史桂榮 任博文 杜旭召 張啟威 史棟梁*
(1.商丘醫(yī)學高等??茖W校, 河南 商丘476100; 2.河南省中醫(yī)院骨病一科, 河南 鄭州450002)
中醫(yī)藥在中國和亞洲其他國家已經使用了數千年,可用于各種疾病的防治且副作用很小。雞屎藤Paederia scandens(Lour.) Merr 是一種茜草科植物,主要分布于我國的長江中下游及以南各省。雞屎藤在中國、日本、韓國等地有著悠久的藥用歷史,廣泛用于緩解疼痛、炎癥等癥狀。研究表明,環(huán)烯醚萜及其相關的環(huán)烯醚萜苷化合物(雞屎藤苷、車葉草苷、雞屎藤苷酸等) 是雞屎藤主要的藥理活性成分[1]。
骨關節(jié)炎(OA) 是滑膜關節(jié)的一種漸進性疾病,在許多老年人中導致進行性疼痛,但除了止痛藥物和物理治療外,目前還沒有特別有效的治療OA 的藥物,這些藥物的療效有限。隨著對OA 病理的日益清楚的了解,迫切需要獲得一種有效的內源性修復藥物,減緩OA 的進程。本研究旨在通過體外實驗探討雞屎藤苷酸對IL-1β 誘導關節(jié)軟骨細胞增殖和炎癥反應的影響及其相關機制。
1.1 細胞株 人關節(jié)軟骨細胞(CH8 細胞) 購自中國科學研究院。
1.2 藥物與試劑 雞屎藤苷酸(paederosidic acid,PA,批號B20585,純度≥98%,上海源葉生物科技有限公司);DMEM/F12 培養(yǎng)液、胎牛血清(美國Gibco 公司);MTT 溶液(美國Sigma 公司);ELISA 試劑盒(武漢博士德生物技術有限公司);PrimeScript RT reagent 試劑盒[寶日醫(yī)生物技術(北京) 有限公司];兔抗MMP-3、MMP-13、p-p65、p65、p-IκBα、IκBα 抗體(美國Cell signaling 公司);IgG-辣根過氧化物酶(HRP) 標記的羊抗兔二抗(美國Invitrogen 公司)。
2.1 細胞培養(yǎng) 將人關節(jié)軟骨細胞(CH8 細胞) 接種于含10%胎牛血清的DMEM/F12 培養(yǎng)基,37℃、5% CO2培養(yǎng)箱內進行培養(yǎng)。當細胞鋪滿瓶底80%時,進行傳代,取第2 代軟骨細胞進行后續(xù)實驗。
2.2 軟骨細胞炎癥造模 取對數期細胞進行培養(yǎng),待細胞長至80%融合時,加入含IL-1β(10 ng/mL) 的DMEM/F12培養(yǎng)液處理CH8 細胞24 h[2]。
2.3 MTT 檢測CH8 細胞增殖 將CH8 細胞以1×104/孔的濃度接種于96 孔板,加入10、20、40、80、150 μg/mL 雞屎藤苷酸處理24 h;對照組只含DMEM/F12 培養(yǎng)液,加入MTT 溶液(5 mg/mL) 37℃孵育4 h,隨后在室溫條件下與二甲基亞砜共同孵育10 min,在酶標儀上測定其在570 nm處的吸光度值(OD)。加入含IL-1β(10 ng/mL) 的DMEM/F12 培養(yǎng)液處理CH8 細胞24 h,加入10、20、40、80、150 μg/mL 雞屎藤苷酸處理24 h,按上述MTT 方法,測定在570 nm 處的吸光度值(OD)。
2.4 ELISA 檢測NO 水平 將CH8 細胞以1×105/孔的濃度接種于6 孔板,加入含IL-1β(10 ng/mL) 的DMEM/F12培養(yǎng)液處理CH8 細胞24 h,加入10、20、40、80 μg/mL雞屎藤苷酸處理24 h,收集的細胞培養(yǎng)上清液。采用ELISA 試劑盒,按說明書測定培養(yǎng)基中NO 的水平。
