不同濃度血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子對人牙周膜干細(xì)胞內(nèi)皮向分化的影響

石 笑，趙寅華，趙 螢，程百祥，陳永進(jìn)，張 旻

2004年Seo等[1]利用克隆篩選和免疫磁珠分離的方法分離獲得了牙周膜干細(xì)胞(periodontal ligament stem cells, PDLSCs)，并證實(shí)其具有高度自我更新能力和多向分化潛能，能夠分化為牙周膜組織中具有特定功能的細(xì)胞群，包括成骨細(xì)胞、成纖維細(xì)胞和成牙骨質(zhì)細(xì)胞，繼而形成骨、成牙骨質(zhì)及牙周膜纖維結(jié)構(gòu)[1-6]。

對于牙齒撕脫性損傷來說，如何促進(jìn)延遲再植脫位牙獲得理想的牙周膜性愈合，一直以來都是該領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)與難點(diǎn)。本課題組在前期研究中發(fā)現(xiàn)，補(bǔ)充外源性PDLSCs能明顯提高脫位再植牙牙周膜性愈合位點(diǎn)的數(shù)量，提示自體干細(xì)胞的移植可能會成為延遲再植脫位牙牙周損傷修復(fù)的新方向[7]。同時，我們還發(fā)現(xiàn)，經(jīng)BrdU標(biāo)記的外源性PDLSCs明顯參與了新生牙周膜組織中毛細(xì)血管管壁的形成，且干細(xì)胞植入組中毛細(xì)血管的數(shù)量多于對照組[7]。上述現(xiàn)象進(jìn)一步提示我們，PDLSCs的內(nèi)皮向分化及血管的形成可能是其促進(jìn)撕脫性損傷患牙牙周愈合的關(guān)鍵因素。

然而，為了得到PDLSCs內(nèi)皮向分化誘導(dǎo)液的理想配比，給后續(xù)基于其內(nèi)皮分化的一系列研究奠定基礎(chǔ)，本研究擬采用含有不同濃度血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)的內(nèi)皮向分化誘導(dǎo)液對人PDLSCs的分化效果進(jìn)行對比研究，以期篩選出適宜的誘導(dǎo)液和誘導(dǎo)時間，為PDLSCs應(yīng)用于牙周組織修復(fù)和再生提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)和理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要材料與儀器

1.1.1 主要材料 α-MEM(HyClone公司，美國)，2.5 g/L胰酶(HyClone公司，美國)，Ⅰ型膠原酶(Sigma公司，美國)，胎牛血清(杭州四季青公司)，青霉素 100 U/mL(Sigma，美國)，鏈霉素 100 U/mL(Sigma，美國)，MatrigelTM基質(zhì)膠(BD，美國)，血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子(VEGF165，Cyagen，美國)，堿性成纖維細(xì)胞生長因子(bFGF，Cyagen，美國)，胰島素樣生長因子(IGF-1，Cyagen，美國)，小鼠抗人血管性血友病因子(von Willebrand Factor, vWF)抗體(Abcam，美國)，兔抗人血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子受體2(vascular endothelial growth factor receptor-2, VEGFR-2)抗體(Abcam，美國)，兔抗人促血管生成素2(Angiopoietin 2, Ang2)抗體(Abcam，美國)，兔抗人血管內(nèi)皮生長因子A(VEGFA)抗體(Abcam，美國)，兔抗人IGF-1抗體(Abcam，美國)，cy3羊抗鼠IgG(Abcam，美國)，Alexa Fluor 488羊抗兔IgG(Abcam，美國)。

1.1.2 主要儀器 離心機(jī)(Kubota2100，日本)，超凈工作臺(YJ-87，蘇州凈化設(shè)備廠)，二氧化碳恒溫培養(yǎng)箱(ThermoForma，美國)，倒置相差顯微鏡(Olympus，日本)，照相系統(tǒng)(Canon 600D，日本)，細(xì)胞超聲破碎儀(Sun-ShineBio，中國)，Bio-Rad垂直電泳系統(tǒng)(Bio-Rad公司，美國)，激光共聚焦掃描顯微鏡(Olympus，日本)。

