黃芪飲片質(zhì)量評價和分級標(biāo)準(zhǔn)探討△

尚興樸，歐陽羅丹，肖蘇萍*，王繼永，高永堅，袁春平，劉暢

1.中國中藥有限公司，北京 100195；2.中國中藥控股有限公司，廣東 佛山 528303；3.江西中醫(yī)藥大學(xué)，江西 南昌 330004

黃芪為豆科植物蒙古黃芪Astragalusmembranaceus(Fisch.)Bge.var.mongholicus(Bge.)Hsiao或膜莢黃芪Astragalusmembranaceus(Fisch.)Bge.的干燥根，具有補(bǔ)氣升陽、固表止汗、利水消腫、生津養(yǎng)血、行滯通痹、排膿托毒、斂瘡生肌之功效[1]。黃芪在我國分布較為廣泛，中國大部分地區(qū)均有種植，主要產(chǎn)區(qū)有內(nèi)蒙古、山西、甘肅、黑龍江等[2]。黃芪始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，原名“黃耆”，列為上品[3]。作為大宗常用藥材，應(yīng)用廣泛，含黃芪的中成藥品種就有783個，27個劑型，主要用于滋補(bǔ)類的適應(yīng)癥，5013家生產(chǎn)企業(yè)生產(chǎn)，單味制劑有黃芪精、黃芪顆粒、北芪片、黃芪精顆粒、黃芪片。含黃芪的保健食品有1050個，劑型有顆粒、膠囊、茶、酒、口服液、漿、片、咀嚼片、泡騰片、沖劑、飲料、袋泡茶、糖漿、膏、濃縮液、濃縮精等。目前臨床使用和企業(yè)生產(chǎn)的黃芪飲片類型主要有黃芪片、炒黃芪、酒黃芪、鹽黃芪、米炒黃芪、酒炒黃芪等，主流炮制品為黃芪片和蜜炙黃芪[4]。目前，由國家中醫(yī)藥管理局與衛(wèi)生部制定，1984年3月試行的部頒標(biāo)準(zhǔn)《七十六種藥材商品規(guī)格標(biāo)準(zhǔn)》[國藥聯(lián)材字(84)第72號文]附件中黃芪藥材等級的劃分方法，至今仍是黃芪藥材商品流通領(lǐng)域用于限定黃芪藥材商品規(guī)格等級的使用標(biāo)準(zhǔn)基礎(chǔ)依據(jù)。但黃芪飲片尚未有官方規(guī)范的等級分類標(biāo)準(zhǔn)。經(jīng)課題組市場調(diào)研得知，黃芪飲片價格與黃芪飲片直徑有很大的關(guān)系，直徑越大，市場價格越高，直徑越小，價格越低。

近年來，有少數(shù)研究者分別以黃芪甲苷和毛蕊異黃酮葡萄糖苷的含量測定指標(biāo)，分析探討黃芪飲片等級標(biāo)準(zhǔn)制訂依據(jù)[5-6]。但其對樣品等級分級過多，分級標(biāo)準(zhǔn)不清晰，而且以單一成分含量作為評價指標(biāo)，不能全面評價黃芪質(zhì)量情況。黃芪首次被《中華人民共和國藥典》(以下簡稱《中國藥典》)收錄是在1963年，而后都被歷版《中國藥典》收錄，隨著分析技術(shù)水平的提高，被收錄的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)也不斷提高。2015年版《中國藥典》黃芪飲片項下含量測定為黃芪甲苷和毛蕊異黃酮葡萄糖苷2項檢測項[1]，前處理方法分為2個不同部分，且涉及索氏提取、萃取、堿處理、柱層析等過程，十分繁瑣，且容易造成測量結(jié)果誤差大等問題。黃芪主要含有皂苷類和黃酮類，現(xiàn)代藥理實驗表明，黃芪皂苷類成分具有抗衰老、抗病毒、抗風(fēng)濕、降壓、保護(hù)心肌細(xì)胞、抗腫瘤、抗肝纖維化等作用[7]，黃芪黃酮類成分具有抗心肌缺血、消除自由基、抗炎、抗突變、抗損傷、抗骨質(zhì)疏松、影響免疫系統(tǒng)和對肝損傷防護(hù)等作用[8]。本課題組對收集于不同生產(chǎn)企業(yè)、不同流通市場以及由原藥材自行工業(yè)大生產(chǎn)加工成飲片的黃芪飲片進(jìn)行外觀指標(biāo)測定，通過優(yōu)化改進(jìn)并新建的黃芪含量測定方法，在測定黃芪甲苷和毛蕊異黃酮葡萄糖苷含量的基礎(chǔ)上，增加毛蕊異黃酮、芒柄花苷等成分含量測定，以期為黃芪飲片等級分級、標(biāo)準(zhǔn)制訂和質(zhì)量評價提供理論依據(jù)，為黃芪飲片市場價格管控提供參考依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

