PAX1和ZNF582甲基化在宮頸細胞學(xué)非典型鱗狀細胞分層管理中的意義

湯福想 郎凱楠 劉玉玲

子宮頸癌是一種常見女性惡性腫瘤，其發(fā)病率僅次于乳腺癌，并呈年輕化趨勢。近20年來，由于巴氏法涂片發(fā)明與臨床應(yīng)用，全球子宮頸癌的發(fā)病率已快速下降，自Foley等[1]報道宮頸細胞涂片可作為宮頸癌篩查工具引入國家篩查方案以來，子宮頸癌整體發(fā)病率下降了3.5%。由于宮頸細胞涂片的準(zhǔn)確性受主觀因素影響，主要取決于細胞病理醫(yī)師的經(jīng)驗及水平，其敏感度差異較大，敏感度由40%至80%，最低可達到20%。據(jù)最新的數(shù)據(jù)統(tǒng)計，中國每年仍有6萬2千例的子宮頸癌新發(fā)病例，死亡病例約為3萬例[2-3]，子宮頸癌給女性的生殖健康造成了威脅。近年來，發(fā)現(xiàn)全基因組DNA甲基化檢測新方法，可用于惡性腫瘤檢測。研究證實，DNA甲基化程度隨腫瘤發(fā)展而累積，如PAX1、SOX1、ZNF582甲基化程度與CIN病變發(fā)展進程具一致性，隨著病變級別的增加，甲基化程度也增高[4-5]。本研究主要通過檢測ASCUS人群宮頸脫落細胞的PAX1與ZNF582基因甲基化水平及高危型人乳頭瘤病毒感染狀況，并與陰道鏡檢查與病理切片進行比對，評價檢測PAX1和ZNF582基因甲基化在宮頸癌篩查特別是ASCUS分流中的效果，為ASCUS診治提供可靠理論依據(jù)，降低婦女對ASCUS恐慌，減少過度治療，減少女性子宮頸癌發(fā)病和死亡的風(fēng)險，具有社會意義和臨床應(yīng)用價值。

對象與方法

1.對象：選取 2017 年 7 月—2018 年 12 月在本院婦科門診行宮頸癌篩查且細胞學(xué)涂片結(jié)果為ASC(ASCUS & ASC-H)的患者265例，年齡25～65歲。

2.方法：采用重亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化和定量甲基化特異性PCR(QMSP)測定 ASC患者宮頸脫落細胞中PAX1和ZNF582基因甲基化的水平，采用第二代雜交捕獲檢測技術(shù)進行高危型HPV檢測，以宮頸活檢病理結(jié)果作為病人分層的金標(biāo)準(zhǔn)，根據(jù)受試者工作特征曲線下面積(AUC)，探索PAX1與ZNF582甲基化陽性結(jié)果的cutoff 值。根據(jù)病理活檢組織的檢測結(jié)果，分析HR-HPV、PAX1、ZNF582基因甲基化的靈敏度(SE)、特異度(SP)、陽性預(yù)測值(PPT)、陰性預(yù)測值(NPT)、陽性似然比(和陰性似然比(-LR)。效果間比較采用卡方檢驗。采用ROC曲線分析HR-HPVDNA檢測及甲基化檢測識別ASC患者中CIN Ⅱ+、CIN Ⅲ+的能力。ROC曲線可反映檢測方法的敏感性和特異性，ROC曲線下面積越大，診斷效能越高，其診斷準(zhǔn)確性越大。AUC值在0到1之間，AUC<0.5，提示診斷效能較差；AUC>0.5，提示有一定的診斷能力；AUC越接近于1，提示診斷的準(zhǔn)確性越高。

SE=TP/(TP+FN)×100%；SP=TN/(TN+FP)×100%；PPT=TP/(TP+FP)×100%；

NPT=TN/(TN+FN)×100%；+LR=SE/(1-SP)；-LR=(1-SE)/SP

(注：TP=真陽性，F(xiàn)P=假陽性，TN=真陰性，F(xiàn)N=假陰性)

