5氟尿嘧啶對蛋白核小球藻和羊角月芽藻生長及葉綠素含量的影響

李威，惲燁，是怡蕓，張銀龍,*

1. 南京林業(yè)大學 江蘇省南方現(xiàn)代林業(yè)協(xié)同創(chuàng)新中心，南京 210037 2. 南京林業(yè)大學 生物與環(huán)境學院，南京 210037 3. 鎮(zhèn)江市計量檢定測試中心，鎮(zhèn)江 212132

5氟尿嘧啶對蛋白核小球藻和羊角月芽藻生長及葉綠素含量的影響

李威1,2，惲燁3，是怡蕓1,2，張銀龍1,2,*

1. 南京林業(yè)大學 江蘇省南方現(xiàn)代林業(yè)協(xié)同創(chuàng)新中心，南京 210037 2. 南京林業(yè)大學 生物與環(huán)境學院，南京 210037 3. 鎮(zhèn)江市計量檢定測試中心，鎮(zhèn)江 212132

近年來，抗癌藥的環(huán)境污染特征及其生態(tài)風險引起了廣泛關注。為獲取典型抗癌藥5氟尿嘧啶的基礎生態(tài)毒性數(shù)據(jù)，以蛋白核小球藻(Chlorella pyrenoidosa)和羊角月芽藻(Selenastrum capricornutum)為受試生物，考察了5氟尿嘧啶對2種綠藻的生長和葉綠素含量的影響。結(jié)果表明，5氟尿嘧啶對蛋白核小球藻和羊角月芽藻的生長具有抑制作用，隨著暴露濃度升高，細胞生長抑制率增強。5氟尿嘧啶對2種綠藻的96 h半數(shù)抑制濃度(EC50)分別為450.36 mg·L-1和692.30 mg·L-1，屬于低毒性物質(zhì)。暴露96 h后，低濃度5氟尿嘧啶(<32 mg·L-1)對蛋白核小球藻和羊角月芽藻葉綠素含量有一定的促進作用，高濃度5氟尿嘧啶(32～500 mg·L-1)則抑制了2種綠藻的葉綠素含量，且兩者具有明顯的負相關關系。和葉綠素b相比，葉綠素a對5氟尿嘧啶脅迫更為敏感。

抗癌藥；5氟尿嘧啶；蛋白核小球藻；羊角月芽藻；生長；葉綠素

近20年來，藥品類污染物在環(huán)境中的暴露濃度、污染特征和生態(tài)風險等引起了科學工作者和公眾的廣泛關注[1-3]。藥品被人類和畜禽等服用后不能被機體完全吸收，常以原形化合物和代謝產(chǎn)物的形式進入天然水環(huán)境中，其環(huán)境殘留濃度一般在ng·L-1～μg·L-1級別[4]。在各種藥品中，抗癌藥的用量相對較少，但根據(jù)其功效和作用機制，即使其環(huán)境濃度很低，也可能會對非目標生物產(chǎn)生致癌、致畸、致突變以及其他毒性效應[5]。因此，抗癌藥的生態(tài)風險在近幾年開始受到重視[6-7]。

5氟尿嘧啶(5-fluorouracil)是一種常用的抗癌藥，主要通過抑制胸苷酸合成酶阻礙胸腺嘧啶的合成，從而阻斷DNA復制而抑制細胞生長，廣泛用于乳腺癌和消化系統(tǒng)等癌癥治療中[8]。目前，關于5氟尿嘧啶及其他抗癌藥在環(huán)境中的暴露濃度數(shù)據(jù)還相對較少，Johnson等[9]根據(jù)抗癌藥的消費量、排泄率及其歸趨數(shù)據(jù)，預測污水處理廠出水中5氟尿嘧啶的濃度為23 ng·L-1。而且，隨著癌癥病人的增加和抗癌藥消費模式的改變——門診病人的增加，水環(huán)境中抗癌藥的濃度呈上升趨勢[6]。Zounkova等[10-11]研究發(fā)現(xiàn)，5氟尿嘧啶的生態(tài)毒性較高，如其對惡臭假單胞菌生長的半數(shù)抑制濃度為44 μg·L-1。但是，目前5氟尿嘧啶等抗癌藥的生態(tài)毒性數(shù)據(jù)還很缺乏。

