一個(gè)辣椒輕斑駁病毒中國(guó)分離物的基因組測(cè)序及分析

李麗麗　鄭敏　楊洪一

摘 要： 利用CTAB法分離辣椒葉片總RNA，利用RT-PCR技術(shù)擴(kuò)增出了辣椒輕斑駁病毒中國(guó)分離物Hrb基因組不同區(qū)域片段。并經(jīng)克隆、測(cè)序，證明其為辣椒輕斑駁病毒特異序列。經(jīng)序列拼接，獲得了6 290 nt的辣椒輕斑駁病毒中國(guó)分離物Hrb基因組全序列;該序列與GenBank中已報(bào)道的其他辣椒輕斑駁病毒基因組的序列同源性為94.0%～99.6%。系統(tǒng)進(jìn)化分析顯示辣椒輕斑駁病毒中國(guó)分離物Hrb與日本分離物（PMMoV-J、C-1421、Pa18、TPO-2-19）親緣關(guān)系較近，與西班牙分離物Ia親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。

關(guān)鍵詞： 辣椒;辣椒輕斑駁病毒;基因組

中圖分類號(hào)：S641.3? ? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A? ? 文章編號(hào)：1673-2871（2020）06-012-05

Abstract： Total RNA was isolated from leaves of pepper using CTAB method. The fragments located in different regions of a Chinese isolate of Pepper mild mottle virus （PMMoV） were amplified by RT-PCR， and the PMMoV-specific fragments were confirmed by cloning and sequencing. A 6290 nt genome sequence of Chinese isolate Hrb was obtained. The identities between the sequence and other reported sequences in GenBank were 94.0%-99.6%. Phylogenetic analysis indicated that there was close genetic relationship between isolate Hrb with Japan isolates （PMMoV-J， C-1421， Pa18， and TPO-2-19）. In addition， there was far genetic relationship between isolate Hrb with Spanish isolate Ia.

Key words： Pepper; Pepper mild mottle virus; Genome

辣椒輕斑駁病毒（Pepper mild mottle virus，PMMoV）是當(dāng)前辣椒生產(chǎn)中遇到的主要病毒之一[1]。辣椒輕斑駁病毒屬煙草花葉病毒屬（Tobamovirus），病毒粒體呈直桿狀。辣椒輕斑駁病毒曾在英國(guó)、美國(guó)辣椒田中引起毀滅性災(zāi)害，目前該病毒已在美國(guó)、德國(guó)、日本等地廣泛發(fā)生，并在世界各地廣泛分布[2]。向本春等[3]于1994年在新疆辣椒上發(fā)現(xiàn)了辣椒輕斑駁病毒，是我國(guó)的首次報(bào)道。此后，相繼在青島、北京等地廣泛被報(bào)道[4]。辣椒輕斑駁病毒為種傳病毒，帶毒種子是病毒擴(kuò)散的重要因素。辣椒輕斑駁病毒可隨辣椒制品進(jìn)入人體，經(jīng)消化、排出體外后仍具有侵染性[5]。早期侵染后，辣椒輕斑駁病毒可使葉片輕度褪綠，部分植株矮化，癥狀可能較輕微;后期可能使葉片斑駁、黃化，可使辣椒果實(shí)呈現(xiàn)凹凸、壞死斑點(diǎn)或淺黃色斑駁，從而影響辣椒產(chǎn)量及品質(zhì)[1]。

辣椒輕斑駁病毒對(duì)辣椒生產(chǎn)造成了巨大威脅，因而迫切需要控制辣椒輕斑駁病毒造成的危害。培育抗病毒品種是控制植物病毒病危害的主要策略，當(dāng)前已獲得了辣椒輕斑駁病毒的抗性基因[6]。然而，由于病毒的快速變異，一些新的病毒分離物可能使抗性基因失效[7-9]。獲得病毒不同分離物的基因組序列并分析其分子變異特點(diǎn)是病毒防控的基礎(chǔ)性工作。筆者在前期研究中已獲得了一個(gè)辣椒輕斑駁病毒中國(guó)分離物，在本試驗(yàn)中探索獲得其基因組序列并分析其分子變異特點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 材料

感染辣椒輕斑駁病毒的辣椒植株于2014年取自哈爾濱農(nóng)田，經(jīng)RT-PCR鑒定其為辣椒輕斑駁病毒。該分離物被命名為Hrb。

基于辣椒輕斑駁病毒基因組序列（GenBank登陸號(hào)：NC_003630）設(shè)計(jì)引物。引物序列見(jiàn)表1，引物由上海生工生物工程公司合成。

