 Breeding process of Yunyan 301

在克隆煙草感PVY 基因eIF4E1、開發(fā)功能性分子標(biāo)記、掌握國內(nèi)外抗PVY 品種和種質(zhì)資源基因型過程中，明確了定向改良云煙87 的PVY 抗性的育種目標(biāo)。以Y85×RY2/F2作為抗性供體親本（父本），通過連續(xù)回交、雜交、分子標(biāo)記輔助選擇、全基因組基因芯片背景檢測等技術(shù)定向改良云煙87 的PVY 抗性。2010 年配制雜交組合，2011—2014 年進(jìn)行回交，2015—2016 年進(jìn)行株（品）系比較，2017 年進(jìn)行遺傳背景評價、品系比較和小面積生產(chǎn)示范。2017 年8月，在云南省昆明市石林縣通過由國家煙草專賣局科技司和中國煙葉公司組織的田間鑒評。2018 年參加全國（西南區(qū)）生產(chǎn)試驗，通過農(nóng)業(yè)評審和審定。

2 遺傳背景SNP 芯片評價

由中國煙草總公司鄭州煙草研究院采用四倍體煙草基因分型基因芯片（Tobacco 420k SNP array）進(jìn)行遺傳背景選擇。該款芯片包含了432362 個煙草SNP位點，并均勻分布整個煙草基因組。將芯片實驗數(shù)據(jù)過濾，獲得410301 個SNP 位點分型數(shù)據(jù)。基于親本RY2 和云煙87 間多態(tài)性SNP 篩選，獲得19187 個雙親間多態(tài)性純合SNP 位點，其中14257 個純合SNP位點定位在紅花大金元染色體上。

挑選10 個BC4F5進(jìn)行品系比較試驗，根據(jù)長勢、整齊度、葉形與葉片大小等植物學(xué)性狀和農(nóng)藝性狀挑選優(yōu)系，對中選優(yōu)系的姊妹單株進(jìn)行SNP基因型分型，分別統(tǒng)計姊妹單株與云煙87 一致的SNP 位點數(shù)量，并計算姊妹單株的遺傳背景恢復(fù)率。遺傳背景恢復(fù)率以與云煙87 一致的位點總數(shù)占雙親間的多態(tài)純合SNP 總數(shù)的百分比表示。遺傳背景恢復(fù)率最高的一個單株RY21-1(4)達(dá)到99.43%，其余4 個BC4F5的姊妹單株的遺傳背景恢復(fù)率在97.20%～97.34%之間（表1）。5 個BC4F5的姊妹單株與云煙87 不一致的SNP位點數(shù)在110～537 個之間，5 個單株之間存在一定數(shù)量的來自供體親本的相同SNP 位點（未列出數(shù)據(jù)）。綜上所述，這些BC4F5單株與云煙87 間的僅存在很小的遺傳背景差異。

表1 部分BC4F5 單株的遺傳背景恢復(fù)率Tab. 1 Genetic background recovery rate for some BC4F5 single plant

圖2 RY21-1(4)與云煙87 間多態(tài)SNP 位點分布（補齊染色體）Fig. 2 Polymorphic SNP site distribution between RY21-1 (4) and Yunyan87 (complemented chromosome)

其中遺傳背景恢復(fù)率最高單株為RY21-1(4)。該單株與云煙87 相比，在第2、5、9、12、22 號等5條染色體上存在6 個供體親本的染色體片段（圖1）。RY21-1(4)自交獲得抗PVY 云煙87 新品系（BC4F6），編號為RY21。RY21 審定后定名為云煙301（審定編號201807）。

3 主要植物學(xué)性狀

云煙301 株型塔形，葉片長橢圓形，葉色綠，莖葉角度中，田間長勢強、煙株整齊度較好，分層落黃特征明顯，大田生育期平均為125.7 天、與云煙87和K326 相當(dāng)。