藻類是水體生態(tài)系統(tǒng)內(nèi)能量的初級生產(chǎn)者，是反映水體環(huán)境質(zhì)量的重要指標[12]。藻類在水環(huán)境中分布廣泛并且對污染物比較敏感，常被用作受試生物以評價外源污染物對水生生態(tài)系統(tǒng)的影響[13]。本論文以蛋白核小球(Chlorella pyrenoidosa)和羊角月芽藻(Selenastrum capricornutum)作為受試藻種，通過研究5氟尿嘧啶對蛋白核小球藻和羊角月芽藻的生長和葉綠素含量的影響，為5氟尿嘧啶的生態(tài)風險評價提供基礎數(shù)據(jù)。

1　材料與方法 (Materials and methods)

1.1實驗材料

(1)實驗試劑：5氟尿嘧啶(純度為99%)購于百靈威科技有限公司。

(2)供試藻種：蛋白核小球藻(編號FACHB-11)和羊角月芽藻(編號FACHB-271)均購自中國科學院水生生物研究所。

1.2實驗方法

1.2.1藻類預培養(yǎng)

在無菌條件下將藻種接種至SE培養(yǎng)基中，放置于光照培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)至對數(shù)生長期，并進一步擴大培養(yǎng)。培養(yǎng)條件為：溫度(25±1) ℃，光照強度3 000 lux，光暗比為12 h : 12 h，每天定時震蕩3次(15 min·次-1)。預培養(yǎng)3代，鏡檢細胞正常，進入對數(shù)生長期進行試驗。

1.2.2藻類急性毒性試驗

藻類急性毒性實驗參照《化學品藻類生長抑制試驗》(GB/T 21805—2008)[14]進行。將處于對數(shù)生長期的蛋白核小球藻和羊角月芽藻接種到150 mL的錐形瓶中，2種藻的初始藻細胞濃度在1×105和5×106個·mL-1之間，培養(yǎng)液總體積為50 mL。正式實驗之前，先進行較大范圍濃度系列的預備試驗，得到2種藻類生長抑制范圍為10%～60%的5氟尿嘧啶濃度，并按照等比數(shù)列設置5氟尿嘧啶的正式實驗濃度為5.15、12.5、32、80、200、500 mg·L-1。每個濃度設3個平行樣，同時設置空白對照，培養(yǎng)條件同上。實驗開始后于24 h、48 h、72 h和96 h取樣測定藻細胞濃度。

藻細胞濃度采用鏡檢和分光光度法相結(jié)合的方法進行測定，通過顯微鏡用血球計數(shù)板進行藻類計數(shù)，并在波長680 nm下測定藻類的吸光值，建立不同藻類細胞密度和吸光度之間線性關系，結(jié)果如表1所示。

表1　藻類細胞濃度(y)與光密度值(OD680)之間的線性關系

藻類生長速率(μt)和細胞生長抑制率(I%)按照《化學品藻類生長抑制試驗》(GB/T 21805—2008)的方法，根據(jù)方程(1)和(2)進行計算：

(1)

(2)

式中，μt為時間t的細胞生長速率；Nt、N0分別為時刻t和起始時刻t0的細胞濃度；μc為對照組的細胞生長速率。

1.2.3葉綠素含量測定

暴露96 h后，將10 mL藻液4 ℃下7 000 r·min-1離心10 min，倒去上清液，加5 mL體積分數(shù)為95%乙醇溶液，搖勻，暗處浸提24 h。將提取液以7 000 r·min-1冷凍離心10 min，取上清液測定其在波長665 nm和649 nm下的吸光度值，帶入公式(3)和(4)計算葉綠素的濃度[15]。

Ca=13.95OD665-6.88OD649

(3)

Cb=24.96OD649-7.32OD665

(4)

式中，Ca為葉綠素a的含量，Cb為葉綠素b的含量，以mg·mL-1表示。

1.3數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

采用SPSS 16.0和Excel對實驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析及作圖。運用概率單位回歸分析法，確定蛋白核小球藻和羊角月芽藻的96 h-EC50值。采用t檢驗法檢驗處理組與對照組數(shù)據(jù)的差異，P < 0.05和P < 0.01分別表示與對照組差異顯著和差異極顯著。

2　結(jié)果(Results)

2.15氟尿嘧啶對蛋白核小球藻和羊角月芽藻的生長抑制

不同濃度5氟尿嘧啶脅迫下，蛋白核小球藻和羊角月芽藻的生長曲線見圖1。隨著5氟尿嘧啶暴露時間的延長，各濃度組的藻細胞生長速度減慢。隨著5氟尿嘧啶質(zhì)量濃度增加，蛋白核小球藻與羊角月芽藻細胞總數(shù)呈逐漸下降趨勢，5氟尿嘧啶對2種綠藻生長的抑制程度與5氟尿嘧啶濃度呈正相關。從整體上看，低濃度的5氟尿嘧啶對藻細胞生長的影響不大，而高濃度的5氟尿嘧啶則顯著抑制了藻類的生長，如200 mg·L-1的5氟尿嘧啶暴露96 h后，蛋白核小球藻的藻細胞密度為對照組的63.4%，羊角月芽藻的藻細胞密度為對照組的70.8%。

