防己黃芪湯對(duì)肥胖型高血壓大鼠血管內(nèi)皮保護(hù)作用機(jī)制研究

王建波 張晨新 馬永鋼 蔡昀潞 李秀靈 王洪薇 曲 怡

（遼寧中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)藥創(chuàng)新工程技術(shù)中心，遼寧沈陽110847）

高血壓作為心血管疾病發(fā)病及死亡的危險(xiǎn)因素之一，其臨床的發(fā)生率逐年升高，是常伴有心、腦、腎及主動(dòng)脈等器官的功能或器質(zhì)性損害的臨床綜合征[1]。根據(jù)《中國高血壓防治指南（2018 年修訂版）》[2]，中國人群高血壓的危險(xiǎn)因素主要包括高鈉低鉀膳食、超重和肥胖、過量飲酒、精神緊張和缺乏體力活動(dòng)等。近年來，我國肥胖型高血壓的發(fā)病率呈現(xiàn)逐年上升趨勢[3]。肥胖型高血壓伴隨的糖脂代謝紊亂會(huì)加重血管內(nèi)皮的炎癥反應(yīng)，進(jìn)一步加重靶器官的損傷。美國心臟協(xié)會(huì)、美國心臟病學(xué)會(huì)、肥胖學(xué)會(huì)《成人超重和肥胖管理指南》已經(jīng)明確了減重的降壓作用[4]：（1）體重減少3%～5%即可明顯改善糖脂代謝；（2）體重下降5%可使收縮壓和舒張壓分別下降3和2 mmHg。因此，對(duì)肥胖型高血壓患者體重的控制尤為重要。目前國內(nèi)針對(duì)肥胖型高血壓藥物治療常選用降壓藥聯(lián)合減肥藥物（奧利司他或具有減重作用的降糖藥物等），而難治類肥胖型高血壓并無有效控制手段，常輔助以代謝手術(shù)治療，造成很大的身體創(chuàng)傷，所以有效的肥胖型高血壓控制手段值得我們進(jìn)行深入研究。

現(xiàn)有研究表明，防己黃芪湯可以抑制進(jìn)食進(jìn)水欲望，改善內(nèi)臟體脂分布，調(diào)節(jié)瘦素、脂聯(lián)素水平，縮小脂肪細(xì)胞體積，改善炎癥反應(yīng)等，有減輕體重、降低血壓等功效[5]。本研究旨在明確防己黃芪湯對(duì)肥胖型高血壓大鼠血管內(nèi)皮的保護(hù)作用，為難治性肥胖型高血壓臨床治療提供新思路。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)雄性自發(fā)性高血壓大鼠（SHR）60只，Wistar-kyoto（WKY）大鼠10只，體質(zhì)量（200±10）g，由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（京）2019-0011。飼養(yǎng)環(huán)境：遼寧中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，濕度為（45±5）%，溫度為（22±1）℃。實(shí)驗(yàn)過程中對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的處置符合國家科技部頒布的《關(guān)于善待實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的指導(dǎo)性意見》的規(guī)定，本實(shí)驗(yàn)通過遼寧中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心倫理委員會(huì)審議同意并簽署批準(zhǔn)意見。

1.2 主要儀器 智能無創(chuàng)血壓計(jì)（BP-2010A日本）；熒光定量PCR儀（Applied Biosysterms 7500 Fast Real-Time PCR Systerm）；SpectraMax i3多 功 能 酶 標(biāo) 儀（奧 地 利，Molecu-lar Devices）；ABI Veriti梯 度PCR儀器（Applied Biosystems）；超微量紫外分光光度計(jì)（Thermo，NANO-DROP 2000）；數(shù)碼凝膠圖像處理系統(tǒng)（Tanon-5200，上海天能科技有限公司）；VE-386 半干轉(zhuǎn)移電泳槽、EPS-600 電泳儀、VE-180 垂直電泳槽（Tanon Science＆Technology Co.，Ltd，天能）。