4 主要農(nóng)藝性狀

按照“煙草品種審定評價與評分方法”綜合2016—2018 年試驗調(diào)查結(jié)果（表2），云煙301 田間生長整齊一致，平均打頂株高122.45 cm，稍高于對照品種云煙87； 平均有效葉片數(shù)20.41；平均莖圍10.79 cm；平均腰葉長78.64 cm 寬30.92 cm；有效葉片數(shù)、莖圍、腰葉長寬與對照云煙87 相當(dāng)。

表2 云煙301 農(nóng)藝性狀Tab. 2 Agronomic characteristics of Yunyan301

5 主要經(jīng)濟性狀

在昭通昭陽區(qū)PVY 高發(fā)病區(qū)，2016—2017 年品系比較結(jié)果表明， 云煙301 表現(xiàn)為高抗， PVY 的發(fā)病率為0，而對照品種云煙87 打頂后PVY 發(fā)病率為22.0%。云煙301 主要經(jīng)濟性狀明顯優(yōu)于對照云煙87，平均畝產(chǎn)量、畝產(chǎn)值和上等煙比例高于云煙87（表3）。表明云煙301 替代云煙87 可有效挽回PVY 病害造成的產(chǎn)質(zhì)量損失。

表3 2016—2017 年品系比較試驗云煙301 主要經(jīng)濟性狀（PVY 高發(fā)病田）Tab. 3 Variety test of lines of Yunyan301 main economic characteristics (PVY high-incidence field) in 2016—2017

表4 云煙301 經(jīng)濟性狀（PVY 發(fā)病率小于1%）Tab. 4 Economic characteristics of Yunyan301（PVY incidence less than 1%）

在PVY 發(fā)病率低于1%的情況下，按照“煙草品種審定評價與評分方法”綜合2016—2018 年試驗結(jié)果（表4），云煙301 的畝產(chǎn)量185.14 kg、畝產(chǎn)值4899.58 元、上等煙比例50.1%，與對照品種云煙87相當(dāng)，顯著優(yōu)于對照品種K326。表明在PVY 發(fā)病率低于1%的情況下，云煙301 的經(jīng)濟性狀與云煙87相當(dāng)。

6 抗病性

室內(nèi)苗期人工接種鑒定，云煙301 的PVY 發(fā)病率為0，對照云煙87 的PVY 發(fā)病率為100%。在昭通昭陽區(qū)自然發(fā)病條件下，云煙301 的發(fā)病率為0，對照云煙87 的PVY 發(fā)病率為22.0%。在昆明石林團(tuán)棵期人工接種PVY 情況下，接種后30 天云煙301 發(fā)病率為0，對照云煙87 的PVY 發(fā)病率為78.9%。表明云煙301 高抗PVY（表5）。

表5 云煙301 人工接種PVY 抗性Tab. 5 PVY resistance of Yunyan301 in artificial inoculation

云煙301 由全國區(qū)試5 家科研單位（中國煙草總公司青州煙草研究所、云南省煙草農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院、貴州省煙草科學(xué)研究院、中國煙草東南農(nóng)業(yè)試驗站、中國煙草東北農(nóng)業(yè)試驗站）進(jìn)行人工誘發(fā)抗性鑒定。云煙301 抗PVY，中抗黑脛病、根結(jié)線蟲病和青枯病，中感赤星病和TMV。對照品種云煙87 中感PVY，中抗黑脛病、根結(jié)線蟲病和青枯病，中感赤星病和TMV（表6）。云煙301 的PVY 抗性顯著高于對照品種云煙87、對其他病害的抗性與對照品種云煙87相當(dāng)。

表6 云煙301 的抗病性Tab. 6 The disease resistance of Yunyan301

7 原煙外觀質(zhì)量

2016—2017 年云南玉溪、昆明、曲靖、昭通品系比較試驗原煙外觀質(zhì)量結(jié)果：云煙301顏色“桔黃”，成熟度“成熟”，結(jié)構(gòu)“疏松～尚疏松”，身份“中等～稍薄”，油分“稍有～有”，色度“中～弱”；整體外觀質(zhì)量與云煙87 相當(dāng)。

