miR-150-5p在卵巢癌中的表達(dá)及其生物學(xué)功能研究

蔣小平 樊華 嚴(yán)建耀 朱紅玲

卵巢癌作為婦科常見腫瘤之一，其發(fā)病率和死亡率均較高，與其他腫瘤發(fā)病相似，卵巢癌發(fā)生發(fā)展與細(xì)胞侵襲、血管生成等密切相關(guān)[1]。研究報(bào)道[2]稱卵巢癌的發(fā)生發(fā)展與癌基因的異?；罨磉_(dá)有關(guān)。近期有學(xué)者[3]研究發(fā)現(xiàn)，微小RNA(miRNA)能夠調(diào)控相關(guān)癌基因，作為非編碼的小分子RNA，miR-150-5p由22個(gè)核苷酸構(gòu)成，有研究[4]已經(jīng)證實(shí)其能夠通過某種特定通路參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展。磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K)/蛋白激酶B(protein kinase B，Akt)在多種腫瘤中處于激活狀態(tài)，參與腫瘤細(xì)胞的增殖和凋亡過程。研究報(bào)道[5]，抑制PI3K/Akt能夠明顯降低癌細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移能力，而miR-150-5p是否能夠基于PI3K/Akt信號通路來對卵巢癌細(xì)胞增殖凋亡的機(jī)制進(jìn)行調(diào)控尚未有研究報(bào)道。因此，本研究通過干擾miR-150-5p的表達(dá)，研究其對卵巢癌增殖、凋亡和PI3K/Akt信號通路影響，以期為臨床治療卵巢癌提供新的靶點(diǎn)。

材料和方法

一、臨床標(biāo)本及資料

選取2016年4月—2018年12月于本院婦科就診的82例卵巢癌患者作為研究對象，患者年齡22～65周歲，平均(43.5±6.8)歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)經(jīng)病理學(xué)檢測確診為卵巢癌的患者；(2)納入患者均為初次診斷；(3)在本院經(jīng)手術(shù)切除卵巢癌組織標(biāo)本。排除標(biāo)準(zhǔn)：術(shù)前接受過放化療治療。手術(shù)將患者病變組織切除后，立即在距離腫瘤2 cm位置處切下0.6 cm大小的正常卵巢組織，同時(shí)留取同樣大小的癌組織樣本，快速放入冷存管液氮保存，樣本留取過程中注意交叉污染。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)本院倫理委員會批準(zhǔn)，所有參與研究患者均簽署知情同意書。

二、方法

1.細(xì)胞來源和培養(yǎng)：人卵巢癌SKOV3細(xì)胞株由本實(shí)驗(yàn)室液氮冷凍保存。SKOV3細(xì)胞株經(jīng)取出后，37℃水浴溶解，加入含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，離心去上清，加入細(xì)胞培養(yǎng)液懸浮細(xì)胞，接種于培養(yǎng)瓶中，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)，融合度到80%時(shí)，用0.25%的胰蛋白酶消化，采用完全培養(yǎng)基傳代。傳代次數(shù)一致且細(xì)胞處于對數(shù)期，用于后續(xù)研究。

2.試劑和儀器：胎牛血清、胰蛋白酶、DMEM培養(yǎng)基均購自美國Gibco公司，miR-150-5p inhibitors(抑制劑)和陰性對照質(zhì)粒由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司代為合成，Lipofectamine2000購自美國Invitrogen公司，兔抗人cleaved caspase3、PI3K、Akt和p-Akt多克隆抗體、辣根過氧化物標(biāo)記的羊抗兔IgG采購自美國Abcam公司，MTT試劑盒、BCA蛋白濃度檢測試劑盒采購自上海經(jīng)科化學(xué)科技有限公司，細(xì)胞培養(yǎng)箱和分光光度計(jì)購自上海三騰儀器有限公司。