3.cutoff值探索：當(dāng)PAX1的ΔCP值小于8.8時或ZNF582的ΔCP值小于11.1 時，ASC患者患癌風(fēng)險增加。這與預(yù)設(shè)的甲基化陽性標(biāo)準(zhǔn)(PAX1的cutoff 值為9，ZNF582的cutoff值為11)基本相符。

4.統(tǒng)計學(xué)處理：分析軟件應(yīng)用 MedCalcV 15.2和SPSS 21.0，檢驗水準(zhǔn)α=0.05，P<0.05表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié)果

1.ASC患者活檢病理結(jié)果：265 例 ASC 患者中，ASCUS 患者 203 例，其中病理學(xué)結(jié)果為宮頸浸潤癌 4 例(2.0%)、CIN Ⅲ(包括原位癌)18 例(8.9%)、CIN Ⅱ 30 例(14.8%)、CIN Ⅰ 65 例(32.0%)、炎癥者 86 例(42.4%)，見表1。其中病理結(jié)果為 CIN Ⅱ+(包括CIN Ⅱ、CIN Ⅲ及宮頸浸潤癌)的患者為 52 例(25.6%,52/203)，病理結(jié)果為 CIN Ⅲ+(CIN Ⅲ及宮頸浸潤癌)的患者為 22 例(10.8%,22/203)。

265例 ASC 患 者中，ASC-H 患者 62 例，其中病理診斷為宮頸浸潤癌 8 例(12.9%)、CIN Ⅲ(包括原位癌)18 例(29.0%)、CIN Ⅱ 4 例(6.5%)、CIN Ⅰ 2 例(3.2%)、炎癥者 30 例(48.4%)，見表1。其中病理結(jié)果為 CIN Ⅱ+的患者為 30 例(48.4%,30/62)，病理結(jié)果為 CIN Ⅲ+的患者為 26(41.9%,26/62)例。

2.cutoff值探索：通過ROC曲線分析ASC人群，當(dāng)AUC面積最大時，PAX1甲基化檢測CIN Ⅱ+的最佳臨界點為8.8，ZNF582甲基化檢測CIN Ⅱ+的最佳臨界點為11.1。

表1 ASC人群特征及基礎(chǔ)數(shù)據(jù)

3.三種不同檢測方法在ASCUS人群中檢測CIN Ⅱ+、CIN Ⅲ+的診斷效能分析：ASCUS人群中，HPV檢測CIN Ⅱ+的靈敏度是90.6%，特異度是64.7%；PAX1甲基化檢測CIN Ⅱ+的靈敏度是83.0%，特異度是87.3%；ZNF582甲基化檢測CIN Ⅱ+的靈敏度是71.7%，特異度是92.0%。三種檢測方法兩兩比較，當(dāng)檢測CIN Ⅱ+時，PAX1甲基化的ROC曲線下面積大于HPV檢測(Z=2.182,P=0.029)，HPV檢測與ZNF582甲基化檢測ROC曲線下面積無明顯差異(Z=1.262,P=0.206)，兩種基因甲基化檢測CIN Ⅱ+的ROC曲線下面積無明顯差別(1.208,P=0.227)，見表2。使用ROC曲線比較三種檢測方法在ASCUS人群中檢測CIN Ⅱ+的AUC面積，PAX1甲基化的AUC面積最大(AUC=86.2%)，見圖1A。

ASCUS人群中，HPV檢測CIN Ⅲ+的靈敏度是100.0%，特異度是56.7%；PAX1甲基化檢測CIN Ⅲ+的靈敏度是91.3%，特異度是82.8%；ZNF582甲基化檢測CIN Ⅲ+的靈敏度是91.4%，特異度是95.0%。三種檢測方法兩兩比較，PAX1甲基化檢測CIN Ⅲ+的ROC曲線下面積大于HPV檢測(Z=2.716,P=0.007)，ZNF582甲基化檢測CIN Ⅲ+的ROC曲線下面積大于HPV檢測(Z=3.958,P=0.001),但是兩種基因甲基化檢測CIN Ⅲ+的ROC曲線下面積無明顯差別(2.250,P=0.024)，見表2。使用ROC曲線比較三種檢測方法在ASCUS人群中檢測CIN Ⅲ+的AUC面積，ZNF582甲基化檢測AUC面積最大(AUC=95.5%)，見圖1B。