1.3 藥物與試劑 防己黃芪湯藥物組成：防己12 g，黃芪15 g，白術(shù)9 g，甘草6 g，生姜10 g，大棗5 g。上述是成年人1日劑量，共57 g。根據(jù)體表面積法換算大鼠給藥量，算出低、中、高劑量藥物濃度分別 為3.125 g/kg、6.25 g/kg、9.375 g/kg。將 購 買 的藥物顆粒（遼寧省中醫(yī)院中藥局制）放入100 ℃蒸餾水中加熱溶解，分裝置于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩W利司他膠囊（重慶植恩藥物有限公司，批號(hào)20180604 W0039），成人每日用量為120 mg，按照人與大鼠給藥量換算，大鼠給藥量為1.23 g/kg。常溫蒸餾水溶解奧利司他，分裝置于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

LEP Elisa試劑盒（北京誠林，批號(hào)201911）；ADP Elisa試 劑 盒（北 京 誠 林，批 號(hào)201911）；PCR反轉(zhuǎn)試劑盒（康為世紀(jì)，批號(hào)40326）；PCR擴(kuò)增試劑盒（康為世紀(jì)，批號(hào)60407）；Trizol總RNA抽 提 試 劑（碧 云 天，批 號(hào)R0061）；PCR引物（博邁德引物合成公司）；組織/細(xì)胞裂解液（索萊寶，批號(hào)20190418）；蛋白酶抑制劑（索萊寶，批號(hào)0190505）；蛋白濃度測定試劑盒（碧云天，批號(hào)P0012S）；蛋白上樣緩沖液（凱基生物，批號(hào)051319190513）；發(fā)光液（碧云天，批號(hào)P0018S）；凝膠快速配置試劑盒（碧云天，批號(hào)P0012AC）；蛋白標(biāo)記物（凱基生物，批號(hào)20171113）；內(nèi)參一 抗（愛 必 信，批 號(hào)5814）；PPAR-γ一抗（圣克魯斯生物技術(shù)公司，批號(hào)00073972），二抗（安諾倫生物科技有限公司，批號(hào)RS0001）；PVDF膜（邁博瑞生物膜技術(shù)有限公司，批號(hào)R9EA30212）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 分組與造模 取WKY大鼠10只為空白組。取雄性SHR 60只，按隨機(jī)數(shù)字表法分為模型組、肥胖模型組、西藥組和防己黃芪湯低、中、高劑量組，每組10只。所有大鼠于SPF級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，均予普通飼料，監(jiān)測SHR收縮壓均大于150 mmHg。隨后進(jìn)入實(shí)驗(yàn)階段，空白組、模型組繼續(xù)普通飼料喂養(yǎng)，其余各組采用高脂飼料喂養(yǎng)。高脂飼料由基礎(chǔ)飼料加入動(dòng)物油15%、蔗糖18%、蛋黃3%，經(jīng)過滅菌后，陰涼處保存。造模期間，每周定時(shí)檢測2次血壓、體重與進(jìn)食量并記錄。當(dāng)除空白組、模型組外的其余各組大鼠體重超過空白組體重的20%[6]，血壓為160～179/100～109 mmHg，提示肥胖型高血壓大鼠模型復(fù)制成功。實(shí)驗(yàn)期間飲水飲食自由。

2.2 藥物干預(yù) 空白組整個(gè)實(shí)驗(yàn)期間正常飼養(yǎng)，不做任何處理。防己黃芪湯各劑量組大鼠分別予中藥顆粒劑溶液3.125 g/kg、6.25 g/kg、9.375 g/kg藥量灌胃，西藥組大鼠予1.23g/kg奧利司他溶液灌胃，模型組與肥胖模型組給予等量蒸餾水灌胃，各組均每日灌胃1次，連續(xù)4周。