3.qRT-PCR檢測：采用TRIzol試劑提取總RNA，按照PrimeScrip反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄成cDNA，采用SYBR Premix Ex Taq說明書配置PCR反應(yīng)體系，反應(yīng)條件為95 ℃預(yù)變性10 min，然后95 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 10 s，40 個(gè)循環(huán)；95 ℃ 5 s，60 ℃ 1 min，95 ℃ 30 s。U6作為內(nèi)參(上游引物為 5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，下游引物為 5′AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′)，miR-150-5p(上游引物為 5′-ACTGTCTCCCAACCCTTGTA-3′，下游引物為5′-GTGCAGGGTCCGAGGT-3′)相對表達(dá)量用2-△△CT表示。

4.細(xì)胞轉(zhuǎn)染：調(diào)整卵巢癌SKOV3細(xì)胞株濃度至1×106個(gè)/毫升，取2 ml接種于6孔板中，培養(yǎng)過夜，采用Lipofectamine 2000將濃度均為100 nmol/L的miR-150-5p 抑制劑和陰性對照分別轉(zhuǎn)染至SKOV3細(xì)胞。以人卵巢癌SKOV3細(xì)胞株作為空白對照組，轉(zhuǎn)染miR-150-5p抑制劑的人卵巢癌SKOV3細(xì)胞株作為miR-150-5p抑制劑組，轉(zhuǎn)染陰性對照質(zhì)粒的人卵巢癌SKOV3細(xì)胞株作為陰性對照組。

5.MTT法檢測：轉(zhuǎn)染48 h后，調(diào)整卵巢癌SKOV3細(xì)胞株濃度至3×104個(gè)/毫升接種于96孔板中，每孔加入200 μl的細(xì)胞懸液，置入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，條件為37 ℃、5%CO2，于24 h、48 h和72 h，加入MTT試劑10 μl，37 ℃孕育4 h，檢測490 nm處OD值。細(xì)胞增殖率=轉(zhuǎn)染組OD/空白組OD×100%。

6.流式細(xì)胞術(shù)檢測：轉(zhuǎn)染48 h后，PBS洗滌，加入300 μl的緩沖液懸浮細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106個(gè)/毫升，取100 μl置于流式管中，加入Annexin V-FITC及PI各5 μl，混勻室溫孕育15 min，加入400 μl PBS，上機(jī)檢測細(xì)胞凋亡情況。

7.生物信息學(xué)預(yù)測和熒光素酶報(bào)告基因分析：通過Targetscan(http://ww w.targetscan.org/)預(yù)測miRNA-150-5p與PI3K的靶向結(jié)合情況。采用 PCR從大鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞基因組 DNA中擴(kuò)增 PI3K的 3′-非翻譯區(qū)(3′-untranslated region，3′-UTR)序列，構(gòu)建至熒光素酶報(bào)告基因載體 pGL3(pGL3-PI3K-WT)中，同時(shí)構(gòu)建突變型重組質(zhì)粒(pGL3-PI3K-MUT)，將HEK293T 細(xì)胞按30%左右密度鋪25孔板，將miRNA-150-5p mimic及mimic control分別與空載質(zhì)粒及上述質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染至HEK293T 細(xì)胞。轉(zhuǎn)染后24 h，根據(jù)雙熒光素酶測定試劑盒說明書檢測熒光素酶活性，螢火蟲熒光素酶/海腎熒光素酶活性值即為報(bào)告基因活性。

8.Western blotting檢測：取轉(zhuǎn)染48 h的SKOV3細(xì)胞，加入RIPA裂解液，裂解30 min，12 000/min 4 ℃離心10 min，收集上清，BCA試劑盒檢測蛋白濃度，將蛋白樣品和Loading buffer混合，100 ℃水域變性5 min，然后加入至制備好的SDS-PAGE凝膠(5%濃縮膠，10%分離膠)上樣孔中，每孔25 μl，濃縮膠時(shí)調(diào)整電壓為60 V，分離膠電壓為120 V，結(jié)束后取出凝膠，4℃轉(zhuǎn)膜1.5 h，采用5%脫脂奶粉封閉PVDF膜2 h，加入Cleaved caspase-3、PI3K(P110亞基)、Akt、p-Akt一抗，4℃過夜，TBST洗膜后加入辣根過氧化物標(biāo)記的羊抗兔IgG，37℃孕育2 h后加入ECL顯影，以GAPDH作為內(nèi)參。