不同濃度5氟尿嘧啶對蛋白核小球藻和羊角月芽藻的生長抑制率見表2。低濃度的5氟尿嘧啶(5.15 mg·L-1)處理蛋白核小球藻和羊角月芽藻48 h后，2種綠藻的生長抑制率都為負值，表現(xiàn)出短時間內(nèi)低濃度刺激生長作用。隨著5氟尿嘧啶的質(zhì)量濃度增加，藻細胞生長抑制率逐漸增大，呈現(xiàn)出明顯的劑量-效應關系。

從時間尺度上看，5氟尿嘧啶濃度為5.15、12.5、32 mg·L-1和5.15、12.5 mg·L-1時，蛋白核小球藻和羊角月芽藻的生長抑制率隨著時間延長而增大，但在其他處理濃度下并未表現(xiàn)出規(guī)律的時間-效應關系。

圖1　5氟尿嘧啶對蛋白核小球藻和羊角月芽藻藻細胞密度的影響Fig. 1　Effect of 5-fluorouracil on the algae cells density of C. pyrenoidosa and S. capricornutum

2.25氟尿嘧啶對蛋白核小球藻和羊角月芽藻葉綠素含量的影響

在不同濃度5氟尿嘧啶中暴露96 h后，蛋白核小球藻和羊角月芽藻的葉綠素含量變化如圖2。5氟尿嘧啶的濃度為5.15～32 mg·L-1時，蛋白核小球藻的葉綠素a和葉綠素b含量高于對照組，其中，在5氟尿嘧啶為5.15～32 mg·L-1時，葉綠素a的含量與對照組有極顯著差異(P < 0.01)；在5氟尿嘧啶濃度為5.15和12.5 mg·L-1時，葉綠素b的含量與對照組分別具有極顯著(P < 0.01)和顯著差異(P < 0.05)。之后，隨著5氟尿嘧啶濃度的繼續(xù)升高，葉綠素a含量迅速下降，葉綠素b含量的下降趨勢則相對較緩。在5氟尿嘧啶濃度為500 mg·L-1時，葉綠素a和葉綠素b含量分別為1.19 mg·L-1和0.51 mg·L-1，與對照組有極顯著差異(P<0.01)。

羊角月芽藻的葉綠素含量變化趨勢與蛋白核小球藻不甚相同。5氟尿嘧啶濃度為5.15 mg·L-1時就對羊角月芽藻的葉綠素表現(xiàn)出抑制作用。在5氟尿嘧啶濃度為12.5～32 mg·L-1時，葉綠素含量又有所提高。5氟尿嘧啶濃度大于32 mg·L-1后，羊角月芽藻的葉綠素含量與5氟尿嘧啶濃度呈明顯的負相關關系。當5氟尿嘧啶濃度從80 mg·L-1增加到500 mg·L-1時，葉綠素a含量從1.84 mg·L-1減少至1.39 mg·L-1，葉綠素b含量從0.74 mg·L-1減少到0.55 mg·L-1，與對照處理間存在顯著或極顯著差異(P < 0.05或P < 0.01)。

3　討論(Discussion)

5氟尿嘧啶對不同的受試生物的生態(tài)毒性效應差異較大。Zounkova等[10-11]研究發(fā)現(xiàn)，5氟尿嘧啶對惡臭假單胞菌(Pseudomonas putida )的EC50值為0.027 mg·L-1，對近頭狀偽蹄形藻(Pseudokirchneriella subcapitata)的EC50值為0.11 mg·L-1，對綠藻(Desmodesmus subspicatus)的EC50值為48 mg·L-1，對大型蚤的EC50值為36 mg·L-1。Deyoung等[16]發(fā)現(xiàn)5氟尿嘧啶對黑頭呆魚(Pimephales promelas)生長的EC50值為400 mg·L-1。惲燁等[17]研究得到5氟尿嘧啶對小麥(Triticum aestivum)、白菜(Brassica pekinensis)和水稻(Oryza sativa)種子的根伸長的半數(shù)抑制濃度分別為212.80、102.53和13.30 mg·L-1。在本研