2.5 RT-PCR 檢 測 CH8 細 胞MMP-3、MMP-13、iNOsmRNA 表達 收集細胞,用TRIzol 試劑提取總RNA,用PrimeScript RT reagent 試劑盒將1μg 總RNA 逆轉 錄成cDNA。參照SYBR Green PCR Master Mix 構建20 μL 反應體系,于ABI Prism 7500 序列檢測系統(tǒng)上進行反應檢測。引物序列,MMP-3 正向5′-GGAGATGCTCACTTTGACGATG-3′,反向5′-CAGCAACCA GGAATAGGTTGG-3′;MMP-13正 向 5′-GGTCCCAAAC GAACTTAACTTACA-3′,反 向 5′-CCTTGAACGTCATCATCAGGAAGC-3′ ;iNOs正 向5′-CCTCAAGCTATCGAATTTGTC-3′,反 向 15′-TTGCCATTGTT GGTGGAGTA-3′;β-actin正向5′-TTCTACAATGAGCTGCGTGTGGC-3′,反向5′-CTCATAGCTCTTCTCCAGGGAGGA-3′。
2.6 Western blot 檢測蛋白表達 收集細胞,用冷凍PBS 洗滌2 次后加入裂解緩沖液進行超聲處理,4℃、10 000 r/min離心10 min 收集上清液。BCA 蛋白試劑盒測定細胞上清液的蛋白質濃度。取30 μg 蛋白經SDS-PAGE 分離后,轉移到PVDF 膜。用5% 脫脂乳于常溫下封閉1 h,加入抗體MMP-3、MMP-13、p-p65、p65、p-IκBα、IκBα、β-actin,4℃孵育過夜。用TBST 洗滌后,加入IgG-辣根過氧化物酶(HRP) 標記的二抗室溫孵育1 h。用增強化學發(fā)光法(ECL) 檢測免疫反應,以β-actin 為內參作對照。
2.7 統(tǒng)計學分析 采用SPSS21.0 軟件進行統(tǒng)計分析,數據以() 表示,多組間比較采用方差分析,以P<0.05表示差異具有統(tǒng)計學意義。
3.1 雞屎藤苷酸對IL-1β 誘導CH8 細胞增殖的影響 單獨處理CH8 細胞24 h,不同濃度雞屎藤苷酸(10、20、40、80、150 μg/mL) 促進CH8 細胞增殖(P<0.05),無細胞毒性。與對照組比較,IL-1β 誘導CH8 細胞24 h,CH8 細胞增殖抑制(P<0.05),而雞屎藤苷酸干預24 h,其能促進CH8 細胞增殖。見圖1。
圖1 雞屎藤苷酸對IL-1β 誘導CH8 細胞增殖的影響
3.2 雞屎藤苷酸對IL-1β 誘導CH8 細胞MMP-3、MMP-13蛋白表達的影響 如圖2 所示,與對照組比較,IL-1β 誘導CH8 細胞上調MMP-3、MMP-13 蛋白及mRNA 表達(P<0.05),而雞屎藤苷酸干預后,抑制MMP-3、MMP-13 蛋白及mRNA 表達(P<0.05)。
圖2 雞屎藤苷酸對IL-1β 誘導CH8 細胞MMP-3、MMP-13 蛋白表達的影響
3.3 雞屎藤苷酸對IL-1β 誘導CH8 細胞NO 水平、iNOsmRNA 表達的影響 與對照組比較,IL-1β 誘導CH8 細胞產生NO,增加iNOSmRNA 表達(P<0.05),而雞屎藤苷酸則能抑制IL-1β 誘導CH8 細胞產生NO,降低iNOsmRNA表達(P<0.05)。見圖3。
3.4 雞屎藤苷酸對IL-1β 誘導CH8 細胞p-p65、p-IκBα 蛋白表達的影響 NF-κB 是誘導軟骨細胞iNOS 降解的重要調節(jié)因子。與對照組比較,IL-1β 誘導CH8 細胞促進p-p65、p-IκBα 表達(P<0.05),而雞屎藤苷酸能抑制IL-1β 誘導CH8 細胞p-p65、p-IκBα 表達上調(P<0.05)。見圖4。
圖3 雞屎藤苷酸對IL-1β 誘導CH8 細胞NO 水平、 iNOs mRNA 表達的影響
圖4 雞屎藤苷酸對IL-1β 誘導CH8 細胞p-p65、p-IκBα 蛋白表達的影響