9.統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：應(yīng)用SPSS16.0版軟件處理數(shù)據(jù)。多組間比較采用單因素分析，兩兩比較用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、miR-150-5p在卵巢癌組織和癌旁正常組織中的表達(dá)

82例卵巢癌患者癌組織和癌旁正常組織中miR-150-5p的相對表達(dá)分別為(1.64±0.10)和(0.99±0.08)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見圖1。

2、轉(zhuǎn)染后miR-150-5p在卵巢癌SKOV3細(xì)胞株中的表達(dá)

空白對照組和陰性對照組miR-150-5p的相對表達(dá)量分別為(0.97±0.06)和(1.01±0.08)，組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；miR-150-5p抑制劑組為(0.11±0.03)，明顯低于空白對照組和陰性對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見圖2。

三、轉(zhuǎn)染miR-150-5p抑制劑對卵巢癌SKOV3細(xì)胞株增殖能力的影響

空白對照組和陰性對照組24 h、48 h和72 h細(xì)胞增殖率的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；miR-150-5p抑制劑組24 h、48 h、72 h細(xì)胞增殖率分別為(9.61±1.32)%、(24.54±3.61)%和(33.78±3.72)%，同一時(shí)間點(diǎn)均明顯低于空白對照組和陰性對照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見圖3。

四、轉(zhuǎn)染miR-150-5p抑制劑對卵巢癌SKOV3細(xì)胞株凋亡的影響

空白對照組和陰性對照組細(xì)胞凋亡率分別為(0.74±0.10)%和(1.79±0.21)%，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；而miR-150-5p抑制劑組細(xì)胞凋亡率為(16.65±2.93)%，明顯高于空白對照組和陰性對照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見圖4。

圖1 miR-150-5p在卵巢癌組織和癌旁正常組織中的表達(dá)

Compared with blank control group, *P<0.05;compared with negative control group, #P<0.05

A:flow detection record chart; B:apoptosis rate in different groups

五、PI3K與miRNA-150-5p的作用關(guān)系

雙熒光素酶報(bào)告基因結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染miRNA-150-5p后，野生型PI3K的熒光素酶活性被抑制(t=21.354，P=0.000)，突變型PI3K的熒光素酶活性無明顯變化(t=0.323，P=0.684)，說明PI3K與miRNA-150-5P具有靶向調(diào)控關(guān)系，見圖5。

六、轉(zhuǎn)染miR-150-5p抑制劑對PI3K、Akt、p-Akt和Cleaved caspase-3蛋白表達(dá)的影響

各組細(xì)胞轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)48 h，空白對照組和陰性對照組PI3K、p-Akt以及Cleaved caspase-3蛋白表達(dá)的差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；miR-150-5p抑制劑組PI3K、p-Akt蛋白表達(dá)顯著低于空白對照組和陰性對照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；Cleaved caspase-3蛋白明顯高于空白對照組和陰性對照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；而三組間Akt蛋白表達(dá)的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見圖6。

圖5 雙熒光素酶報(bào)告基因檢測結(jié)果

A:western blotting detection electrophoresis map; B:relative expression of each protein

討 論

卵巢癌發(fā)病機(jī)制較為復(fù)雜，但與其他惡性腫瘤相似，其發(fā)生發(fā)展與致癌基因、抑癌基因的表達(dá)密切相關(guān)[6]。miRNA作為單鏈非編碼RNA，長度在21～25 nt，研究報(bào)道[7]稱其能夠和靶基因的3′UTR結(jié)合，從而調(diào)節(jié)靶基因的表達(dá)或者降解[7-8]。miR-150-5p作為miRNA中的一員，位于人類染色體19q13.33。國外有學(xué)者[9]研究發(fā)現(xiàn)，肺癌細(xì)胞中miR-150-5p異常高表達(dá)，且其能夠下調(diào)p53表達(dá)，從而影響細(xì)胞表型。還有學(xué)者[10]發(fā)現(xiàn)，胃癌組織和細(xì)胞株中miR-150-5p均處于高表達(dá)狀態(tài)。Inoue等[11]學(xué)者通過QPCR檢測胃癌組織中miR-150-5p的表達(dá)，結(jié)果顯示其在胃癌中異常高表達(dá)。