XS2050U型電子天平(梅特勒-托利多儀器上海有限公司)；XB620M型電子天平(瑞士Precisa)；1260型高效液相色譜儀、ELSD 2000ES型蒸發(fā)光散射檢測器(美國奧泰公司)；e2695型高效液相色譜儀、2998光電二極管陣列檢測器(美國沃特斯公司)；超純水儀(Millipore公司)；超聲波提取儀(SD2800LHC型，北京中晟銘科技有限公司)。

1.2 試藥

黃芪甲苷對照品、毛蕊異黃酮葡萄糖苷對照品(中國食品藥品檢定研究院，批號分別為：110781-201717、111920-201606)；芒柄花素對照品、毛蕊異黃酮對照品、芒柄花苷對照品(上海源葉生物科技有限公司，批號分別為：H06S9Z69494、Y24N9Y75652、R28O8F46957)；乙腈、甲醇(色譜純)；正丁醇(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號：滬試10005218)；氨水(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號：10002118，分析純)。

黃芪飲片樣品經(jīng)中國中藥有限公司王繼永研究員鑒定為豆科植物蒙古黃芪干燥根的切制飲片，經(jīng)粉碎，過四號篩備用。黃芪飲片樣品留存于中國中藥有限公司科技研發(fā)部。黃芪飲片信息見表1。

表1 黃芪飲片樣品信息

注：荷花池市場為成都市荷花池中藥材批發(fā)市場的簡稱；玉林市場為廣西玉林市中藥材專業(yè)市場的簡稱。

2 方法

2.1 黃芪飲片外觀指標(biāo)測定

在借鑒中藥材商品規(guī)格傳統(tǒng)的“辨狀論質(zhì)”理論，依據(jù)黃芪切制飲片的特點，選擇以平均最窄直徑和平均質(zhì)量作為黃芪飲片的外觀指標(biāo)。先以市場分級和初步觀測收集樣品大致分級情況，然后從以上每份樣品中選取符合初步分級的各100個飲片，分別對每份樣品的100個飲片的直徑和質(zhì)量進(jìn)行測量和稱定，取其平均值。

2.2 黃芪甲苷、毛蕊異黃酮葡萄糖苷和其他黃酮類成分含量測定

參照課題組新建的方法，對黃芪各樣品中的黃芪甲苷、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、毛蕊異黃酮、芒柄花苷和芒柄花素進(jìn)行含量測定。

2.2.1對照品溶液制備

2.2.1.1黃芪甲苷 取干燥的黃芪甲苷對照品適量，精密稱定，加甲醇溶解，質(zhì)量濃度約為0.5 mg·mL-1。

2.2.1.2毛蕊異黃酮葡萄糖苷、芒柄花苷、芒柄花素、毛蕊異黃酮混合對照品溶液制備 取干燥的毛蕊異黃酮葡萄糖苷、芒柄花苷、芒柄花素和毛蕊異黃酮對照品適量，精密稱定，加甲醇溶解，毛蕊異黃酮葡萄糖苷質(zhì)量濃度約為1.5 mg·mL-1，芒柄花素、芒柄花苷和毛蕊異黃酮質(zhì)量濃度約為0.5 mg·mL-1。

2.2.2供試品溶液制備 精密稱取黃芪藥材粉末(過四號篩)2.0 g，置50 mL離心管中，加甲醇30 mL，超聲提取30 min，3000 r·min-1(離心半徑為13.5 cm)離心5 min。上清液用0.45 μm微孔濾膜濾過。殘渣用甲醇洗滌2次，每次15 mL，超聲提取5 min，離心5 min，濾過，合并上述濾液，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓蒸干。殘渣溶解于10 mL 10%氨水溶液中，放置10 min，不時振搖。將溶液移至分液漏斗中，用水飽和正丁醇萃取3次(15、10、10 mL)。合并提取液，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓濃縮蒸干，殘渣用甲醇溶解并轉(zhuǎn)移至2 mL容量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，即得。

2.2.3色譜分析條件

2.2.3.1黃芪甲苷含量測定的色譜條件與方法 以Agilent ZORBAX SB-C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)為色譜柱；流動相為乙腈-水(32∶68)；柱溫為30 ℃；進(jìn)樣量20 μL；流速為1 mL·min-1。蒸發(fā)光散射檢測器(ELSD)參數(shù)：氮氣流速為2.7 L·min-1；漂移管溫度為105 ℃；增益為1。