1.2 方法

1.2.1 PDLSCs的分離培養(yǎng) 選取完整拔除的健康成年人(20～30歲，性別不限)阻生智齒，立即置于4 ℃預(yù)冷的含雙抗(100 U/mL青霉素；100 U/mL鏈霉素)無菌PBS緩沖液中，轉(zhuǎn)移至實(shí)驗(yàn)室超凈工作臺內(nèi)。采用細(xì)滴管吸取無菌PBS緩沖液反復(fù)沖洗牙根表面，去除牙面污物及牙根表面多余血液。采用11#無菌刀片，輕輕刮除根中1/3區(qū)域牙周膜組織，將組織塊切割成大小約 1 mm3的組織塊，連同PBS一起轉(zhuǎn)移至離心管內(nèi)，以800 r/min的速度離心5 min，棄上清；加入2 mL Ⅰ型膠原酶，置于37 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)消化15 min；加入2～3 mL 含10% 胎牛血清(FBS)的α-MEM培養(yǎng)液終止消化反應(yīng)，以800 r/min的速度再次離心5 min，棄上清；加入2～3滴培養(yǎng)液，重懸組織塊后，將其平鋪于培養(yǎng)瓶，加入20 mL 15% FBS的α-MEM培養(yǎng)液，于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每3 d換液1次。待細(xì)胞從組織塊邊緣爬出并生長匯合達(dá)90%時，采用免疫磁珠法分選牙周膜干細(xì)胞，并用含15% FBS的α-MEM培養(yǎng)液培養(yǎng)，2 d換液1次，細(xì)胞生長至80%左右時按1∶2傳代培養(yǎng)。

1.2.2 PDLSCs內(nèi)皮向分化誘導(dǎo) 取生長狀態(tài)良好的P3 PDLSCs，經(jīng)2.5 g/L胰酶消化，以1×105個/孔的密度接種于6孔板，共接種12個6孔板。依照培養(yǎng)液的不同，將上述細(xì)胞分為4組，對照組(含10%FBS的α-MEM)、低濃度組(10 ng/mL VEGF + 10 ng/mL bFGF + 2 ng/mL IGF-1)、中濃度組(20 ng/mL VEGF + 10 ng/mL bFGF + 2 ng/mL IGF-1)及高濃度組(50 ng/mL VEGF + 10 ng/mL bFGF + 2 ng/mL IGF-1)，每組3個6孔板。將細(xì)胞置于37 ℃、5%CO2孵箱中培養(yǎng)，每3 d換液1次，誘導(dǎo)7、14 和21 d后分別進(jìn)行檢測。

1.2.3 內(nèi)皮向分化誘導(dǎo)的PDLSCs細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察 取出誘導(dǎo)14 d的對照組、低濃度組、中濃度組、高濃度組細(xì)胞，在倒置相差顯微鏡下進(jìn)行細(xì)胞形態(tài)觀察，并在不同倍率下拍照記錄。

1.2.4 內(nèi)皮向分化誘導(dǎo)的PDLSCs基質(zhì)膠管腔形成實(shí)驗(yàn) MatrigelTM膠4 ℃過夜凍融，低溫條件下將其置于預(yù)冷的24孔板內(nèi)，每孔200 μL。將24孔板轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)箱中孵育30 min，待膠體凝固。分別消化誘導(dǎo)7、14及21 d的各組細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度至2×105個/mL，將細(xì)胞懸液以每孔200 μL的量加入MatrigelTM基質(zhì)膠內(nèi)，37 ℃、5%CO2孵箱中培養(yǎng)。13 h后采用倒置顯微鏡觀察細(xì)胞管腔形成情況，每孔均選擇3個高倍視野進(jìn)行拍照。采用 Image J分析軟件測量血管樣結(jié)構(gòu)的管腔數(shù)及總管腔長度。

1.2.5 內(nèi)皮向分化誘導(dǎo)的PDLSCs免疫熒光染色 分別取誘導(dǎo)7 d 的4組細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度至2×104個/mL，分vWF和VEGFR-2兩組接種于共聚焦小皿中，4%多聚甲醛固定10 min，PBS洗3遍，每次5 min；在vWF組中加入200 μL 1% Triton X-100孵育10 min，PBS洗3遍，每次5 min；1%的BSA封閉液室溫封閉1 h后，棄BSA封閉液，PBS洗3遍，每次5 min；分別加小鼠抗人vWF一抗和兔抗人VEGFR-2一抗，放入濕盒中封閉3 h后，PBS洗3遍，每次5 min；分別加入cy3羊抗鼠IgG二抗和Alexa Fluor 488羊抗兔IgG二抗，避光封閉1 h后，PBS洗3遍，每次5 min；DAPI染核封片后，于激光共聚焦掃描顯微鏡下觀察。誘導(dǎo)14 d和21 d后的細(xì)胞也采用同樣方法進(jìn)行免疫熒光染色。