雞屎藤苷酸是從雞屎藤中分離得到的一種有效成分,具有抗驚厥、鎮(zhèn)靜、抗炎、抗胃癌等藥理作用[3-5]。然而,雞屎藤苷酸在骨關節(jié)炎的作用迄今尚未見報道。骨關節(jié)炎的發(fā)生與老齡化、負重過大等過程有關,進而引發(fā)一系列的分子事件,導致關節(jié)軟骨細胞死亡和結構損傷,尤其是炎癥反應。大量研究表明,IL-1β 與OA 的嚴重程度呈正相關,且在顳下頜關節(jié)炎[6]、手骨關節(jié)炎[7]和膝關節(jié)炎[8]滑膜液中IL-1β 水平顯著升高。OA 的發(fā)生發(fā)展與軟骨細胞促炎細胞因子(IL-1β) 的產生密切相關。因此,本研究用IL-1β(10 ng/mL) 誘導人軟骨CH8 細胞炎性損傷,以模擬OA 的體外模型,研究雞屎藤苷酸在骨關節(jié)炎的作用。發(fā)現雞屎藤苷酸可促進軟骨細胞增殖,并下調MMP-3 和MMP-13表達,以及NO 和iNOs 表達。此外,雞屎藤苷酸抑制IL-1β 激活的NF-κB 信號通路。
雖然對軟骨損傷的分子生物學進行了廣泛的研究,但至今還沒有發(fā)現某個單一因素會導致軟骨損傷[9]。在骨關節(jié)炎的發(fā)生過程中,滑膜釋放炎癥介質和細胞因子,軟骨細胞活化后產生MMPs 和NO,這些分子進一步引起軟骨結構改變[10]。骨關節(jié)炎的特點是細胞外基質(ECM) 大分子降解,軟骨細胞蛋白表達降低,導致關節(jié)嚴重疼痛,運動能力喪失,進行性不可逆功能障礙,而MMPs 被認為是降解ECM 的關鍵分子。MMP-3 可通過激活各種MMPs 前體,如pro-MMP-1、pro-MMP-7、pro-MMP-8、pro-MMP-13,以及裂解細胞外成分等加重炎癥反應[11]。MMP-13 可降解骨關節(jié)炎發(fā)展過程中的細胞外基質[12]。在本研究中,發(fā)現雞屎藤苷酸明顯降低MMP-3 和MMP-13 的蛋白表達,提示雞屎藤苷酸可能通過下調MMP-3 和MMP-13 的表達,來調控IL-1β 處理的軟骨細胞ECM 的降解。
在促炎因子中,NO 是一種具有快速和自發(fā)反應(與超氧陰離子反應) 的主要毒性物質,通過這種反應生成過氧亞硝酸和過氧亞硝酸陰離子。目前已鑒定出3 種形式的NOS,其中iNOS 除了被合成用于對炎癥刺激的反應外,還能誘導高水平的NO 生成[13]。NO 是OA 發(fā)病過程中重要的炎癥介質,前期的研究[14]發(fā)現iNOS 在IL-1β 誘導的軟骨細胞可導致NO 的過度產生。本研究發(fā)現,雞屎藤苷酸抑制IL-1β 刺激人軟骨細胞NO 的產生和iNOS 的表達,表明雞屎藤苷酸在IL-1β 誘導的關節(jié)軟骨細胞抑制NO 的產生和iNOS 的表達。
炎癥反應是導致ECM 降解的重要因素。多種炎癥因子可觸發(fā)IκBα 的磷酸化和降解,并將NF-κB 轉運到細胞核,促進炎癥蛋白合成和促炎分子(IL-6、TNF-α) 釋放,導致軟骨變性[14-15]。在非刺激條件下,NF-κB 二聚體與抑制蛋白IκB 結合后以非活性形式存在于胞漿中。在各種化學和機械信號刺激下,NF-κB 蛋白被活化,進而通過IκB 激酶使IκB 發(fā)生磷酸化[16]。在OA 中,軟骨細胞表達多種NF-κB介導的分解性細胞因子和趨化因子,如TNF-α、IL-1β、IL-6、NF-κB 受體激活因子(RANKL)、IL-8 等,這些因子和趨化因子促進MMPs 的產生,抑制膠原和蛋白多糖的合成,并在一個正反饋回路中增強NF-κB 的活化[17]。蔡林奕等[18]研究表明,NF-κB 抑制劑bay11-7082 可顯著降低經TNF-α 處理的軟骨細胞中MMPs 的表達。此外,Liacini等[19]研究還表明在人軟骨細胞中,NF-κB 抑制劑可抑制IL-1β誘導的MMP-3 和MMP-13 的產生。本研究發(fā)現雞屎藤苷酸可抑制IL-1β 誘導CH8 細胞p-p65、p-IκBα 蛋白表達上調。
綜上所述,雞屎藤苷酸通過抑制人軟骨細胞MAPK 和NF-κB 信號通路,抑制IL-1β 誘導的NO 產生,以及MMP-3、MMP-13、iNOS 的表達。雞屎藤苷酸可能是進一步開發(fā)抗關節(jié)炎藥物的理想候選藥物。