分子生物學(xué)方法在食品微生物檢測(cè)中的應(yīng)用探析

楊寶?馬寧 張燁

摘 要：隨著國(guó)民經(jīng)濟(jì)水平的日益提升，國(guó)家越來(lái)越重視食品安全，食品安全直接關(guān)系到社會(huì)大眾的生命健康和社會(huì)的發(fā)展。食源性疾病已成為社會(huì)普遍關(guān)注的問(wèn)題，目前微生物檢測(cè)國(guó)標(biāo)方法步驟多、耗時(shí)長(zhǎng)，無(wú)法滿足現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)的需要。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，將分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)應(yīng)用于食品微生物檢測(cè)中已成為必然趨勢(shì)，本文論述了分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)在微生物檢測(cè)中的應(yīng)用。

關(guān)鍵詞：分子生物學(xué)方法;食品;微生物檢測(cè)

近年來(lái)，食品微生物安全問(wèn)題層出不窮，比如，1996年日本O157：H7型大腸桿菌感染事件，2003年安徽阜陽(yáng)劣質(zhì)嬰兒配方粉阪崎腸桿菌食物中毒事件等。食源性疾病傳播范圍廣，成為社會(huì)普遍關(guān)注的問(wèn)題。近年來(lái)，國(guó)家對(duì)食品生產(chǎn)企業(yè)的監(jiān)管越來(lái)越嚴(yán)格，食品生產(chǎn)企業(yè)的自律性增強(qiáng)，有毒有害物質(zhì)的非法添加已明顯減少，但食品微生物的質(zhì)量控制存在很大的不可控性，食品安全事件多數(shù)與微生物有關(guān)，因此微生物質(zhì)量控制成為了控制食品質(zhì)量安全的關(guān)鍵因素。受多種因素影響，食品在生產(chǎn)、加工、運(yùn)輸與銷售每個(gè)環(huán)節(jié)都有可能出現(xiàn)微生物污染，導(dǎo)致物腐敗變質(zhì)、食品中毒等，常規(guī)微生物檢測(cè)方法短則需要3天多則需要十幾天.因此，開發(fā)食品微生物快速檢測(cè)方法，將分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)應(yīng)用于食品微生物檢測(cè)顯得至關(guān)重要。

1 熒光原位雜交技術(shù)

檢測(cè)人員通過(guò)處理食品細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞雜交，基于食品放射性的原位雜交進(jìn)一步取代同位素標(biāo)記，形成了熒光標(biāo)劑雜交方法。檢測(cè)人員之后利用探針向細(xì)胞內(nèi)通過(guò)導(dǎo)入帶有熒光標(biāo)記的寡核苷酸，讓帶有熒光標(biāo)記的寡核苷酸與細(xì)胞內(nèi)的核酸結(jié)合，借助熒光顯微鏡，觀察帶有熒光的細(xì)胞，并通過(guò)細(xì)菌計(jì)數(shù)、計(jì)算雜交率的方式，分析檢測(cè)結(jié)果[1]。針對(duì)人工微生物檢測(cè)存在的不足，檢測(cè)人員還可以通過(guò)擴(kuò)增或是純化步驟，分析微生物個(gè)體，熒光原位雜交技術(shù)主要用于分析不同微生物群落之間的差異性。

2 環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)

環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增法（loop-mediated?isothermal amplification，LAMP）是2000年出現(xiàn)的一種新穎的恒溫核酸擴(kuò)增方法，根據(jù)靶基因的6個(gè)區(qū)域設(shè)計(jì)4種特異引物，利用鏈置換DNA聚合酶在63 ℃左右保溫30～60 min，即可完成核酸擴(kuò)增反應(yīng)。與常規(guī)PCR相比，不需要模板的熱變性、溫度循環(huán)、電泳及紫外觀察等過(guò)程。LAMP是一種全新的核酸擴(kuò)增方法，具有簡(jiǎn)單、快速、特異性強(qiáng)的特點(diǎn)。該技術(shù)在靈敏度、特異性和檢測(cè)范圍等上能媲美甚至優(yōu)于PCR技術(shù)，不依賴任何專門的儀器設(shè)備即可實(shí)現(xiàn)現(xiàn)場(chǎng)高通量快速檢測(cè)，檢測(cè)成本遠(yuǎn)低于熒光定量PCR。與傳統(tǒng)的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)相比，環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)無(wú)需昂貴的試劑與儀器[2]，該方法已廣泛應(yīng)用于食品微生物的快速檢測(cè)中。