RNA干擾主要是通過雙鏈DNA將特定基因進(jìn)行沉默，其具有毒性小，抑制率高的特點(diǎn)，目前主要用來研究功能基因生物學(xué)特性。有學(xué)者[12]采用RNA干擾技術(shù)下調(diào)鼻咽癌細(xì)胞中miR-150-5p表達(dá)，結(jié)果癌細(xì)胞的侵襲能力也明顯下降。還有學(xué)者[13]在多發(fā)性骨髓瘤中采用RNA干擾技術(shù)沉默miR-150-5p的表達(dá)，結(jié)果顯示細(xì)胞凋亡增強(qiáng)，增殖能力減弱。本研究也采用小分子RNA干擾miR-150-5p在卵巢癌細(xì)胞株SKOV3中的表達(dá)，結(jié)果顯示，miR-150-5p抑制劑組24 h、48 h和72 h細(xì)胞增殖率均明顯低于空白對照組和陰性對照組。轉(zhuǎn)染48 h，miR-150-5p抑制劑組細(xì)胞凋亡率明顯高于空白對照組和陰性對照組，提示miR-150-5p在卵巢癌的發(fā)生、發(fā)展過程中可能扮演促癌基因的角色。

文獻(xiàn)報(bào)道[14]稱miRNA主要是通過與靶蛋白結(jié)合來發(fā)揮生物功能，本研究首先采用生物信息學(xué)TargerScan數(shù)據(jù)庫檢索顯示miR-150-5p與PI3K存在靶向結(jié)合位點(diǎn)，雙熒光素酶報(bào)告基因結(jié)果也顯示二者存在靶向調(diào)控關(guān)系。國內(nèi)有學(xué)者[15]在結(jié)腸癌細(xì)胞中研究發(fā)現(xiàn)，沉默biaoda miR-150-5p，PI3K表達(dá)水平也明顯降低，結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡能力增強(qiáng)。本研究結(jié)果也顯示抑制卵巢癌細(xì)胞SKOV3中miR-150-5p的表達(dá)后，PI3K表達(dá)量明顯下調(diào)，細(xì)胞增殖能力下降，凋亡能力增強(qiáng)。

PI3K/Akt作為經(jīng)典的信號通路，在細(xì)胞遷移、分化和凋亡過程中起著重要作用[16]。研究報(bào)道稱PI3K能夠通過PDK1促使Akt發(fā)生磷酸化，進(jìn)而上調(diào)caspase表達(dá)，而caspase可將自身底物水解傳遞至凋亡通路，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞出現(xiàn)程序性死亡，Cleaved caspase 3 作為caspases 級聯(lián)反應(yīng)中關(guān)鍵蛋白，在凋亡過程中扮演著極其重要角色[17]。有學(xué)者[18]發(fā)現(xiàn)，肺癌細(xì)胞中Cleaved caspase 3表達(dá)明顯下降，而加入了 PI3K/Akt信號通路抑制劑LY294002干預(yù)之后，Cleaved caspase 3蛋白水平明顯升高，細(xì)胞凋亡率顯著提高。本研究采用蛋白免疫印跡法檢測 PI3K/Akt/caspase 3關(guān)鍵蛋白表達(dá)，結(jié)果顯示miR-150-5p 抑制劑組SKOV3細(xì)胞中Akt的磷酸化程度明顯下降，Cleaved caspase 3蛋白表達(dá)明顯升高，提示miRNA-150-5p調(diào)卵巢癌增殖、凋亡可能是通過調(diào)節(jié)PI3K/Akt/Cleaved caspase 3 信號通路實(shí)現(xiàn)的。

綜上所述,miR-150-5p在卵巢癌中作促癌基因，其調(diào)控作用可能與PI3K/Akt信號通路有關(guān)。