2.3 取材 灌胃4 周后，所有大鼠禁食不禁水12 h，稱量體質(zhì)量后用10%水合氯醛腹腔注射麻醉（3 mL/kg體質(zhì)量），麻醉后用高壓滅菌后的手術(shù)剪打開腹腔，干凈紗布撥開臟器，找到腹主動(dòng)脈，取血后剔除血管粘連漿膜，用玻璃分針游離出胸主動(dòng)脈組織，修剪末支后置于凍存管中放入液氮保存。

2.4 觀察指標(biāo)

2.4.1 RT-PCR檢 測核 轉(zhuǎn)錄因子（NF-κB）、內(nèi)皮素-1（ET-1）、細(xì)胞間黏附分子-1（ICAM-1）mRNA表達(dá) 每個(gè)凍存管中取大鼠主動(dòng)脈100 mg，剪碎，取適量液氮研磨后，加入1 mL Trizol試劑勻漿提取總RNA，測定RNA的濃度和純度，然后進(jìn)行cDNA反轉(zhuǎn)錄，最后對(duì)反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進(jìn)行擴(kuò)增，反應(yīng)體系為20 μL，反 應(yīng) 條 件 為stage1（95 ℃，30 s）、stage2（95 ℃，5 s；60 ℃，34 s；40個(gè)循環(huán)）。溶解反應(yīng)按ABI 7500自動(dòng)設(shè)定的條件進(jìn)行，即：95 ℃，15 s；60 ℃，1 min；95 ℃，30 s；60 ℃，15 s。PCR所需特異性引物序列見表1。

表1 PCR 擴(kuò)增的特異性引物序列

2.4.2 Elisa法檢測主動(dòng)脈瘦素、脂聯(lián)素濃度 取各組主動(dòng)脈組織100 mg分裝各管，每管中加入一定量PBS（pH7.4）制成勻漿液，離心半徑為20 cm，3000 r/min離心15 min后，仔細(xì)收取上清。設(shè)置空白孔、標(biāo)準(zhǔn)品孔和待測樣本孔。在標(biāo)準(zhǔn)品孔加不同量的標(biāo)準(zhǔn)品及標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液共50 μL，在樣本孔中加入待測樣本50 μL；加入酶標(biāo)試劑50 μL，封板膜后37 ℃溫育30 min；洗滌4～5 次，加入顯色劑A、顯色劑B各50 μL，封板膜后37 ℃溫育30 min；最后加入終止液50 μL，450 nm波長測定各孔的吸光度。用標(biāo)準(zhǔn)品孔的OD值繪制y=ax+b曲線，將各組的數(shù)值代入可計(jì)算出主動(dòng)脈中瘦素、脂聯(lián)素濃度。

2.4.3 Western Blot檢測各組大鼠主動(dòng)脈組織過氧化物酶增殖物激活受體（PPAR-γ）蛋白表達(dá) 取主動(dòng)脈組織100 mg分裝各管，每管加入1 mL RIPA裂解液，研磨、離心后提取上清為總蛋白，用BCA蛋白濃度測定試劑盒測定主動(dòng)脈總的蛋白濃度，每孔上樣50 μg蛋白。灌制SDS-聚丙稀酰胺凝膠進(jìn)行電泳，分離膠電泳采用80 V電壓，120 V電壓進(jìn)行濃縮膠電泳。電泳結(jié)束后取出凝膠，將凝膠上的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，經(jīng)封閉液37 ℃封閉1 h后，4 ℃孵育一抗，過夜，TBST清洗后37 ℃孵育二抗1 h，TBST清洗后用ECL試劑盒檢測，使用數(shù)碼凝膠圖像處理系統(tǒng)成像，采用photoshop分析軟件檢測條帶灰度值，得出PPAR-γ/β-actin的灰度值比值，為PPAR-γ的相對(duì)表達(dá)量。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 20.0軟件分析系統(tǒng)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，數(shù)據(jù)均用（±s）表示，采用單因素方差分析進(jìn)行組間比較。組間方差齊時(shí)，采用LSD檢驗(yàn)；方差不齊時(shí)，采用Tamhane’s T2（M）檢驗(yàn)。P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 各組大鼠主動(dòng)脈組織NF-κB、ET-1、ICAM-1 mRNA