4.三種檢測方法在ASC-H中檢測CIN Ⅱ+、CIN Ⅲ+的診斷效能分析：ASC-H 人群中，HPV檢測CIN Ⅱ+的靈敏度是100.0%，特異度是37.5%；PAX1甲基化檢測CIN Ⅱ+的靈敏度是90.0%，特異度是90.6%；ZNF582甲基化檢測CIN Ⅱ+的靈敏度是90.0%，特異度是96.9%。三種檢測方法兩兩比較，PAX1甲基化檢測CIN Ⅱ+的ROC曲線下面積大于HPV檢測(Z=3.668，P<0.001)，ZNF582甲基化檢測CIN Ⅱ+的ROC曲線下面積大于HPV檢測(Z=3.578，P<0.001),兩種基因甲基化檢測CIN Ⅱ+的ROC曲線下面積無明顯差別(0.241，P=0.809),見表3。使用ROC曲線比較三種檢測方法在ASC-H人群中檢測CIN Ⅱ+的AUC面積，PAX1甲基化的AUC面積最大(AUC=94.6%)，見圖2A。

ASC-H人群中，HPV檢測CIN Ⅲ+的靈敏度是100.0%，特異度是33.3%；PAX1甲基化檢測CIN Ⅲ+的靈敏度是88.5%，特異度是80.6%；ZNF582甲基化檢測CIN Ⅲ+的靈敏度是96.2%，特異度是94.4%。三種檢測方法兩兩比較，PAX1甲基化檢測CIN Ⅲ+的ROC曲線下面積大于HPV檢測(Z=3.331，P<0.001),ZNF582甲基化檢測CIN Ⅲ+的ROC曲線下面積大于HPV檢測(Z=4.111,P<0.001)，兩種基因甲基化檢測CIN Ⅱ+的ROC曲線下面積無明顯差別(Z=1.444,P=0.149)，見表3。使用ROC曲線比較三種檢測方法在ASC-H人群中檢測 CIN Ⅲ+的AUC面積，ZNF582甲基化檢測AUC面積最大(AUC=96.0%)。見圖2B。

表2 三種檢測方法在ASCUS人群中檢測CIN Ⅱ+和CIN Ⅲ+的診斷效能

A為不同檢測方法診斷 ASCUS 患者中 CINⅡ+的 ROC 曲線、B為不同檢測方法診斷 ASCUS 患者中 CINⅢ+的 ROC 曲線；HPV、PAX1、ZNF582分別指 HPVDNA 定性檢測、PAX1 甲基化檢測、ZNF582 甲基化檢測

表3 三種檢測方法在 ASC-H 人群中檢測 CIN Ⅱ+和CIN Ⅲ+的診斷效能

圖2 不同檢測方法診斷 ASC-H 患者中 CINⅡ+、CINⅢ+的 ROC 曲線

5.三種不同檢測方法在ASC人群中檢測CIN Ⅱ+、CIN Ⅲ+的診斷效能分析：ASC人群中，HPV檢測CIN Ⅱ+的靈敏度是94.0%，特異度是59.9%；PAX1甲基化檢測CIN Ⅱ+的靈敏度是85.5%，特異度是87.9%；ZNF582甲基化檢測CIN Ⅱ+的靈敏度是78.3%，特異度是92.9%。三種檢測方法兩兩比較，PAX1甲基化檢測CIN Ⅱ+的ROC曲線下面積大于HPV檢測(Z=3.723,P<0.001)，ZNF582甲基化檢測CIN Ⅱ+的ROC曲線下面積大于HPV檢測(Z=3.032,P=0.002)，兩種基因甲基化檢測CIN Ⅱ+的ROC曲線下面積無明顯差別(0.942,P=0.346)，見表4。使用ROC曲線比較三種檢測方法在ASC人群中檢測CIN Ⅱ+的AUC面積，PAX1甲基化的AUC面積最大(AUC=89.1%)，見圖3A。