1.2 總RNA分離

向離心管中加入490 μL CTAB、10 μL β-巰基乙醇。采集幼嫩葉片，經(jīng)液氮速凍，快速研磨至細(xì)粉，并轉(zhuǎn)入離心管。輕輕晃動(dòng)離心管，65 ℃水浴，之后加入等體積的氯仿/異戊醇（24∶1）混勻后12 000 r·min-1離心5 min。取上清，再次進(jìn)行氯仿/異戊醇抽提、12 000 r·min-1離心5 min。取上清并加入1/10體積3 mol·L-1醋酸鈉、三倍體積無(wú)水乙醇，混勻后12 000 r·min-1離心5 min。加入30 μL去離子水溶解沉淀。

1.3 利用RT-PCR技術(shù)擴(kuò)增病毒基因組不同區(qū)域片段

反轉(zhuǎn)錄體系如下：總RNA 1.0 μL，RNase free H2O 12 μL，M-MLV Buffer 4 μL，隨機(jī)引物1.0 μL，dNTPs 0.5 μL（10 mmol·L-1），RNasin Ribonuclease Inhibitor 0.5 μL，M-MLV 1 μL（200 U）。反應(yīng)條件為：37 ℃ 2.5 h，72 ℃ 30 min。

PCR體系如下：反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物2 μL，10×Buffer 2 μL，MgCl2 3 μL，10%甘油2 μL，上下游引物各2 μL（引物組合分別為A11/A22，B11/B22，C11/C22，D11/D22，E11/E22，F(xiàn)11/F22），dNTPs 0.4 μL（10 mmol·L-1），Taq DNA酶0.75 U，加去離子水至25 μL。反應(yīng)條件：94 ℃ 2 min;94 ℃ 30 s，55 ℃ 40 s，72 ℃ 1 min，35個(gè)循環(huán);72 ℃ 5 min。

1.4 PCR產(chǎn)物的克隆和測(cè)序

利用TaKaRa公司的瓊脂糖凝膠回收試劑盒回收目的片段，將回收的目的片段與pMD-18T載體連接。反應(yīng)體系如下：5 μL solution I buffer，1 μL pMD-18T載體，1 μL回收目的片段及3 μL去離子水，4 ℃過(guò)夜連接。

將10 μL連接產(chǎn)物加入30 μL JM109感受態(tài)細(xì)胞中，冰上放置30 min;42 ℃熱激45 s;冰浴1 min，加入LB液體培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。經(jīng)藍(lán)白斑篩選、PCR技術(shù)篩選陽(yáng)性克隆，之后對(duì)陽(yáng)性克隆進(jìn)行雙向測(cè)序。

使用DNAMAN軟件對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行序列拼接;之后利用BLAST進(jìn)行序列比較。利用CLUSTAL 1.83進(jìn)行多序列比對(duì)。

2 結(jié)果與分析

2.1 RT-PCR擴(kuò)增及測(cè)序

利用CTAB法分離辣椒葉片總RNA，利用擴(kuò)增辣椒輕斑駁病毒基因組不同區(qū)域的引物對(duì)，經(jīng)過(guò)不斷優(yōu)化RT-PCR反應(yīng)條件，最終擴(kuò)增出了預(yù)期的辣椒輕斑駁病毒基因組不同區(qū)域片段（圖1）。利用膠回收試劑盒，將擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行切膠回收純化。之后進(jìn)行克隆、測(cè)序，獲得了辣椒輕斑駁病毒中國(guó)分離物Hrb基因組不同區(qū)域片段的序列。

2.2 基因組特點(diǎn)分析

經(jīng)序列拼接，獲得了6 290 nt的辣椒輕斑駁病毒中國(guó)分離物Hrb基因組全序列（圖2）;該序列腺嘌呤∶胸腺嘧啶∶鳥(niǎo)嘌呤∶胞嘧啶的比例為19∶18∶15∶12。其核苷酸序列比GenBank中已報(bào)道的辣椒輕斑駁病毒基因組序列（GenBank登陸號(hào)：NC_003630）在700～768 nt處缺少69個(gè)核苷酸;序列缺失其并未造成移碼突變;在GenBank中未見(jiàn)類似缺失核苷酸的辣椒輕斑駁病毒分離物。