1.2.6 內(nèi)皮向分化誘導(dǎo)的PDLSCs Western blotting檢測 使用細(xì)胞裂解液裂解誘導(dǎo)7 d 的4組細(xì)胞，提取其總蛋白，在10% SDS-PAGE膠中電泳，將蛋白轉(zhuǎn)膜至PVDF膜上，5%脫脂奶粉封閉2 h后，分別加入VEGFR-2(1∶800)、Ang2(1∶5 000)、VEGFA(1∶3 000)、IGF-1(1∶3 000)、vimentin(1∶500)、GAPDH(1∶7 000)一抗，4 ℃過夜保存，第2天取出膜，PBST漂洗3遍，每次 5 min，分別加入羊抗鼠IgG和羊抗兔IgG二抗反應(yīng)，室溫?fù)u動孵育2 h，PBST漂洗，化學(xué)發(fā)光法(ECL)顯影，暗室曝光。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié) 果

2.1 PDLSCs形態(tài)學(xué)觀察

人牙周膜組織塊培養(yǎng)2～5 d后，可見形態(tài)呈長梭形的細(xì)胞自組織塊爬出，并快速增殖；培養(yǎng)10～12 d后，組織塊周圍可見大量細(xì)胞呈放射狀生長(圖1A)。采用免疫磁珠法分離培養(yǎng)，可以獲得呈克隆化生長的牙周膜干細(xì)胞(圖1B)，細(xì)胞呈長梭形單核細(xì)胞，胞體豐滿，胞質(zhì)均勻，核為卵圓形，大多聚集在胞質(zhì)中心，胞質(zhì)形成的突起向外呈放射狀，似成纖維樣細(xì)胞(圖1C)。

2.2 誘導(dǎo)后細(xì)胞形態(tài)觀察

加入不同濃度誘導(dǎo)液后，細(xì)胞形態(tài)逐漸發(fā)生變化，對照組細(xì)胞呈長梭形或多角形(圖2A)；低濃度VEGF組細(xì)胞變圓潤，呈短梭形，少量細(xì)胞呈扁圓形或圓形(圖2B)；中濃度VEGF組細(xì)胞大部分呈扁圓形或圓形，少量細(xì)胞呈短梭形(圖2C)；高濃度VEGF組細(xì)胞基本呈扁圓形或圓形，呈鋪路石樣排列(圖2D)。

圖1 牙周膜干細(xì)胞分離培養(yǎng)(倒置相差顯微鏡，A、B： ×100，C： ×1 000)Fig.1 Isolation and culture of periodontal ligament stem cells (inverted phase contrast microscope，A，B： ×100，C： ×1 000)

A：對照組；B：低濃度組；C：中濃度組；D：高濃度組

圖2 不同濃度內(nèi)皮向分化誘導(dǎo)液作用后牙周膜干細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變(倒置相差顯微鏡 ×100)

Fig.2 The morphological changes of periodontal ligament stem cells by induced fluid of endothelial differentiation of different concentrations (inverted phase contrast microscope ×100)

2.3 誘導(dǎo)后PDLSCs成血管能力檢測

誘導(dǎo)后的PDLSCs經(jīng)Matrigel膠體外三維立體培養(yǎng)13 h后，倒置顯微鏡下觀察可見：未經(jīng)誘導(dǎo)的對照組PDLSCs均不能形成完整的管腔樣結(jié)構(gòu)，細(xì)胞均呈散在分布；而經(jīng)內(nèi)皮向分化誘導(dǎo)的各組PDLSCs均可伸出突起并互相連接，形成類似血管的管腔樣結(jié)構(gòu)，其中，以高濃度VEGF組形成的管腔樣結(jié)構(gòu)最為典型，且誘導(dǎo)14 d及21 d組明顯優(yōu)于誘導(dǎo)7 d組(圖3A)。對典型視野下的圖片采用ImageJ軟件進(jìn)行分析，PDLSCs在Matrigel膠內(nèi)形成的管腔數(shù)目以及管腔長度均明顯增加(P<0.05)(圖3B)。