表達(dá)比較 結(jié)果見表2。與空白組比較，模型組和肥胖模型組大鼠主動(dòng)脈組織NF-κB、ET-1、ICAM-1 mRNA表達(dá)均明顯上調(diào)（P<0.05）；與模型組比較，肥胖模型組大鼠上述指標(biāo)表達(dá)明顯上調(diào)（P<0.05）；與肥胖模型組比較，各給藥組大鼠上述指標(biāo)表達(dá)明顯下調(diào)（P<0.05），其中防己黃芪湯高劑量組和西藥組下調(diào)最為明顯。

3.2 各組大鼠主動(dòng)脈組織瘦素、脂聯(lián)素表達(dá)比較 結(jié)果見表3。與空白組比較，模型組和肥胖模型組大鼠主動(dòng)脈組織瘦素、脂聯(lián)素表達(dá)明顯下調(diào)（P<0.05）；與模型組比較，肥胖模型組大鼠主動(dòng)脈組織瘦素、脂聯(lián)素表達(dá)明下調(diào)（P<0.05）；與肥胖模型組比較，各給藥組大鼠主動(dòng)脈組織瘦素、脂聯(lián)素表達(dá)明顯上調(diào)（P<0.05），其中高劑量組和西藥組上調(diào)最為明顯。

表2 各組大鼠胸主動(dòng)脈NF-κB、ET-1、ICAM-1 mRNA 表達(dá)比較（±s）

表2 各組大鼠胸主動(dòng)脈NF-κB、ET-1、ICAM-1 mRNA 表達(dá)比較（±s）

注： 與空白組比較，#P<0.05；與模型組比較，*P<0.05；與肥胖模型組比較，△P<0.05；與防己黃芪湯中劑量組比較，▲P<0.05；與西藥組比較，●P<0.05。

組別 動(dòng)物數(shù)/只 NF-κB ET-1 ICAM-1空白組 10 1.00±0.00 1.00±0.00 1.00±0.00模型組 10 10.40±2.59# 15.10±1.91# 7.79±2.44#肥胖模型組 10 29.15±5.62#* 26.90±1.79#* 32.01±2.05#*防己黃芪湯低劑量組 10 18.84±2.22#*△● 15.54±0.65#△● 29.20±2.31#*●防己黃芪湯中劑量組 10 8.49±3.36#△ 7.45±0.28#*△ 13.00±2.57#*△●防己黃芪湯高劑量組 10 1.14±0.53*△▲ 4.29±1.55#*△ 1.42±0.49*△▲西藥組 10 0.81±0.18*△▲ 5.18±1.45#*△ 1.31±0.09*△▲

表3 各組大鼠主動(dòng)脈組織瘦素、脂聯(lián)素表達(dá)比較（±s） 單位：μg/L

表3 各組大鼠主動(dòng)脈組織瘦素、脂聯(lián)素表達(dá)比較（±s） 單位：μg/L

注： 與空白組比較，#P<0.05；與模型組比較，*P<0.05；與肥胖模型組比較，△P<0.05；與防己黃芪湯中劑量組比較，▲P<0.05；與西藥組比較，●P<0.05。

組別 動(dòng)物數(shù)/只 瘦素 脂聯(lián)素空白組 10 19.58±0.91 152.98±5.05模型組 10 14.45±0.26# 70.93±4.26#肥胖模型組 10 10.70±0.35#* 56.68±5.50#*防己黃芪湯低劑量組 10 15.63±0.50#△● 71.21±7.74#△●防己黃芪湯中劑量組 10 18.17±0.63#*△ 117.31±14.71#*△●防己黃芪湯高劑量組 10 19.27±0.71*△ 143.15±9.57*△▲西藥組 10 20.14±1.21*△▲ 150.18±2.93*△▲