表2不同濃度5氟尿嘧啶脅迫下藻類生長抑制率(%)變化

Table 2Changes of algae growth-inhibition-rate (%) exposed to different 5-fluorouracil concentrations

藻類Algaespecies時間/h Time/h5.15mg·L-112.5mg·L-132mg·L-180mg·L-1200mg·L-1500mg·L-1蛋白核小球藻Chlorellapyrenoidosa242.503.948.1829.4932.2659.6448-6.541.738.4320.9336.5755.21722.1012.8915.3027.1237.7653.28964.2014.9117.7129.1535.2553.18羊角月芽藻Selenastrumcapricornutum24-22.05-24.949.8110.2133.1528.8048-7.93-8.5516.2027.9539.2246.00723.043.5518.4725.8232.3143.50967.199.5417.2625.3935.1546.00

表3　5氟尿嘧啶對蛋白核小球藻和羊角月芽藻的96 h毒性效應

注：x為5氟尿嘧啶濃度對數(shù)，y為抑制率概率單位；p為相伴概率；p*為X2擬合優(yōu)度檢驗統(tǒng)計量概率，p*>0.05時，符合X2概率分布。

Note: x represents logarithm concentration of 5-fluorouracil, y represents the inhibition probit, p represents concomitant probability, p* represents the X2goodness of fit test statistics probability, p*>0.05, in accordance with the X2probability distribution.

圖2　5氟尿嘧啶暴露96 h后蛋白核小球藻和羊角月芽藻葉綠素含量變化注：*、**分別表示與對照組相比，P < 0.05、P < 0.01。Fig. 2　Changes of chlorophyll content of C. pyrenoidos and S. capricornutum exposed to 5-fluorouracil for 96 hNote: *,** compared with the control group, P < 0.05, P < 0.01.

究中，5氟尿嘧啶對蛋白核小球藻和羊角月芽藻的96 h-EC50值分別為450.36 mg·L-1和692.30 mg·L-1。因此，在評估5氟尿嘧啶的生態(tài)風險時，需要研究并比較5氟尿嘧啶對不同生物的毒性數(shù)據(jù)，以準確全面地了解其潛在生態(tài)風險。根據(jù)水和廢水檢測分析方法[18]中規(guī)定，藻類生長抑制實驗對毒物的毒性分級標準為96 h-EC50<1 mg·L-1時為極高毒，在1～10 mg·L-1之間為高毒，在10～100 mg·L-1之間為中毒，>100 mg·L-1時為低毒。因此，5氟尿嘧啶對于這2種藻屬于低毒物質(zhì)，羊角月芽藻對于5氟尿嘧啶的抗性大于蛋白核小球藻。

低濃度的5氟尿嘧啶處理可促進蛋白核小球藻和羊角月芽藻的生長，這種毒物在較低濃度下出現(xiàn)的增益現(xiàn)象，是其在無毒情況下的刺激反應，被稱之為“毒物的興奮效應”(Hormesis)[19]。但是隨著5氟尿嘧啶的濃度的增加，藻細胞生長受到抑制，表現(xiàn)為明顯的劑量-效應關系。這與以往研究結(jié)果[20]相一致。但5氟尿嘧啶對藻類生長的抑制并未表現(xiàn)出明顯的時間-效應關系，這可能是由于藥物的生物降解、生物適應、進入細胞的藥物減少等所致[21]。

葉綠素是各種浮游藻類中廣泛存在的天然色素，是客觀反映植物利用光照能力的一類重要指標，往往可以作為判斷植物光合生理能力、反映環(huán)境脅迫狀況的依據(jù)[22]，因此，葉綠素含量變化能較好地反映藻類各階段生長發(fā)育正常與否。在低濃度5氟尿嘧啶(<32 mg·L-1處理時，蛋白核小球藻葉綠素a和葉綠素b含量高于對照組，出現(xiàn)“興奮效應”，這與藻細胞生長量變化趨勢一致。而在5氟尿嘧啶為5.15 mg·L-1時，羊角月芽藻的葉綠素含量與對照組相比減少，說明低濃度5氟尿嘧啶已對羊角月芽藻產(chǎn)生輕微抑制作用；在5.15～32 mg·L-1時，葉綠素含量又逐漸上升，可能是因為這一濃度范圍的5氟尿嘧啶脅迫促進了藻的代謝，激活了藻類色素合成的相關酶類，色素合成增多，含量上升，且受損藻細胞逐漸恢復的結(jié)果。隨著5氟尿嘧啶濃度增加，2種綠藻的葉綠素a和葉綠素b含量均逐漸降低。光合器官是植物細胞內(nèi)活性氧的主要來源之一，而光合色素及與之結(jié)合的內(nèi)囊體膜均具有不飽和多烯結(jié)構，極易受活性氧的攻擊，同時，在污染物脅迫下，葉綠體片層中捕光Chla/b-Pro復合體合成也會受到抑制[22]。因此，在高濃度5氟尿嘧啶暴露下，藻細胞內(nèi)活性氧的積累可能導致葉綠體結(jié)構破壞，光捕獲化合物的形成受到影響，葉綠素合成受阻。

