液相色譜法測(cè)定水產(chǎn)品中磺胺類(lèi)代謝物含量的不確定度評(píng)定

李鴻超，彭家杰，羅健民，姚婉儀

(1 東莞市水產(chǎn)學(xué)會(huì)，廣東 東莞 523002；2 東莞市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，廣東 東莞 523002)

獸用磺胺類(lèi)(Sulfonamides)藥物常添加到動(dòng)物飼料中用來(lái)治療疾病和促進(jìn)生長(zhǎng),但不合理的用藥會(huì)導(dǎo)致磺胺類(lèi)藥物在動(dòng)物組織中殘留[1],而這些藥物殘留往往能夠直接或者間接地通過(guò)環(huán)境、 食物鏈等進(jìn)入人體，并對(duì)人體產(chǎn)生毒副作用[2-3],當(dāng)濃度累積超過(guò)一定量時(shí)將對(duì)人體健康產(chǎn)生危害。

為了確保檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性，需進(jìn)行測(cè)量不確定度的評(píng)定。測(cè)量不確定度用來(lái)表征被測(cè)量值在一定范圍內(nèi)的估計(jì)，是一種表征測(cè)量值分散性的評(píng)定方法，是測(cè)量結(jié)果可比性和可靠性的判定指標(biāo)[4-5]。為保證磺胺類(lèi)代謝物殘留量檢測(cè)結(jié)果的科學(xué)性，開(kāi)展檢測(cè)工作的實(shí)驗(yàn)室需根據(jù)相關(guān)認(rèn)可技術(shù)規(guī)范要求進(jìn)行不確定度評(píng)定。本實(shí)驗(yàn)依據(jù)JJF 1059.1-2012《測(cè)量不確定度評(píng)定與表示》[5]和CNAS-GL06 《化學(xué)分析中不確定度的評(píng)估指南》[6]等相關(guān)規(guī)定的基本方法和程序，對(duì)HPLC法測(cè)定水產(chǎn)品中磺胺類(lèi)殘留量的不確定度進(jìn)行分析評(píng)定，找出主要來(lái)源，從而提高檢測(cè)準(zhǔn)確性。

1 實(shí) 驗(yàn)

1.1 測(cè)量?jī)x器設(shè)備

Waters UPLC H-CLASS型超高效液相色譜儀,美國(guó)Waters公司；平行蒸發(fā)儀,瑞士BuChi；BS214 D分析天平,SARTORIUS、BT125D型電子天平,SARTORIUS；渦旋振蕩器,德國(guó)IKA、T25勻漿機(jī),德國(guó)IKA；Milli-Q型超純水儀,美國(guó)Millipore；超聲波清洗機(jī),昆山市超聲儀器有限公司;LXJ-IIB型離心機(jī),上海安亭。

1.2 樣品前處理方法

參考農(nóng)業(yè)部958號(hào)公告-12-2007《水產(chǎn)品中磺胺類(lèi)藥物殘留量的測(cè)定 液相色譜法》進(jìn)行。

2 結(jié)果與討論

2.1 建立數(shù)學(xué)模型

根據(jù)測(cè)量方法建立樣品中硝基呋喃類(lèi)代謝物殘留量的數(shù)學(xué)模型如下：

(1)

以上各種因素都會(huì)對(duì)測(cè)量結(jié)果的不確定度產(chǎn)生影響，其最終合成不確定度的計(jì)算公式為：

(2)

2.2 分析確定不確定度來(lái)源

試樣中磺胺類(lèi)藥物殘留量測(cè)量不確定度來(lái)源主要有以下幾個(gè)方面：測(cè)量重復(fù)性引入的不確定度；曲線校準(zhǔn)引入不確定度；待測(cè)液體積定容引入的不確定度；樣品稱(chēng)量引入的不確定度；外標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制引入的不確定度；提取回收率引入的不確定度；液相色譜儀校準(zhǔn)引入的不確定度。

2.3 各分量不確定度計(jì)算

2.3.1 測(cè)量重復(fù)性引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度u1rel

測(cè)量樣品重復(fù)性引起的不確定度分量，屬A類(lèi)標(biāo)準(zhǔn)不確定度，以算術(shù)平均值的標(biāo)準(zhǔn)偏差表示。對(duì)未知濃度樣品進(jìn)行6次重復(fù)測(cè)量，平均值的標(biāo)準(zhǔn)偏差Sa(μg/kg)及u1rel見(jiàn)表1。

表1 測(cè)定結(jié)果及其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度(n=6)

2.3.2 曲線校準(zhǔn)引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度u2rel

表2 最小二乘法擬合標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)量濃度-峰面積

表3 磺胺類(lèi)標(biāo)準(zhǔn)溶液回歸方程及相關(guān)系數(shù)

制備6個(gè)梯度混合標(biāo)準(zhǔn)溶液C，每個(gè)濃度測(cè)1次，以標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度Cis為橫坐標(biāo)，以標(biāo)準(zhǔn)溶液峰面積比Ais為縱坐標(biāo)，用最小二乘法擬合，獲得直線方程A=a+b×c以及線性相關(guān)系數(shù)r，列于表2、表3。

本例對(duì)樣品測(cè)定液測(cè)量1次(p=1)，將峰面積比A帶入直線方程得樣品濃度Ci，線性回歸導(dǎo)致的的Ci標(biāo)準(zhǔn)不確定度

表4 曲線校準(zhǔn)引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度

2.3.3 定容體積引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度u3rel

2.3.4 樣品稱(chēng)量引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度u4rel

2.3.5 外標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)溶液配制引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度u5rel

2.3.5.1 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)純度的標(biāo)準(zhǔn)不確定度u5rel

標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)純度的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度見(jiàn)表5。

表5 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)純度的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度

續(xù)表5

SCP99.6320.0151SMZ97.8320.0153SMM94.2320.0159SDM99.0320.0152SIZ99.9320.0150SDM99.4320.0151SQX95.7320.0157

2.3.5.2 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)定容引入的不確定度u52rel

2.3.5.3 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)稀釋引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度u53rel

用1000 μL可調(diào)移液器和10 mL容量瓶將標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液逐級(jí)稀釋?zhuān)褂?次1000 μL可調(diào)移液器及2次10 mL容量瓶，稀釋過(guò)程中引入的不確定度如下：

由此可得，外標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度如下：

2.3.6 提取回收率引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度u6rel

表6 樣品加標(biāo)回收的不確定度

2.3.7 液相色譜儀校準(zhǔn)引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度u7rel

2.4 評(píng)定測(cè)量量之間的相互關(guān)系

測(cè)量量之間相互獨(dú)立，沒(méi)有任何相關(guān)性。

2.5 合成不確定度及檢測(cè)結(jié)果表述

由上述所得數(shù)據(jù)代入公式(2)，合成不確定度結(jié)果如表7所示。

表7 合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度

2.6 計(jì)算擴(kuò)展不確定度

取包含因子k=2(95%置信概率)，其擴(kuò)展不確定度表示，結(jié)果見(jiàn)表8。

表8 不確定度評(píng)定結(jié)果

3 結(jié) 論

通過(guò)以上不確定度評(píng)定分析得知，利用液相色譜法測(cè)定水產(chǎn)品中磺胺類(lèi)代謝物含量的實(shí)驗(yàn)中，影響測(cè)量結(jié)果的不確定度主要來(lái)源于液相色譜儀的校準(zhǔn)、標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合校準(zhǔn)和提取回收率，其他因素影響不大。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中可通過(guò)優(yōu)化標(biāo)準(zhǔn)系列工作溶液配置、控制提取回收率來(lái)保證檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確度。