3.3 各組大鼠主動(dòng)脈組織PPAR-γ表達(dá)比較 見表4、圖1。與空白組比較，模型組和肥胖模型組大鼠主動(dòng)脈組織PPAR-γ蛋白表達(dá)明顯下調(diào)（P<0.05）；與模型組比較，肥胖模型組大鼠主動(dòng)脈組織PPAR-γ蛋白表達(dá)明顯下調(diào)（P<0.05）；與肥胖模型組比較，各治療組大鼠主動(dòng)脈組織PPAR-γ蛋白表達(dá)明顯上調(diào)（P<0.05），其中高劑量組和西藥組上調(diào)最為明顯。

表4 各組大鼠主動(dòng)脈組織PPAR-γ 灰度值比較（±s）

表4 各組大鼠主動(dòng)脈組織PPAR-γ 灰度值比較（±s）

注： 與空白組比較，#P<0.05；與模型組比較，*P<0.05；與肥胖模型組比較，△P<0.05；與防己黃芪湯中劑量組比較，▲P<0.05；與西藥組比較，●P<0.05。

組別 動(dòng)物數(shù)/只 PPAR-γ空白組 10 1.45±0.24模型組 10 0.77±0.10#肥胖模型組 10 0.48±0.06#*防己黃芪湯低劑量組 10 0.97±0.17#△●防己黃芪湯中劑量組 10 0.93±0.10#△防己黃芪湯高劑量組 10 1.17±0.08#*△▲西藥組 10 1.14±0.09*△

圖1 各組大鼠胸主動(dòng)脈PPAR-γ 表達(dá)比較

4 討論

《中國成年人超重和肥胖與高血壓發(fā)病關(guān)系的隨訪研究》[7]發(fā)現(xiàn)，肥胖組高血壓發(fā)病率是正常組的1.16～1.28倍。肥胖病機(jī)多為痰瘀與陰虛。隨著經(jīng)濟(jì)水平的提高與人們生活方式的改變，肥胖型高血壓的主要誘因是飲食不節(jié)而致過氧化物增多，脂質(zhì)代謝紊亂，氣血津液運(yùn)行不暢，津液停聚為痰，血行不暢留為瘀，痰瘀互結(jié)，損傷絡(luò)脈，中醫(yī)辨證為痰濕壅盛證，正如《醫(yī)學(xué)正傳》[8]說“津液黏稠，為痰為飲，積久滲入脈中，血為之濁”。痰濁等病理產(chǎn)物隨著經(jīng)脈上犯清竅，以致血壓升高、眩暈頭痛。中醫(yī)證候?qū)W中指出脂質(zhì)代謝紊亂與痰濁血瘀關(guān)系最為密切[9]。防己黃芪湯出自張仲景《金匱要略》，主治表虛不固之風(fēng)水、風(fēng)濕。防己苦泄辛散、祛風(fēng)除濕，黃芪補(bǔ)氣健脾、固表行水，白術(shù)、甘草健脾益氣，白術(shù)、防己滲濕利水。諸藥合用，共奏益氣化痰、利水除濕之效?，F(xiàn)代學(xué)者多用于肥胖型高血壓的治療，具有減重與降壓的雙重功效[10-12]。