2.4 誘導(dǎo)后對PDLSCs vWF和VEGFR-2表達(dá)的影響

免疫熒光染色結(jié)果顯示，誘導(dǎo)7 d組中的誘導(dǎo)組細(xì)胞與未誘導(dǎo)的對照組細(xì)胞相比，誘導(dǎo)組細(xì)胞中內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)記物vWF和VEGFR-2的表達(dá)無顯著增強(qiáng)(圖4A)，誘導(dǎo)14 d和21 d組中的誘導(dǎo)組細(xì)胞較對照組細(xì)胞有顯著增強(qiáng)，且隨著誘導(dǎo)液濃度升高，強(qiáng)度逐漸遞增(圖4B、C)，因此可以得出，高濃度誘導(dǎo)液表達(dá)效果最好，且誘導(dǎo)14 d和21 d的效果較明顯(P<0.01)(圖4D)。

A：誘導(dǎo)后牙周膜干細(xì)胞；B：誘導(dǎo)后管腔數(shù)和總管腔長度分析；*：vs.對照組(7 d)P<0.05；#：vs.高濃度組P<0.05

圖3 不同濃度內(nèi)皮向分化誘導(dǎo)液作用后牙周膜干細(xì)胞體外成血管能力

Fig.3 The ability of periodontal ligament stem cells to form blood vesselsinvitroby induced fluid of endothelial differentiation of different concentrations

2.5 誘導(dǎo)后對PDLSCs內(nèi)皮細(xì)胞相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

在免疫印跡試驗(yàn)中，7 d 組中Ang2、VEGFR-2、VEGFA、IGF-1的誘導(dǎo)組都有所上調(diào)，vimentin逐漸下降(P<0.05)(圖5A)；14 d組中，VEGFR-2的誘導(dǎo)組都有明顯上調(diào)，Ang2和IGF-1的高濃度組有所上調(diào)，VEGFA無明顯上調(diào)，vimentin都有所下調(diào)(P<0.05)(圖5B)；21 d組中，Ang2、VEGFR-2、VEGFA、IGF-1的誘導(dǎo)組都有所上調(diào)，vimentin的誘導(dǎo)組都有所下調(diào)，且VEGFR-2和Ang2的高濃度組上調(diào)效果和vimentin的高濃度組下調(diào)效果較明顯(P<0.05)(圖5C)。

3 討 論

良好的血供是任何組織修復(fù)和再生的關(guān)鍵，同樣，牙周膜血管微循環(huán)的建立與運(yùn)行與牙周組織功能狀態(tài)密切相關(guān)[8-10]。對于牙周組織中所有微血管完全斷裂的脫位牙來說，牙周微循環(huán)的重建對牙周膜的愈合尤為重要，而誘導(dǎo)PDLSCs向內(nèi)皮細(xì)胞分化并外源性移植可能正是促進(jìn)牙周膜血運(yùn)重建而成為促脫位再植牙達(dá)到牙周膜性愈合的關(guān)鍵因素之一。

在血管發(fā)生過程中，最根本最重要的是血管內(nèi)皮細(xì)胞的存在，而外源性植入干細(xì)胞的血管內(nèi)皮向分化則是血管發(fā)生的一個重要步驟。有研究發(fā)現(xiàn)，VEGF是間充質(zhì)干細(xì)胞或造血干細(xì)胞向血管內(nèi)皮細(xì)胞分化的重要條件[11-12]，而VEGFR-2是內(nèi)皮細(xì)胞生長的早期表面受體，主要出現(xiàn)在內(nèi)皮細(xì)胞誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化的早期[13-15]，這也是內(nèi)皮向分化誘導(dǎo)的條件培養(yǎng)基中添加VEGF和bFGF的根本原因。研究發(fā)現(xiàn)，VEGF能特異性促內(nèi)皮細(xì)胞遷移、增殖及形成管腔樣結(jié)構(gòu)[16]， 而 bFGF對VEGF具有非特異性促增殖作用，與VEGF產(chǎn)生協(xié)同效應(yīng)，能夠促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分化為內(nèi)皮細(xì)胞和形成小管樣結(jié)構(gòu)，對體外誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞或胚胎干細(xì)胞分化為內(nèi)皮細(xì)胞具有重要的作用[17]。干細(xì)胞分化為內(nèi)皮細(xì)胞后，VEGF又可以誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)生血管新生，而這一過程是由 RhoA/ROCK信號通路參與介導(dǎo)的[18-19]，VEGF能迅速誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞中RhoA激活，RhoA從胞質(zhì)轉(zhuǎn)位到細(xì)胞膜上，緊隨RhoA激活之后，VEGFR-2的酪氨酸殘基磷酸化，血管新生增強(qiáng)[18,20]。

