根吸收不同時(shí)期乳牙牙周膜干細(xì)胞通過NK細(xì)胞進(jìn)行免疫調(diào)節(jié)作用的研究

趙 辛，楊 寬，王子瑞，韓欣欣，汪璐璐，王小競

乳牙生理性根吸收是乳恒牙替換過程中發(fā)生的正常生理活動(dòng)，是恒牙列咬合順利建立的必要前提條件[1]。目前研究認(rèn)為影響乳牙生理性根吸收的因素包括咀嚼壓力、繼承恒牙胚壓力、遺傳因素等，而其具體機(jī)制尚未清楚[2]?，F(xiàn)有的關(guān)于乳牙生理性根吸收機(jī)制的研究主要集中在成骨細(xì)胞與破骨細(xì)胞所介導(dǎo)的骨吸收作用上，普遍認(rèn)為牙根吸收過程類似于骨吸收過程。課題組前期研究證實(shí)乳牙牙周膜干細(xì)胞(periodontal ligament stem cells, PDLSCs)參與乳牙生理性根吸收過程，調(diào)節(jié)破骨分化，影響根吸收進(jìn)程[3]。同時(shí)有研究證實(shí)乳牙PDLSCs可以通過分泌細(xì)胞因子發(fā)揮免疫調(diào)控作用。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)在骨吸收過程中，免疫細(xì)胞發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用[4]。還有學(xué)者發(fā)現(xiàn)自然殺傷細(xì)胞(natural killer cell，NK)分泌的干擾素γ(interferon-γ，IFN-γ)可以通過對核因子 κB受體活化因子配體(receptor activator of nuclear factor，RANKL)的平衡效應(yīng)抑制破骨分化[5]。而乳牙PDLSCs是否通過NK細(xì)胞進(jìn)行免疫調(diào)節(jié)從而在生理性根吸收過程中發(fā)揮作用罕見研究[6-8]。本實(shí)驗(yàn)檢測了NK細(xì)胞與不同根吸收期乳牙PDLSCs共培養(yǎng)后，NK細(xì)胞分泌IFN-γ能力的變化，旨在探究生理性根吸收過程中乳牙PDLSCs通過NK細(xì)胞對破骨分化調(diào)節(jié)作用。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑

收集因乳牙滯留拔除的健康乳前牙以及因正畸需要拔除的健康第一前磨牙(空軍軍醫(yī)大學(xué)口腔醫(yī)院兒童口腔科、頜面外科)，所收集牙齒均告知家長或患者并簽署知情同意書。

α-MEM培養(yǎng)液、胎牛血清(Gibco，美國)；Trizol Reagen(Invitrogen，美國)；SYBR試劑盒(Takara，日本)；CFX real-time PCR 系統(tǒng)(Bio-rad，美國) ；鼠抗人 Stro-1、CD34、CD146、CD14、CD31、CD90、CD105、CD44 抗體及人IFN-γ ELISA 試劑盒(Abcam 公司，英國)，倒置相差顯微鏡(Olympus，日本)。

1.2 方法

1.2.1 樣本的收集與分類 參考本課題組前期分組標(biāo)準(zhǔn)[6]，對收集到的乳牙及恒牙進(jìn)行分類：將牙根未吸收的乳牙標(biāo)本作為吸收穩(wěn)定期A組、牙根舌側(cè)吸收長度約1/2的標(biāo)本作為吸收中期B組、牙根舌側(cè)吸收長度大于2/3的標(biāo)本作為吸收晚期C組，因正畸治療需要而拔除的第一前磨牙作為恒牙組D組進(jìn)行對照。

1.2.2 乳牙PDLSCs的分離培養(yǎng) 將收集到的乳、恒牙樣本在無菌條件下保存。采用酶消化法(膠原酶消化60 min后組織塊接種至6孔板獲取原代乳牙和恒牙PDLSCs。采用有限稀釋法克隆純化。將各組細(xì)胞分別標(biāo)記為：吸收穩(wěn)定組(A)、吸收中期組(B)、吸收晚期組(C)、恒牙組(D)。

1.3 NK細(xì)胞與乳牙PDLSCs、RAW264.7細(xì)胞共培養(yǎng)

NK細(xì)胞、RAW264.7細(xì)胞購自北納生物公司，取NK細(xì)胞(密度為1×105/mL)與分離培養(yǎng)第3代各期乳牙PDLSCs(密度為2×106/mL)各1 mL于8塊6孔板細(xì)胞培養(yǎng)板中共培養(yǎng)，置37 ℃ 、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱孵育，共孵育12 h。

1.4 ELISA檢測

觀察共培養(yǎng)前后的NK細(xì)胞的IFN-γ的分泌水平變化，選取根吸收中期組(B)收集各孔上清液1 mL，采用ELISA試劑盒(Abcam 公司)檢測上清液中IFN-γ水平。根據(jù)濃度梯度將樣品與標(biāo)準(zhǔn)品加到酶標(biāo)包被板上，用封板膜封板后置37 ℃溫育30 min。棄去液體，甩干，每孔加滿洗滌液，靜置30 s后棄去，重復(fù)5次。每孔加入酶標(biāo)試劑50 μL，空白孔除外。用封板膜封板后置37 ℃溫育30 min。每孔先加入顯色劑A 50 μL、顯色劑B 50 μL，37 ℃避光顯色15 min。每孔加終止液50 μL，終止反應(yīng)。以空白孔調(diào)零，450 nm波長依序測量各孔的吸光度(OD值)。