獲得的基因組序列包含4個(gè)開(kāi)放閱讀框（ORF）：ORF1（70～4 842 nt）、ORF2（70～3 357 nt）、ORF3（4 843～5 616 nt）、ORF4（5 619～6 092 nt）分別編碼183 KDa蛋白、126 KDa蛋白、運(yùn)動(dòng)蛋白（28 KDa）、外殼蛋白（17 KDa）。3非編碼區(qū)、5非編碼區(qū)分別為198 nt、69 nt（圖2）。

辣椒輕斑駁病毒中國(guó)分離物Hrb基因組序列與GenBank中已報(bào)道的其他辣椒輕斑駁病毒基因組序列同源性為94.0%～99.6%，中國(guó)分離物Hrb的ORF1、ORF2、ORF3、ORF4所編碼蛋白分別與其他分離物氨基酸序列同源性為96.2%～97.7%、95.4%～96.8%、96.5%～99.6%、94.3%～98.1%（表2）。中國(guó)分離物Hrb非編碼區(qū)序列與其他分離物同源性分別為95.7%～98.6%、97.5%～100%。

將得到的辣椒輕斑駁病毒中國(guó)分離物Hrb基因組序列與煙草花葉病毒屬內(nèi)其他病毒進(jìn)行了序列比較。此分離物與番茄花葉病毒（Tomato mosaic virus，ToMV）親緣關(guān)系最近，核苷酸序列相似性為68.5%;與郁金香脈明病毒（Turnip vein clearing virus，TVCV）親緣關(guān)系最遠(yuǎn)。ORF1、ORF2、ORF4的核苷酸序列相似性、氨基酸序列相似性均與番茄花葉病毒相似性最高，其次為煙草花葉病毒（Tobacco mosaic virus，TMV）;與郁金香脈明病毒（Turnip vein clearing virus，TVCV）相似性最低。

基于辣椒輕斑駁病毒基因組運(yùn)動(dòng)蛋白及外殼蛋白序列，對(duì)不同辣椒輕斑駁病毒分離物進(jìn)行了系統(tǒng)進(jìn)化分析。獲得的分離物與日本分離物（PMMoV-J、C-1421、Pa18、TPO-2-19）親緣關(guān)系較近，并聚集在一起形成一個(gè)小的進(jìn)化枝（圖3）;與西班牙分離物Ia親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。

3 討論與結(jié)論

我國(guó)自1994年首次報(bào)道了辣椒輕斑駁病毒后已有較多關(guān)于辣椒輕斑駁病毒危害辣椒的報(bào)道[1，3-4，9]。然而，當(dāng)前尚未引起辣椒生產(chǎn)及科研人員的廣泛重視。辣椒種子可攜帶辣椒輕斑駁病毒，因而利于其快速傳播。此外，人類糞便中的辣椒輕斑駁病毒也具有侵染性，即使常規(guī)堆肥也難以徹底殺滅植物殘?bào)w、糞便中的辣椒輕斑駁病毒[5]。因而，當(dāng)前我國(guó)辣椒輕斑駁病毒的危害范圍可能遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)現(xiàn)有報(bào)道中的分布范圍。

目前已有的辣椒輕斑駁病毒的報(bào)道主要集中于華北、華東等地[1，4，9]，其他地域的相關(guān)報(bào)道較少，且該病毒中國(guó)分離物的分子變異特點(diǎn)也尚不明晰。東北林業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院植物病原微生物課題組前期研究中已獲得了一個(gè)辣椒輕斑駁病毒中國(guó)分離物，筆者獲得了其基因組序列并分析了其分子變異特點(diǎn)。當(dāng)前我國(guó)已報(bào)道的辣椒輕斑駁病毒分離物較少，有必要通過(guò)大規(guī)模篩選分離，獲得更多辣椒輕斑駁病毒中國(guó)分離物，并進(jìn)一步分析當(dāng)前主要抗辣椒輕斑駁病毒基因?qū)Σ煌《痉蛛x物的有效性。

經(jīng)RT-PCR、克隆、測(cè)序，獲得了6 290 nt的辣椒輕斑駁病毒中國(guó)分離物Hrb基因組全序列;該序列與GenBank中已報(bào)道的其他辣椒輕斑駁病毒基因組的序列同源性為94.0%～99.6%。系統(tǒng)進(jìn)化分析顯示辣椒輕斑駁病毒中國(guó)分離物Hrb與日本分離物親緣關(guān)系較近，與西班牙分離物Ia親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。

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