鄭州煙草研究院對2018 年云南玉溪、云南楚雄、云南紅河、貴州畢節(jié)生產(chǎn)試驗樣品進(jìn)行外觀質(zhì)量評價，云煙301 煙葉顏色多為金黃，少量屬微帶青范疇；煙葉成熟度多為“成熟”檔次，少量“尚熟”；煙葉葉片結(jié)構(gòu)多為“疏松”檔次，少量“尚疏松”；煙葉身份多為“中等”，少量“稍薄”，個別“稍厚”；煙葉油分多為“有”檔次，少量“稍有”；煙葉色度多為“中”檔次，分別有少量煙葉屬于“強”和“弱”檔次。 綜合4 個示范點云煙301 品種煙葉的外觀質(zhì)量與對照品種云煙87 相當(dāng)。

8 原煙內(nèi)在品質(zhì)

8.1 主要化學(xué)成分

云南省煙草農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院分析測試中心對2016—2017 年云南玉溪、昆明、昭通品系比較試驗進(jìn)行了中部葉化學(xué)成分測定，云煙301 的煙堿平均含量1.80%、總氮平均含量1.64%、還原糖平均含量25.05%、總糖平均含量32.25%、鉀平均含量1.89%。氯平均含量0.18%、淀粉平均含量4.41%（表7）。云煙301 的各化學(xué)成分含量均在適宜范圍之內(nèi)，內(nèi)在化學(xué)成分協(xié)調(diào)性較好，與對照品種云煙87 相當(dāng)。

表7 區(qū)域比較試驗中部葉化學(xué)成分（2016—2017 年）Tab. 7 The chemical composition of middle leaf in region test（2016-2017）

鄭州煙草研究院對2018 年云南玉溪、云南楚雄、云南紅河、貴州畢節(jié)生產(chǎn)試驗樣品進(jìn)行化學(xué)成分測定，云煙301 中部煙葉總植物堿含量在1.73%～3.44%之間，平均2.59%，總氮含量1.72%～2.59%，平均2.13%，還原糖含量16.06%～26.68%，平均20.98%，鉀 含 量1.65%～1.89%， 平 均1.79%， 淀 粉 含 量3.29%～4.58%，平均3.73%。與對照品種相比，云煙301 品種煙葉的總糖含量略低，其余指標(biāo)不存在穩(wěn)定差異。

8.2 物理特性

鄭州煙草研究院對2018 年云南玉溪、云南楚雄、云南紅河、貴州畢節(jié)生產(chǎn)試驗樣品進(jìn)行物理特性測定，云煙301 中部煙葉厚度在0.116 mm ～0.174 mm 范圍，平均0.139 mm；葉面密度在59.15 g/m2～84.10 g/m2之間，平均70.58 g/m2；單葉質(zhì)量在11.43 g ～17.44 g 之間，平均13.69 g；平衡含水率在12.42%～13.35%之間，平均12.80%；含梗率在29.01%～33.97%之間，平均31.94%。與對照相比，云煙301 品種煙葉的含梗率略高，其余指標(biāo)不存在穩(wěn)定差異。

8.3 感官質(zhì)量

國家煙草專賣局科技司和中國煙葉公司組織13位行業(yè)卷煙評委組成感官質(zhì)量評價專家組，對2018年定向改良品種樣品與相同試驗點種植的對照品種樣品進(jìn)行了感官質(zhì)量評價。評價結(jié)論如下：云煙301 與對照云煙87 品種的總體風(fēng)格特征一致，各項質(zhì)量指標(biāo)無明顯差異，感官質(zhì)量評價總體一致；風(fēng)格特色彰顯程度與原云煙87 對照樣品一致。就樣品而言，云煙301 在工業(yè)上可替代云煙87 使用。