1.5 實(shí)時(shí)定量PCR檢測

取上述各組共培養(yǎng)體系中的懸浮細(xì)胞即為NK細(xì)胞，分別提取其總RNA并反轉(zhuǎn)錄合成cDNA；然后以cDNA為模板，以β-actin為內(nèi)參進(jìn)行PCR增殖，分別檢測各組細(xì)胞中IFN-γ的表達(dá)水平。取各組共培養(yǎng)體系中的RAW264.7細(xì)胞，分別提取其總RNA并反轉(zhuǎn)錄合成cDNA；然后以cDNA為模板，以β-actin為內(nèi)參進(jìn)行PCR增殖，分別檢測各組細(xì)胞中RANKL、OPG的表達(dá)水平，具體引物序列見表1。

1.6 Western blot檢測

取各共培養(yǎng)體系中RAW264.7細(xì)胞，對細(xì)胞總蛋白進(jìn)行提取，檢測RANKL、OPG蛋白表達(dá)。提取總蛋白，使用Pierce?BCA Protein Assay kit測定；配制濃縮膠與分離膠；蛋白SDS-PAGE電泳：統(tǒng)一蛋白量，電壓恒定，轉(zhuǎn)膜:設(shè)定恒定電壓為100 V，時(shí)間為1.5 h；抗體孵育：采用TBST緩沖液對一抗進(jìn)行稀釋，4 ℃條件下孵育12 h。以1∶1 000的濃度對山羊抗兔二抗進(jìn)行稀釋，37 ℃的溫度條件下孵育1 h；TBST緩沖液洗膜，重復(fù)3次,每次持續(xù)10 min。將同體積發(fā)光液A液和B液混合，于黑暗的環(huán)境中將發(fā)光混合液滴加于PVDF膜的正面，檢測條帶。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

使用SPSS 16.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，組間差異采用單因素方差分析，組內(nèi)差異采用t檢驗(yàn)。P<0.05表示有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 生理性根吸收不同時(shí)期PDLSCs的分離培養(yǎng)

組織塊接種3～7 d后可以觀察到細(xì)胞從組織塊邊緣爬出，細(xì)胞呈長梭形，放射狀生長。細(xì)胞核呈卵圓形，位于細(xì)胞質(zhì)中央，各組細(xì)胞形態(tài)類似(圖1)。

2.2 PDLSCs 表面標(biāo)志物的鑒定結(jié)果

流式細(xì)胞儀檢測PDLSCs表面抗原表達(dá)水平，結(jié)果顯示所培養(yǎng)的PDLSCs表達(dá)間充質(zhì)干細(xì)胞細(xì)胞表面標(biāo)志物 Stro-1, CD146, CD105 和 CD90，而陰性表達(dá)造血系標(biāo)志物CD34和CD45(圖2)。

A: 吸收穩(wěn)定組；B:吸收中期組；C:吸收晚期組；D：恒牙組

圖1 各組原代PDLSCs形態(tài)(倒置顯微鏡) 觀察( ×40)

Fig.1 The morphology (inverted microscope) of primary PDLSCs in each group( ×40)

圖2 PDLSCS表面標(biāo)志物鑒定Fig.2 PDLSCS surface marker identification

2.3 不同根吸收期乳牙PDLSCs與NK細(xì)胞共培養(yǎng)后NK細(xì)胞IFN-γ變化

實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)果顯示，A、B、C、D各組的PDLSCs與NK細(xì)胞進(jìn)行共培養(yǎng)12 h后，各乳牙組NK細(xì)胞IFN-γ表達(dá)水平均降低，分別與恒牙組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)，各乳牙組比較，B組NK細(xì)胞IFN-γ下調(diào)幅度最大，與其他組相比均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

ELISA結(jié)果顯示，B組NK細(xì)胞IFN-γ表達(dá)顯著降低，明顯低于其他各組(P<0.05)，與實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)果一致(圖3)。

2.4 抑制乳牙PDLSCs TGF-β分泌后NK細(xì)胞IFN-γ的表達(dá)情況

左圖示:IFN-γ的基因表達(dá)；右圖示:IFN-γ的蛋白表達(dá)；*：與對照組相比，P<0.05

圖3 各共培養(yǎng)組中NK細(xì)胞IFN-γ的表達(dá)

Fig.3 IFN-γ expression of NK cells in each co-culture group

實(shí)時(shí)定量PCR顯示，在外源性TGF-β作用于B組共培養(yǎng)體系24 h后，IFN-γ表達(dá)明顯下降，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。在加入TGF-β抑制劑IL-2作用于共培養(yǎng)體系24 h后，IFN-γ表達(dá)明顯高于外源性TGF-β組，結(jié)果具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。ELISA結(jié)果與實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)果一致(圖4)。