測定法：分別精密吸取對照品溶液10、20 μL，供試品溶液20 μL，注入液相色譜儀，測定，用外標(biāo)兩點法對數(shù)方程計算，即得。色譜見圖1。

2.2.3.2毛蕊異黃酮葡萄糖苷、芒柄花苷、毛蕊異黃酮含量測定的色譜條件與方法 色譜柱：Waters XBridge C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相：0.2%甲酸溶液(A)-乙腈(B)，梯度洗脫(0～20 min，80%～60%A，20%～40%B；20～30 min，60%A,40%B，30～40 min，60%A,40%B)；進(jìn)樣量10 μL；流速為1 mL·min-1；檢測波長為260 nm；柱溫為25 ℃。

測定法：分別精密吸取對照品溶液與供試品溶液10 μL，注入液相色譜儀，測定，即得。色譜見圖2。

注：A.黃芪甲苷對照品；B.黃芪飲片樣品。圖1 黃芪飲片黃芪甲苷HPLC圖

注：A.黃酮類成分混合對照品；B.黃芪飲片樣品；1.毛蕊異黃酮葡萄糖苷；2.芒柄花苷；3.毛蕊異黃酮；4.芒柄花素。圖2 黃芪飲片黃酮類成分HPLC圖

2.3 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 16.0軟件，對不同黃芪飲片外觀指標(biāo)和內(nèi)在各成分含量進(jìn)行相關(guān)分析、主成分分析和聚類分析，用于外觀指標(biāo)和內(nèi)在成分指標(biāo)與飲片劃分等級標(biāo)準(zhǔn)研究。

3 結(jié)果

3.1 黃芪飲片外觀指標(biāo)測定結(jié)果

按2.1項下方法進(jìn)行測定，結(jié)果見表2。

表2 黃芪飲片外觀指標(biāo)

注：平均最窄方向直徑指1個類圓形或不規(guī)則的切片通常有多個方向的長軸，它們所對應(yīng)的直徑必有1個是最窄的，這個最窄的通常就是原藥材的直徑[9]；各飲片企業(yè)樣品含有不同直徑大小飲片，本文僅選取占主要直徑大小的100個飲片進(jìn)行測定。

3.2 黃芪飲片有效成分含量

將外觀指標(biāo)測定后的飲片樣品按2.2項下方法對每個樣品平行制備2份供試品溶液，測定的含量取平均值，測定結(jié)果見表3。

表3 黃芪飲片各有效成分含量測定 %

注：*表示含量未達(dá)到2015年版《中國藥典》要求，△表示含量未達(dá)到《江西省中藥飲片炮制規(guī)范》(2008年版)和《上海市中藥飲片炮制規(guī)范》(2008年版)(黃芪甲苷≥0.035%)要求。

3.3 黃芪飲片外觀指標(biāo)與有效成分、有效成分之間含量的相關(guān)性分析

運用SPSS對飲片外觀指標(biāo)與內(nèi)在有效成分、有效成分相互之間的相關(guān)性進(jìn)行Pearson相關(guān)性分析，結(jié)果見表4。由表4可知，黃芪飲片平均最窄直徑與平均質(zhì)量呈顯著的正相關(guān)，r=0.824，平均最窄直徑、平均質(zhì)量與黃芪甲苷的r=-0.572(P<0.01)和-0.421(P<0.05)，呈中等強(qiáng)度的負(fù)相關(guān)，說明黃芪飲片直徑越大，質(zhì)量較大，黃芪甲苷含量越低。黃芪飲片外觀指標(biāo)與各黃酮類成分的相關(guān)性都較小；黃芪甲苷與各黃酮類成分的相關(guān)性也都較小，這可能與黃芪皂苷與異黃酮類次生代謝活性成分生物合成路徑中的關(guān)鍵調(diào)控酶基因不同有關(guān)[10]；但各黃酮類成分之間相關(guān)性較為顯著：毛蕊異黃酮葡萄糖苷含量與芒柄花苷含量具有極強(qiáng)的正相關(guān)，r=0.852(P<0.01)，與芒柄花素含量呈中等強(qiáng)度的負(fù)相關(guān)，r=-0.480(P<0.01)。芒柄花苷含量與毛蕊異黃酮含量、芒柄花素含量呈中、強(qiáng)度的負(fù)相關(guān)，r分別為-0.584(P<0.01)和-0.636(P<0.01)。毛蕊異黃酮含量與芒柄花素含量呈極強(qiáng)的正相關(guān)，r=0.911(P<0.01)。以上各黃酮類成分之間顯著的相關(guān)性可能與異黃酮類次生代謝活性成分生物合成路徑中的關(guān)鍵調(diào)控酶基因相同有關(guān)[10]。同時，提示這4種異黃酮類成分之間可能存在相互轉(zhuǎn)化等情況，目前尚未見相關(guān)報道，需進(jìn)一步的生物合成探索研究揭示。