ASC人群中，HPV檢測CIN Ⅲ+的靈敏度是100.0%，特異度是52.8%；PAX1甲基化檢測CIN Ⅲ+的靈敏度是87.8%，特異度是82.9%；ZNF582甲基化檢測CIN Ⅲ+的靈敏度是93.9%，特異度是91.7%。三種檢測方法兩兩比較，PAX1甲基化檢測CIN Ⅲ+的ROC曲線下面積大于HPV檢測(Z=3.895,P<0.001)，ZNF582甲基化檢測CIN Ⅲ+的ROC曲線下面積大于HPV檢測(Z=5.763,P<0.001),ZNF582甲基化檢測CIN Ⅲ+的ROC曲線下面積大于PAX1甲基化檢測(Z=3.407,P<0.001)，見表4。使用ROC曲線比較三種檢測方法在ASC人群中檢測CIN Ⅲ+的AUC面積，ZNF582甲基化檢測AUC面積最大(AUC=96.0%)，見圖3B。

表4 三種檢測方法在ASC人群中檢測CIN Ⅱ+和CIN Ⅲ+的診斷效能

圖3 不同檢測方法診斷 ASC 患者中CIN Ⅱ+、CIN Ⅲ+的ROC曲線

討論

本研究表明，在ASC人群中，PAX1、ZNF582甲基化檢測CIN Ⅱ+、CIN Ⅲ+的能力比HPV(Hc2)測試更好，這表明PAX1、ZNF582在ASCUS人群的分流具有重要價值。利用DNA甲基化作為宮頸癌篩查分子標(biāo)記物正在探索研究中[6-7]。研究發(fā)現(xiàn)，PAX1檢測作為潛在生物標(biāo)志物可用于檢測CIN Ⅲ +[8]。關(guān)于ASCUS分類的研究中，提示W(wǎng)T1和PCDH10甲基化檢測是優(yōu)于HPV檢測[9-10]。研究發(fā)現(xiàn)，不論是ASCUS人群還是ASC-H人群，PAX1甲基化測試檢測 CIN Ⅱ+的診斷能力較好。中國臺灣一項研究發(fā)現(xiàn)，ZNF582甲基化檢測在低度鱗狀上皮內(nèi)病變分流診斷中發(fā)揮作用。在PTPRR、SOX1、PAX1、ZNF582四個甲基化基因中，發(fā)現(xiàn)ZNF582是檢測CIN Ⅲ +的最好的生物標(biāo)志物[11]。本研究發(fā)現(xiàn)，在ASCUS人群中ZNF582甲基化檢測CIN Ⅱ+的靈敏度是71.7%，特異度是92.0%；ZNF582甲基化檢測CIN Ⅲ+的靈敏度是91.4%，特異度是95.0%。本研究發(fā)現(xiàn)，在ASC-H人群中，ZNF582甲基化檢測CIN Ⅱ+的靈敏度是90.0%，特異度是96.9%；ZNF582甲基化檢測 CIN Ⅲ+的靈敏度是93.9%，特異度是91.7%。由此可以看出，ZNF582甲基化測試在ASCUS人群中檢測CIN Ⅱ+和CIN Ⅲ+的診斷能力較好，ZNF582可以作為 ASC-H人群分流的生物標(biāo)記物。

本研究提示，PAX1/ZNF582甲基化檢測可以增加ASC(ASCUS &ASC-H)人群檢出CIN Ⅱ+/CIN Ⅲ+的特異度，由此可以大膽嘗試對細胞學(xué)為 ASCUS/ASC-H 人 群 進 行PAX1/ZNF582 基 因 甲 基 化 檢 測 ,結(jié) 果 提 示為PAX1/ZNF582甲基化陽性者，可進行陰道鏡檢查；甲基化陰性者可一年后復(fù)查，這樣可減輕患者不必要的經(jīng)濟和心理負擔(dān)。基因甲基化檢測作為一種無創(chuàng)的檢測方法，不僅患者容易接受，而且可減少陰道鏡轉(zhuǎn)診的數(shù)量，減少過度治療。當(dāng)然，這一假想還有待將來的研究驗證。此外，甲基化檢測在宮頸癌術(shù)后隨訪中的應(yīng)用價值也尚待證明，同樣需要更多的研究去驗證。