云南玉溪、云南楚雄、云南紅河、貴州畢節(jié)2018年的生產(chǎn)試驗樣品，由中國煙草總公司鄭州煙草研究院組織9 家工業(yè)企業(yè)進(jìn)行評價。云煙301 在云南玉溪、云南紅河的工業(yè)感官質(zhì)量平均分為74.52、72.52，對照平均分為73.68、71.90，云煙301 清甜香韻較明顯，香型風(fēng)格凸顯程度優(yōu)于對照云煙87。云煙301 在云南楚雄和貴州畢節(jié)平均分為69.01、65.29，對照平均分為70.91、66.16，云煙301 的香型風(fēng)格凸顯程度與對照基本相當(dāng)（表8）。綜合4 個試驗點，云煙301感官質(zhì)量與對照云煙87 基本一致。

表8 云煙301 與云煙87 感官質(zhì)量評價Tab. 8 Sensory quality evaluation of Yunyan300 and Yunyan87

9 適應(yīng)性和栽培調(diào)制技術(shù)要點

云煙301 在不同生態(tài)區(qū)試點的穩(wěn)定性、適應(yīng)性和豐產(chǎn)性表現(xiàn)良好。該品種需氮肥中等，與云煙87 相當(dāng)。N、P2O5、K2O 配比1 ∶1 ∶3。移栽后及時澆施提苗肥，移栽后30 d 內(nèi)施完追肥為宜。中心花開放打頂，有效留葉數(shù)20 片，打頂時摘除2 片無效底腳葉，以改善田間通風(fēng)透光條件，提高下部煙葉成熟度?？梢詤⒄赵茻?7 烘烤工藝和技術(shù)進(jìn)行烘烤。

10 品種綜合評價

云煙301 為利用基因組定向改良技術(shù)選育的烤煙純系品種（非轉(zhuǎn)基因），遺傳性狀穩(wěn)定。由國家煙草基因研究中心采用420k基因芯片進(jìn)行遺傳背景檢測，雙親間的多態(tài)性純合SNP 位點19187 個，按照與云煙87 一致位點數(shù)占總位點數(shù)計算，云煙301 的遺傳背景恢復(fù)為云煙87 的比率為99.43%，達(dá)到了定向改良品種遺傳背景一致性要求。

云煙301 株形為塔形，葉片長橢圓形，葉色綠，莖葉角度中等，主脈粗細(xì)中等。云南省區(qū)試和全國烤煙品種試驗（西南區(qū)）結(jié)果：有效葉數(shù)20.4片，打頂株高122.45 cm；莖圍10.79 cm，節(jié)距4.89 cm，腰葉長78.64 cm、寬30.92 cm，大田生育期125.7 天；除株高稍高外、農(nóng)藝性狀與對照品種云煙87 相當(dāng)。田間生長整齊一致，生長勢強，分層落黃特征明顯，較易烘烤。平均畝產(chǎn)量185.1 kg、平均上等煙比例50.1%，綜合經(jīng)濟性狀與對照品種云煙87相當(dāng)、優(yōu)于對照品種K326。初烤顏色桔黃，成熟度好，葉片結(jié)構(gòu)疏松，身份中等，油分有，色度中，整體外觀質(zhì)量與對照品種云煙87 相當(dāng)。主要化學(xué)成分含量與對照品種云煙87 相近，協(xié)調(diào)性好。云煙301 與對照品種云煙87 總體風(fēng)格特征一致，各項質(zhì)量指標(biāo)無明顯差異，感官質(zhì)量評價總體一致，風(fēng)格特色彰顯程度一致。

云煙301 適應(yīng)性較廣，需氮量與云煙87 相當(dāng)，N、P2O5、K2O 配比1 ∶1 ∶3。在烘烤過程中變黃、失水速度與云煙87 相似，稍快于K326。云煙301 的PVY 抗性顯著提高，保留了云煙87 的栽培烘烤特性、原煙風(fēng)格特征和感官質(zhì)量。在打頂后PVY 發(fā)病率達(dá)到1%的云煙87 種植區(qū)，具有良好的推廣前景。

致謝：感謝鄭州煙草研究院羅朝鵬、張劍鋒完成基因芯片檢測和數(shù)據(jù)分析。