表4 黃芪飲片等級與各有效成分的相關(guān)性分析

注：**表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；*表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

3.4 主成分和聚類分析

根據(jù)相關(guān)性分析數(shù)據(jù)，將外觀指標(biāo)、黃芪甲苷等3個具有顯著性相關(guān)的指標(biāo)進(jìn)行主成分分析和聚類分析。主成分的特征根為2.227，貢獻(xiàn)率為74.239%；特征向量依次為平均最窄直徑0.942，平均質(zhì)量0.887，黃芪甲苷含量-0.743，說明主成分有較大的貢獻(xiàn)率，從中提取的信息較多。進(jìn)一步將樣品的3個指標(biāo)進(jìn)行系統(tǒng)聚類分析(見圖3)。圖3的譜系圖中的距離代表相似度，距離越遠(yuǎn)差異越大。進(jìn)一步將確定的3個指標(biāo)作K-均值聚類分析處理，最終聚類中心值見表5。從表5可知，黃芪飲片平均最窄直徑和平均質(zhì)量與黃芪甲苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)呈負(fù)相關(guān)關(guān)系，直徑和質(zhì)量越大，黃芪甲苷含量越小。

圖3 黃芪飲片系統(tǒng)聚類分析圖

表5 黃芪飲片K-均值聚類法最終聚類中心值

4 討論

4.1 黃芪甲苷含量與黃芪外觀指標(biāo)關(guān)系

由表4～5可知，黃芪甲苷含量與黃芪外觀指標(biāo)平均最窄直徑和平均質(zhì)量呈負(fù)相關(guān)關(guān)系，即平均最窄直徑和平均質(zhì)量越大，黃芪甲苷含量越低。黃芪甲苷主要存在于根的形成層以外的韌皮部分，隨著生長年限的增加，藥材根部直徑增加，皮部所占比例降低，黃芪甲苷含量也隨之降低，此結(jié)果與已有研究報道一致[5，11-13]。33批樣品中有16批樣品的黃芪甲苷含量未達(dá)到《中國藥典》標(biāo)準(zhǔn)，占比48.5%，未達(dá)標(biāo)率高于牛倩蕓等[11]的研究結(jié)果(黃芪甲苷未達(dá)標(biāo)率20%)?？赡茉蚴牵?)收集的黃芪藥材樣品大部分為野生和半野生生長方式樣品，30批樣品中僅有6批為平地移培樣品，而根據(jù)其研究結(jié)果同等級栽培黃芪的黃芪甲苷含量明顯低于傳統(tǒng)黃芪，而本文除了藥材市場來源樣品其他均為栽培黃芪；2)根據(jù)本課題組藥材分級后大生產(chǎn)加工成飲片的黃芪甲苷與黃芪原藥材的黃芪甲苷比較分析，飲片的黃芪甲苷含量明顯低于原對應(yīng)藥材的黃芪甲苷含量，提示加工過程中對黃芪甲苷有所損失，具體見表6。

表6 黃芪藥材與飲片中黃芪甲苷含量比較 %

4.2 黃芪中4種黃酮類成分含量與黃芪外觀指標(biāo)關(guān)系

由表4可知，毛蕊異黃酮葡萄糖苷等4種黃酮類成分含量與黃芪外觀指標(biāo)不具有顯著相關(guān)性，毛蕊異黃酮葡萄糖苷含量均達(dá)到《中國藥典》含量要求，其平均值達(dá)到0.036%。毛蕊異黃酮、芒柄花苷、芒柄花素這3種黃酮類成分，目前在《中國藥典》的黃芪項下未規(guī)定其檢測方法和含量限定，從表4的33批黃芪飲片樣品中得出，毛蕊異黃酮平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.010%，芒柄花苷平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.017%，芒柄花素平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.007%。

