羊踟躕提取物對金黃色葡萄糖球菌的抑菌機制研究*

蔣利榮，覃 玥，諸葛臣林，甘恩戰(zhàn)，黃芳玉

(1 河池學院化學與生物工程學院，廣西 河池 546300； 2 廣西高校微生物與植物資源開發(fā)重點實驗室，廣西 河池 546300)

羊踟躕為我國傳統(tǒng)中藥材，其又被稱為三錢三、鬧羊花、黃杜鵑、八厘麻等，為杜鵑花科杜鵑花屬木本植物[1-2]。黃杜鵑全株都具有毒性，民間多以杜鵑花朵及果實入藥，但毒性大使用受限，而杜鵑花科植物的根部，即羊踟躕毒性相對較弱，藥性藥力與花果差異不大。羊踟躕具有祛風、止咳、散瘀和止痛等功效，用于風寒濕痹，跌打損傷，痔漏，癬瘡[5-6]，且對類風濕性關(guān)節(jié)炎有一定療效[7]。據(jù)《中藥大辭典》記載, 羊躑躅的根可用于治療驅(qū)風、除濕、消腫、風寒濕痹、痔漏、癬瘡等病, 還曾用于治療慢性支氣管炎[8]?，F(xiàn)代藥理研究具有抗炎抗風濕作用、免疫作用、解熱鎮(zhèn)痛作用，降低血壓減慢心率作用，殺蟲滅螺作用[9]，民間常用于治療足癬等。前期的研究發(fā)現(xiàn)羊踟躕根提取物對革蘭氏陰性菌和陽性菌均有較好的抑菌效果，本研究通過平板法和二倍稀釋法確定抑菌活性及MIC，通過羊踟躕提取物作用后菌液電導(dǎo)率大小以及核酸含量變化研究其對細胞膜通透性的影響，通過掃描電鏡觀察其對菌體形態(tài)的影響，多方面闡述羊踟躕提取物對金黃色葡萄糖球菌的抑菌機制。

1 實 驗

1.1 材料與試劑

羊踟躕藥材購自宜州市中藥材市場，金黃色葡萄球菌保存于學校實驗室。

無水磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀、氯化鉀、和牛肉膏、吐溫80、氫氧化鈉、瓊脂、戊二醛、鹽酸和95乙醇，以上試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

DLSB-5/20低溫冷卻液循環(huán)泵，鄭州長城科工貿(mào)有限公司；SBC-12小型離子濺射儀，北京中科科儀股份有限公司；TDL-5-A離心機，上海安亭科學儀器廠；Phenom ProX臺式掃描電鏡，復(fù)納科學儀器(上海)有限公司；ZHFY-I乙酸乙酯皂化反應(yīng)測定裝置，南京桑力電子設(shè)備廠；Xmark酶標儀，Bio-Rad公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 羊踟躕提取物的制備

稱取羊踟躕干粉10 g，加100 mL 95%乙醇水浴加熱提取兩次，每次1 h，合并濾液濃縮成生藥當量1 g/mL濃溶液，4 ℃密封保存。

1.3.2 抑菌活性測定——平板打孔法

采用瓊脂平板打孔法，測定抗菌活性。在無菌平皿內(nèi)加入熔化的培養(yǎng)基，待其冷卻凝固后作為底層，再取熔化的培養(yǎng)基，冷至加入菌液(500 μL:100 mL)，冷卻凝固后作為上層，用滅菌不銹鋼打孔器打孔(直徑為6 mm)，用移液器分別吸取各藥液約100 μL 加于各瓊脂孔內(nèi)于37 ℃ 培養(yǎng)18～24 h，觀察孔周圍有無抑菌圈，通過抑菌圈的大小比較各藥物的抗菌效力。平行測定三次取平均值。