3 PCR檢測(cè)技術(shù)

在引物的引導(dǎo)下，在數(shù)小時(shí)內(nèi)復(fù)制出特定的DNA序列。在短時(shí)間內(nèi)DNA序列呈百萬(wàn)倍擴(kuò)增，然后對(duì)其進(jìn)行檢測(cè)，就可以及時(shí)得到食品性致病微生物檢測(cè)結(jié)果。為得到精準(zhǔn)的檢驗(yàn)結(jié)果，檢測(cè)人員還需提高檢驗(yàn)的靈敏性和特異性。一般來(lái)說(shuō)，常用的方法主要有熒光定量PCR、多重PCR、巢式PCR等。靈敏性是核酸探針技術(shù)的顯著優(yōu)勢(shì)，并且這種技術(shù)還具有化學(xué)染色的可見(jiàn)性和定位性，該方法已廣泛應(yīng)用于微生物快速檢測(cè)中，比如新型冠狀病毒肺炎檢測(cè)、近些年的非洲豬瘟檢測(cè)均應(yīng)用了實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)，達(dá)到了快速獲得檢測(cè)結(jié)果的目的。

4 基因芯片技術(shù)

作為信息科學(xué)和生命科學(xué)的結(jié)合體，這種技術(shù)主要采用顯微打印和原位合成手段，在支持物表面將以萬(wàn)計(jì)的核酸探針固化，實(shí)現(xiàn)支持物與標(biāo)記樣品二者之間的雜交。這樣一來(lái)，檢測(cè)人員就可以通過(guò)對(duì)雜交信號(hào)的檢測(cè)，快速檢測(cè)樣品。具體步驟如下，在芯片表面放置好各種基因寡核苷酸點(diǎn)樣，將經(jīng)過(guò)處理后的微生物樣品，進(jìn)行核酸擴(kuò)增和核酸提取，并借助熒光素做好相應(yīng)的標(biāo)記。將樣品與芯片上的寡核苷酸點(diǎn)雜交。再通過(guò)分析樣品熒光分析模式和掃描儀定量，實(shí)現(xiàn)對(duì)樣品的檢測(cè)，得知其中是否存在某些特定微生物。實(shí)質(zhì)上這種方式與核酸雜交相似，基因芯片技術(shù)將探針固化后，只需要一次雜交則可以及時(shí)檢測(cè)出多種靶基因信息?；蛐酒夹g(shù)具有快速、多參數(shù)、高通量、高精度與高靈敏性的顯著優(yōu)勢(shì)，是分析食品中微生物組成的重要技術(shù)手段。隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，基因芯片技術(shù)將廣泛應(yīng)用到食品微生物檢測(cè)研究中。

5 結(jié)語(yǔ)

隨著食品生產(chǎn)環(huán)節(jié)的不斷規(guī)范，人員素質(zhì)的不斷提高，非法添加違法處罰力度也越來(lái)越大，大多數(shù)不合格食品檢驗(yàn)項(xiàng)目為微生物，目前國(guó)標(biāo)方法檢測(cè)周期過(guò)長(zhǎng)，不能快速得到檢測(cè)結(jié)果，無(wú)法滿足微生物現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)需求，分子生物學(xué)技術(shù)因靈敏、準(zhǔn)確和快速等優(yōu)勢(shì)，今后，勢(shì)必廣泛應(yīng)用于食品微生物檢測(cè)領(lǐng)域。

參考文獻(xiàn)

[1]王鑫，車振明，黃韜睿.分子生物學(xué)方法在食品安全檢測(cè)中的應(yīng)用[J].食品工程，2011，7（3）：9-12.

[2]趙彩紅，高強(qiáng)，李明生，等.環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)在食品檢測(cè)中的應(yīng)用[J].農(nóng)業(yè)科技與信息，2017（22）：28-30.