4.3 黃芪飲片含量測定檢測項限度要求

本文中33批樣品中有16批樣品的黃芪甲苷含量未達(dá)到《中國藥典》標(biāo)準(zhǔn)，占比48.5%，牛倩蕓等[11]研究結(jié)果也提出了黃芪甲苷不達(dá)標(biāo)率較高的問題，建議《中國藥典》參照地方炮制規(guī)范要求，降低黃芪飲片中黃芪甲苷含量要求，即不得少于0.035%。而樣品中毛蕊異黃酮葡萄糖苷含量均達(dá)到《中國藥典》要求，建議與原來標(biāo)準(zhǔn)保持一致，不得少于0.020%。

毛蕊異黃酮是天然的植物雌激素，其結(jié)構(gòu)與雌激素的結(jié)構(gòu)相似，具有抗病毒、治療心血管疾病等多種功效，尤其在對惡性腫瘤增殖的抑制作用方面受到廣泛關(guān)注[14]。芒柄花苷具有促進(jìn)皮膚生長、清除氧自由基、抑制脂質(zhì)過氧化、維持血中一氧化氮(NO)濃度和保護(hù)缺血再灌注損傷、增強(qiáng)免疫等多種藥理活性。芒柄花素具有雌激素樣作用及對生殖系統(tǒng)具有一定的安全性，能夠調(diào)節(jié)血脂代謝及改善動脈粥樣硬化病變，還具有清除氧自由基、血管平滑肌細(xì)胞增殖、治療非小細(xì)胞肺癌等作用[15]。毛蕊異黃酮、芒柄花苷和芒柄花素作為黃芪中主要黃酮類成分，對其定性定量評價與控制，對全面綜合分析黃芪質(zhì)量具有一定的臨床指導(dǎo)意義。根據(jù)本文33批樣品檢測結(jié)果，建議將毛蕊異黃酮、芒柄花苷和芒柄花素同時收錄于《中國藥典》黃芪品種的含量測定項下，鑒于三者之間的相關(guān)性，限定三者含量之和不低于0.020%。

4.4 黃芪飲片分級標(biāo)準(zhǔn)探討

目前，《浙江省中藥飲片炮制規(guī)范》(2015年版)、《江西省中藥飲片炮制規(guī)范》(2008年版)和《上海市中藥飲片炮制規(guī)范》(2008年版)對黃芪切制飲片外觀性狀直徑要求為0.5～3.5 cm，而《中國藥典》(2015年版)和全國其他省市中藥飲片炮制規(guī)范均未在黃芪飲片項下對外觀性狀的直徑進(jìn)行規(guī)定。根據(jù)本文和其他研究者的研究結(jié)果，平均最窄直徑和平均質(zhì)量越大，黃芪甲苷含量越低，建議有關(guān)黃芪飲片地方炮制規(guī)范去除外觀性狀的直徑要求。

本課題組采用《中國藥典》黃芪飲片項下檢查、浸出物等項目進(jìn)行了實驗和分析，結(jié)果未發(fā)現(xiàn)浸出物等質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)項與飲片外觀指標(biāo)有相關(guān)性。本文通過數(shù)理統(tǒng)計方法分析得出可作為黃芪飲片等級評價標(biāo)準(zhǔn)的參數(shù)有黃芪飲片的最窄直徑、質(zhì)量和黃芪甲苷含量，初步探討了黃芪飲片外觀指標(biāo)與黃芪甲苷內(nèi)在指標(biāo)的關(guān)系。在實際應(yīng)用時，應(yīng)綜合考慮黃芪飲片分級標(biāo)準(zhǔn)的合理性，不僅考慮外觀指標(biāo)，還需考慮黃芪甲苷的內(nèi)在含量，規(guī)范使用，以其指導(dǎo)臨床應(yīng)用和市場交易價格。對于飲片生產(chǎn)企業(yè)對原料來源有質(zhì)量要求的，在各項指標(biāo)達(dá)到《中國藥典》要求的前提下，其終端客戶大多數(shù)為散戶或醫(yī)院，可考慮以外觀指標(biāo)分級黃芪飲片，以保證黃芪飲片外觀品相，達(dá)到品相好價格優(yōu)。對于需大量以黃芪飲片為主要原料投料生產(chǎn)的中成藥生產(chǎn)企業(yè)，為控制中成藥原料成本，減少加工過程中有效成分轉(zhuǎn)移率較低等影響因素，可考慮平均最窄方向直徑為0.30～0.72 cm的黃芪飲片投料，價格便宜，有效成分且有保障，能保證中成藥質(zhì)量和療效，符合市場規(guī)律。為滿足不同客戶需求，對于產(chǎn)地直接加工成黃芪飲片的，保證內(nèi)在成分指標(biāo)達(dá)標(biāo)的情況下，可根據(jù)黃芪藥材外觀指標(biāo)加工成不同等級的黃芪飲片。