A：誘導(dǎo)后7 d；B：誘導(dǎo)后14 d；C：誘導(dǎo)后21 d；D：VEGFR-2和vWF的光密度值；*：vs. 對照組(7 d)P<0.01

圖4 不同濃度內(nèi)皮向分化誘導(dǎo)液作用后牙周膜干細(xì)胞免疫熒光染色

Fig.4 Immunofluorescence of periodontal ligament stem cells by induced fluid of endothelial differentiation of different concentrations

A：誘導(dǎo)后7 d；B：誘導(dǎo)后14 d；C：誘導(dǎo)后21 d；**：vs. 對照組P<0.05

圖5 不同濃度內(nèi)皮向分化誘導(dǎo)液作用后牙周膜干細(xì)胞蛋白表達(dá)

Fig.5 Protein expression of periodontal ligament stem cells by induced fluid of endothelial differentiation of different concentrations

因此，在本研究中，我們通過從離體牙中獲得牙周膜組織，并培養(yǎng)得到牙周膜細(xì)胞，進(jìn)一步分選獲得牙周膜干細(xì)胞培養(yǎng)傳代到第3代，用3種含不同濃度VEGF的內(nèi)皮向分化誘導(dǎo)液對PDLSCs進(jìn)行誘導(dǎo)，通過7、14、21 d的誘導(dǎo)后，分別對其進(jìn)行細(xì)胞形態(tài)學(xué)、體外成血管能力、免疫熒光染色和Western blotting的檢測，進(jìn)而觀察不同濃度VEGF對人牙周膜干細(xì)胞向內(nèi)皮細(xì)胞誘導(dǎo)分化的影響。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，從細(xì)胞形態(tài)學(xué)上觀察，可以看到在不同濃度誘導(dǎo)液的誘導(dǎo)下，牙周膜干細(xì)胞不同程度地向內(nèi)皮向分化，且高濃度誘導(dǎo)液的誘導(dǎo)效果相對較好；通過對誘導(dǎo)的牙周膜干細(xì)胞進(jìn)行血管形成實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)誘導(dǎo)組與未誘導(dǎo)組都有成血管效果，而高濃度組的效果最為顯著，并且誘導(dǎo)14和21 d的效果較好；誘導(dǎo)細(xì)胞進(jìn)行免疫熒光染色，7 d組內(nèi)皮細(xì)胞相關(guān)蛋白VEGFR-2和vWF沒有明顯變化，14 d組和21 d組都有所上調(diào)，高濃度組的表達(dá)效果最好；在免疫印跡實(shí)驗(yàn)中，Ang2、VEGFR-2、VEGFA、IGF-1 的誘導(dǎo)組都有所上調(diào)，vimentin的誘導(dǎo)組都有所下降，且高濃度組效果較顯著。根據(jù)上述結(jié)果，我們可以得出結(jié)論：高濃度組：50 ng/mL VEGF、10 ng/mL bFGF和2 ng/mL IGF-1的誘導(dǎo)液誘導(dǎo)效果明顯，且14和21 d的誘導(dǎo)效果較好，為通過牙周膜干細(xì)胞向內(nèi)皮細(xì)胞分化在延遲脫位再植牙牙周微循環(huán)重建中的應(yīng)用提供了理論依據(jù)。然而，牙周微循環(huán)重建是多因素影響的復(fù)雜生物過程，牙周膜干細(xì)胞向內(nèi)皮細(xì)胞誘導(dǎo)分化后移植入體內(nèi)并對牙周膜愈合的作用如何還有待進(jìn)一步的研究。