PPAR-γ屬于非甾體核受體超家族，主要在肝臟、脂肪組織、血管平滑肌細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞中表達(dá)，其與許多病理生理過程如肥胖、胰島素抵抗、高血壓、糖尿病和腫瘤等威脅人體健康的疾病相關(guān)。血管內(nèi)皮中PPAR-γ表達(dá)升高可以抑制血管重構(gòu)[13]，多個(gè)參與脂肪前體細(xì)胞分化的基因的轉(zhuǎn)錄由PPAR-γ調(diào)控，且PPAR-γ可以調(diào)節(jié)胰島素介導(dǎo)的外周組織對(duì)葡萄糖的攝取。由此可見，PPAR-γ與脂質(zhì)儲(chǔ)存和血管病變密切相關(guān)。PPAR-γ的生物學(xué)功能主要為改善糖脂代謝異常，通過改善胰島素抵抗，糾正脂質(zhì)代謝紊亂，抑制平滑肌細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞的增殖與遷移，從而改善血管病理性重構(gòu)，具有降壓減重的雙重功效。PPAR-γ可被多種脂肪酸及其衍生物激活，在糖脂代謝中起著重要的調(diào)節(jié)作用。PPAR-γ參與炎癥的形成[14]。在炎性反應(yīng)中，PPAR-γ通過抑制NF-κB、c-Jun氨基末端激酶（JNK）/激活蛋白1（AP-1）、環(huán)氧合酶（COX）等多途徑，降低ICAM-1、ET-1、干擾素-γ（IFN-γ）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）等因子產(chǎn)生、釋放及表達(dá)[15-16]。

調(diào)節(jié)胰島素敏感性方面，PPAR-γ的激活會(huì)使巨噬細(xì)胞產(chǎn)生M2抗炎因子，減少白介素（IL）-1β、IL-6、TNF-α的分泌量和胰島素抵抗，同時(shí)上調(diào)脂聯(lián)素與瘦素表達(dá)，實(shí)現(xiàn)降低胰島素抵抗的效果。既往研究證實(shí)，中藥復(fù)方中有許多活性成分與單體能夠上調(diào)或激活組織內(nèi)PPAR-γ基因的表達(dá)，從而抑制炎癥反應(yīng)[17]。現(xiàn)推測防己黃芪湯可能通過調(diào)控PPAR-γ抑制NF-κB表達(dá)抑制主動(dòng)脈炎癥反應(yīng)，通過上調(diào)瘦素、脂聯(lián)素的表達(dá)調(diào)節(jié)胰島素敏感性。

本研究結(jié)果表明，模型組大鼠NF-κB、ICAM-1、ET-1 mRNA升高，PPAR-γ、瘦素和脂聯(lián)素降低，肥胖模型組大鼠比模型組更甚。防己黃芪湯各劑量可以顯著下調(diào)NF-κB、ICAM-1、ET-1 mRNA表達(dá)，上調(diào)PPAR-γ、瘦素和脂聯(lián)素的表達(dá)，表明防己黃芪湯可以抑制NF-κB信號(hào)通路的激活和炎癥因子的表達(dá)，調(diào)整PPAR-γ、瘦素和脂聯(lián)素的失衡狀態(tài)，調(diào)節(jié)胰島素敏感性，降低血壓，保護(hù)主動(dòng)脈組織的損傷，延緩高血壓對(duì)靶器官的損傷。

本研究下一步預(yù)計(jì)進(jìn)行細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，在細(xì)胞水平明確防己黃芪湯對(duì)脂肪細(xì)胞內(nèi)糖脂代謝相關(guān)信號(hào)通路作用機(jī)制。通過檢測細(xì)胞增殖，檢測PPAR-γ-LXR-ABCA1信號(hào)通路對(duì)ABCA-1和LRP-1作用下的胞內(nèi)外膽固醇交換作用以及防己黃芪湯對(duì)脂肪細(xì)胞自噬的影響，驗(yàn)證防己黃芪湯對(duì)脂肪前體細(xì)胞分化的干預(yù)作用，從而明確防己黃芪湯對(duì)關(guān)鍵性靶點(diǎn)分子PPAR-γ及其相關(guān)糖脂代謝信號(hào)通路調(diào)控作用，以精準(zhǔn)地用醫(yī)學(xué)理論闡釋防己黃芪湯對(duì)心腎微血管功能損傷的作用靶點(diǎn)以及調(diào)節(jié)機(jī)制，為探索肥胖型高血壓中藥干預(yù)策略，推動(dòng)高血壓預(yù)防、評(píng)價(jià)和治療體系建設(shè)奠定基礎(chǔ)。