不論是蛋白核小球藻還是羊角月芽藻，相對于葉綠素b含量，葉綠素a含量是更敏感指標，這與劉濤等[23-24]研究結(jié)果有相似之處。這是由于葉綠素a作為捕光Chla/b-Pro復合體重要組成部分，在光合系統(tǒng)PSⅡ的反應中心中，作為光合電子傳遞鏈的電子供體，與其他光合色素相比，更容易受到光降解作用的影響[23]。

總體上，現(xiàn)有的數(shù)據(jù)表明5氟尿嘧啶不太可能引起急性毒性效應，但是生物、尤其是一些敏感生物長期暴露于低濃度的抗癌藥脅迫中，是否會引起生物遺傳、生理生化乃至生長等方面的影響，還需進一步的研究。

通訊作者簡介：張銀龍(1963-)，男，博士，教授，主要研究方向為污染生態(tài)學。

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◆

Effects of 5-Fluorouracil on the Growth and Chlorophyll Content ofChlorellapyrenoidosaandSelenastrumcapricornutum

Li Wei1,2, Yun Ye3, Shi Yiyun1,2, Zhang Yinlong1,2,*

1. Collaborative Innovation Center of Sustainable Forestry in Southern China of Jiangsu Province, Nanjing Forestry University, Nanjing 210037, China 2. College of Biology and the Environment, Nanjing Forestry University, Nanjing 210037, China 3. Zhenjiang Metrological Verification and Testing Center, Zhenjiang 212132, China

20 July 2015accepted 17 September 2015

The environmental occurrence and ecotoxicological risk of anticancer drugs (also called antineoplastic drugs) have attracted wide attentions. To obtain the basic ecotoxicology data of 5-fluorouracil, a typical anticancer drug, Chlorella pyrenoidosa and Selenastrum capricornutum were employed as target organisms, and effect of 5-fluorouracil on the growth and chlorophyll content of these two algae were examined. The results showed that the growth of C. pyrenoidosa and S. capricornutum were inhibited by 5-fluorouracil. The percentage of growth inhibition was enhanced with the increase of 5-fluorouracil concentration. The 96 h median effective concentration (EC50) of 5-fluorouracil to C. pyrenoidosa and S. capricornutum was 450.36 mg·L-1and 692.30 mg·L-1, respectively. 5-fluorouracil was low toxic to the two algae. After exposure to 5-fluorouracil for 96 h, higher chlorophyll content of C. pyrenoidosa and S. capricornutum was observed under low concentration of 5-fluorouracil (<32 mg·L-1), while high concentration of 5-fluorouracil (32-500 mg·L-1) inhibited chlorophyll a and b content of C. pyrenoidosa and S. capricornutum with a negative correlation. Chlorophyll a is more sensitive to 5-fluorouracil.

anticancer drugs; 5-fluorouracil; Chlorella pyrenoidosa; Selenastrum capricornutum; growth; chlorophyll

江蘇省高校自然科學研究面上項目(15KJB610006)；江蘇高校優(yōu)勢學科建設工程資助項目(PAPD)；南京林業(yè)大學高層次人才基金項目(163010675)

李威(1982-)，女，博士，研究方向為污染生態(tài)化學，Email: uwliwei@163.com；

Corresponding author)， E-mail: ecoenvylz@163.com

10.7524/AJE.1673-5897.20150720221

2015-07-20錄用日期：2015-09-17

1673-5897(2015)6-213-06

X171.5

A

李威，惲燁，是怡蕓, 等. 5氟尿嘧啶對蛋白核小球藻和羊角月芽藻生長及葉綠素含量的影響[J]. 生態(tài)毒理學報，2015, 10(6): 213-218

Li W, Yun Y, Shi Y Y, et al. Effects of 5-fluorouracil on the growth and chlorophyll content of Chlorella pyrenoidosa and Selenastrum capricornutum [J]. Asian Journal of Ecotoxicology, 2015, 10(6): 213-218 (in Chinese)