1.3.3 最低抑菌濃度的(MIC)測定

采用試管兩倍稀釋法測定最小抑菌濃度(MIC)，按無菌操作規(guī)程以滅菌的肉湯液體培養(yǎng)基為稀釋液，取9支試管分別加入肉湯液體培養(yǎng)基1 mL，再量取1 mL其羊躑躅提取液于第1管中(第1管為2 mL，濃度為1:1)，混勻后再從第1管吸取1 mL 加至第2 管，使之成1:1、1:2、1:4、1:8、1:16、1:32、1:64、1:128、1:256的濃度梯度，第10管取1 mL不含藥液的肉湯液體培養(yǎng)基為陰性對照，再分別加入30 μL大腸桿菌、 金黃色葡萄球、化膿性鏈球菌、表皮葡萄球菌到該10支試管培養(yǎng)基中，其他藥液同上操作。37 ℃下培養(yǎng)16～24 h后觀察細菌的生長狀況。

1.3.4 核酸含量的測定

根據(jù)Chen等[10]的方法測定核酸含量。取5支試管，編號1～5，分別加入羊踟躕提取液、液體培養(yǎng)基和含0.01%吐溫80的PBS溶液，使得終濃度為4、2、 1和 0.5*MIC，5號試管不加藥液作為對照組。在1～5號試管中分別加入60 μL菌懸液，于搖床培養(yǎng)箱(37 ℃、200 r/min)培養(yǎng)，0、1、2、4、6 h后分別取樣200 μL，于5000 r/min條件下離心15 min，取上清液在酶標儀260 nm條件下測吸光度值。

1.3.5 電導(dǎo)率的測定

根據(jù)Lee等[11]的方法測定電導(dǎo)率值。實驗組加入MIC濃度的羊踟躕提取物，用滅菌水為對照，2支試管分別加入360 μL菌懸液，于搖床(37 ℃、150 r/min)中培養(yǎng)；間隔0,1,2,4,6和8 h，每支試管取樣4 mL，離心機(5000 r/min)離心15分鐘，測定上清液電導(dǎo)率。

1.3.6 細菌生長曲線的測定

參考王蒙蒙等[12]研究，取4支試管，按1.2.4方法，將羊踟躕提取物稀釋成濃度為0、0.5、1、2*MIC的藥液,分別加入60 μL菌懸液，于37 ℃、150 r/min搖床中培養(yǎng)；間隔0，2，4，6，8，12，24 h，每支試管取樣200 μL于96孔板中，用酶標儀測定其在600 nm波長下的吸光度值，繪制折線圖得到生長曲線。

1.3.7 掃描電鏡觀察細菌形態(tài)

參考邢夢雨等[13]的研究，取2支試管，按1.2.4方法，第1支試管將羊踟躕提取物稀釋成最小抑菌濃度的藥液,第2支試管不加藥液作為對照組，分別加入60 μL菌懸液，于37 ℃、200 r/min搖床中培養(yǎng)5小時后，離心機(5000 r/min)離心10 min，棄去上清液，沉淀再以pH=7.2的PBS洗滌2次，然后加入2.5%戊二醛溶液4 ℃固定過夜。之后依次用乙醇梯度脫水，經(jīng)重懸、離心、干燥后噴金，用掃描電鏡上觀察細菌形態(tài)。

2 結(jié)果與討論

2.1 抑菌圈直徑及最小抑菌濃度

按照方法1.3.2和1.3.3分別將羊躑躅提取物對4種供試菌進行抑菌實驗，結(jié)果如表1所示。

表1 羊踟躕提取物的抑菌活性

羊躑躅75%醇提物對對金黃色葡萄球菌、化膿性鏈球菌、表皮葡萄球菌、大腸桿菌均具有不同程度的抑制作用。對大腸桿菌和化膿性鏈球菌極敏感，MIC都是15.62 mg/mL，對金黃色葡萄球菌和表皮葡萄球菌也極敏感，MIC都是31.24 mg/mL，其醇提物濃度為1 g/mL時對所有供試菌都有抑菌作用。

2.2 核酸含量的測定結(jié)果

按照1.3.4方法，用酶標儀測定不同濃度的羊踟躕提取物藥液對金黃色葡萄球菌DNA的吸光度值，結(jié)果見圖1。

圖1 菌液的吸光度值(DNA)