左圖示:IFN-γ的基因表達(dá)；右圖示:IFN-γ的蛋白表達(dá)；*：與對照組相比，P<0.05

圖4 阻斷根吸收中期組TGF-β后NK細(xì)胞IFN-γ的表達(dá)

Fig.4 IFN-γ expression of NK cells after blocking TGF-β in the mid-term root absorption group

2.5 與NK細(xì)胞或根吸收中期組PDLSCs共培養(yǎng)后RAW264.7細(xì)胞RANKL/OPG基因表達(dá)的檢測

實(shí)時(shí)定量 PCR結(jié)果顯示(圖5)，NK細(xì)胞組與對照組相比，RAW264.7細(xì)胞RANKL基因表達(dá)降低，同時(shí)骨保護(hù)素(osteprotegerin，OPG)表達(dá)基因表達(dá)增高，統(tǒng)計(jì)后顯示RANKL/OPG 比值相對降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；PDLSCs組與對照組相比，RAW264.7細(xì)胞RANKL基因表達(dá)升高，同時(shí)OPG基因表達(dá)降低，統(tǒng)計(jì)后顯示RANKL/OPG 比值相對升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；上清液組與NK組相比，RAW264.7細(xì)胞 RANKL/OPG 比值升高；上清液組與PDLSCs組相比，RANKL/OPG 比值相對降低，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，表明乳牙根吸收中期組PDLSCs能夠降低NK細(xì)胞對破骨分化的抑制作用。

A: Western blot檢測各組RAW264.7細(xì)胞RANKL、OPG蛋白表達(dá)；B: Western blot檢測結(jié)果的 Image J灰度分析；C: RANKL、OPG的基因表達(dá)；*：與對照組相比，P<0.05

圖5 各組RAW264.7細(xì)胞中 RANKL、OPG的表達(dá)

Fig.5 RANKL and OPG expression in RAW264.7 cells of each group

3 討 論

當(dāng)前關(guān)于乳牙生理性根吸收研究的重點(diǎn)往往集中于破骨分化相關(guān)通路，未對生理性根吸收過程中免疫細(xì)胞的參與和發(fā)揮的作用進(jìn)行過多的探究[9-11]。而在生理性乳牙根吸收過程中，多種細(xì)胞、細(xì)胞因子形成了復(fù)雜的細(xì)胞微環(huán)境，其中存在著大量的免疫細(xì)胞及免疫因子[12-15]。已有研究證實(shí)，在根吸收過程中乳牙牙髓及牙周組織中免疫活性細(xì)胞大量增加，包括B細(xì)胞、DC細(xì)胞、NK細(xì)胞、T細(xì)胞等[16-18]。NK細(xì)胞所分泌的IFN-γ抑制破骨前體細(xì)胞向破骨細(xì)胞進(jìn)行分化發(fā)，IFN-γ可以干擾核轉(zhuǎn)錄因子 κB (nuclear factor-κB,NF-κB)受體活化因子配體，使破骨分化活動(dòng)無法正常進(jìn)行[19-20]。

本實(shí)驗(yàn)將分離出的不同時(shí)期PDLSCs分別與NK細(xì)胞進(jìn)行共培養(yǎng)，對NK細(xì)胞的IFN-γ表達(dá)進(jìn)行檢測，結(jié)果提示吸收中期組(B)基因及蛋白表達(dá)明顯低于其他各組，乳牙PDLSCs通過對NK細(xì)胞發(fā)揮免疫抑制作用抑制其IFN-γ的分泌，從而影響破骨分化。

本實(shí)驗(yàn)對NK細(xì)胞抑制效果最強(qiáng)的B組進(jìn)行干預(yù)，使用TGF-β這一間充質(zhì)來源干細(xì)胞常見的免疫抑制因子對NK細(xì)胞進(jìn)行抑制，結(jié)果顯示，在加入外源性TGF-β后，共培養(yǎng)體系中IFN-γ的表達(dá)明顯下降。在加入外源性IL-2后，共培養(yǎng)體系中IFN-γ的表達(dá)相比于TGF-β組明顯升高，結(jié)果有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。進(jìn)一步提示TGF-β可能在乳牙PDLSCs對NK細(xì)胞的免疫抑制中發(fā)揮重要作用，影響破骨分化。綜上所述，本實(shí)驗(yàn)創(chuàng)新性地將乳牙PDLSCs的免疫調(diào)控能力與乳牙生理性根吸收聯(lián)系在了一起，證實(shí)了在乳牙生理性根吸收過程中乳牙PDLSCs通過TGF-β等細(xì)胞因子對NK細(xì)胞發(fā)揮免疫抑制作用，從而影響破骨分化進(jìn)程。為乳牙生理性根吸收以及乳恒牙替換的相關(guān)機(jī)制的研究提供理論依據(jù)，也為臨床上對于相關(guān)疾病的治療與預(yù)防提供了新的思路。