由圖1可知，不同濃度的羊踟躕提取物對金黃色葡萄球菌存在著不同程度的影響。4*MIC、2*MIC以及最小抑菌濃度下的藥液能明顯地使菌懸液中的DNA增加；加入0.5*MIC的實驗組和不加藥液的對照組中細菌DNA變化微弱，基本可以忽略不計。表明，一定濃度下的羊踟躕提取物能改變細菌細胞膜的通透性，從而使細菌細胞膜內(nèi)的DNA外流。細菌經(jīng)高濃度藥液作用4小時后，所測得吸光度值有所降低，估計是由于細菌全部死亡所造成。此外，由于藥液顏色偏深并且與肉湯培養(yǎng)基作用后，溶液中會有沉淀生成，所以造成吸光度值普遍偏大，也對實驗造成了一定誤差。

2.3 電導(dǎo)率的測定結(jié)果

按照1.3.5方法，羊踟躕提取物作用下金葡菌電導(dǎo)率測定結(jié)果見圖2。隨著藥物作用時間的增加，實驗組溶液中電導(dǎo)率值也隨之增加；對照組電導(dǎo)率值無明顯變化。其可能是由于金黃色葡萄球菌經(jīng)羊踟躕提取物的作用后，導(dǎo)致其細胞膜通透性增加，使得細胞內(nèi)K+、Na+等導(dǎo)電離子外流，從而增加了溶液的電導(dǎo)率。

圖2 菌懸液電導(dǎo)率值

2.4 細菌生長曲線的測定結(jié)果

按照1.3.6方法，測定600nm條件下菌液的吸光度值繪制生長曲線見圖3。對照組的金黃色葡萄球菌對數(shù)生長；0.5*MIC藥液組，前期細菌數(shù)量有明顯的增加，后期也有增長趨勢，但數(shù)量變化不大，說明該濃度下的羊踟躕提取物對金黃色葡萄球菌有一定的抑制作用，但不能完全抑制其的生長；MIC和2*MIC實驗組中，前期細菌也有所增長，但后期其生長已完全停止，甚至出現(xiàn)吸光度值變小的情況，說明這兩個濃度的羊踟躕提取物完全達到了抑制金黃色葡萄球菌生長的作用，甚至能使細菌死亡。

圖3 金黃色葡萄糖球菌生長曲線圖

2.5 掃描電鏡觀察細菌形態(tài)的結(jié)果

圖4 金黃色葡萄糖球菌掃描電鏡圖

按照1.3.7方法，用小型離子濺射儀以10 mA電流噴金20 s后于掃描電鏡觀察經(jīng)羊踟躕提取物作用后金黃色葡萄球菌的形態(tài)，結(jié)果如圖4所示。

從圖4可以看出，對照組正常生長一段時間后，金黃色葡萄球菌菌體飽滿，形態(tài)完整。細菌經(jīng)羊踟躕提取物作用后，菌體變形、塌陷，甚至發(fā)生表面溶解，形態(tài)完整性遭到了明顯破壞。由此說明，羊踟躕提取物對金黃色葡萄球菌菌體結(jié)構(gòu)具有較強的破壞作用。

3 結(jié) 論

本研究以不同濃度的羊踟躕提取物作用于金黃色葡萄球菌，結(jié)果表明該藥物對此細菌具有較好的抑制作用最小抑菌濃度為31.24 mg/mL，MIC使得細菌細胞膜內(nèi)的導(dǎo)電離子大量外流，細菌DNA外流細菌完整性明顯遭到破壞，出現(xiàn)了凹陷、破損等。推測羊踟躕對金黃色葡萄糖球菌的抑菌機制是通過破壞細菌細胞膜甚至細胞完整性，使得細胞內(nèi)的K+、Na+等導(dǎo)電離子及DNA等大分子物質(zhì)外流，從而造成細菌無法生存及繁殖。