超高壓-超聲波協同法提取藜麥β-葡聚糖的工藝研究

王 沖 鄒佳文 陳虹均 陳祥貴,2 黃玉坤,2

(西華大學食品與生物工程學院1，成都 610039)

(食品非熱加工重點實驗室；食品非熱加工工程技術研究中心；宜賓西華大學研究院2，宜賓 644004)

藜麥原產于南美洲，具有突出的保健作用與豐富的營養(yǎng)價值[1,2]，有“糧食之母”的美譽[3]。藜麥在甘肅、山西、青海、內蒙古等18個省、市、自治區(qū)都有廣泛的種植[4]，我國藜麥產業(yè)發(fā)展起步較晚，因此在藜麥的生產、加工、產品研發(fā)等方面一直滯留在基礎技術研究的層面[5]。梁軍林等[6]研究發(fā)現藜麥中含有較多的β-葡聚糖。β-葡聚糖具有抗氧化、抑菌、降三高、增強免疫力等多種生理功能，在醫(yī)藥、化妝品以及食品產業(yè)中應用廣泛[7,8]。雖然目前已有關于藜麥中黃酮類、多酚、皂苷、等生理活性物質的功能和提取條件的研究[9]，但對藜麥β-葡聚糖提取的研究還鮮有報道。目前，植物中β-葡聚糖的提取方法主要有水提法[10]、酸提法和堿提法[11,12]、酶提法[13]、凍融法[14]等。這些方法都存在不同程度的缺陷，如酸提法易造成藜麥中淀粉過度水解，從而使葡萄糖混入β-葡聚糖產品中，造成產品純度偏低；堿法具有較好的提取效果，但通常需要耗費大量時間[15,16]。

近年來，由于超高壓提取方法有助于縮減時間、提高提取效率，因此逐漸應用于食品中活性成分的提取。王謙等[17]利用超高壓提取青稞β-葡聚糖，顯著提高了β-葡聚糖的提取效率。超聲波提取法在提取率高、省時節(jié)能的同時，還能保護產品的持水性和持油性，近年來已成功用于提取燕麥β-葡聚糖[18]。通過多種提取方法的結合，游茂蘭等[19]提出了超聲-微波協同法提取青稞中的β-葡聚糖，與水提法、超聲法和微波法相比，β-葡聚糖得率分別提高了120.19%、57.93%、18.65%，展現了協同提取的較好效果。本研究利用超高壓與超聲波提取時間短、效率高的優(yōu)點，建立了對藜麥中β-葡聚糖進行提取的超高壓-超聲波協同法。通過單因素及正交實驗探究超高壓-超聲協同法提取藜麥β-葡聚糖的工藝條件，并與單一提取方法進行比較，確定藜麥β-葡聚糖提取的最佳方法，為藜麥資源開發(fā)利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

高原藜麥、β-葡聚糖標準品(≥95%，HPLC級)、耐高溫α-淀粉酶(2 120 IU/g)、剛果紅(≥98%，HPLC級)、胰蛋白酶(1∶250)，其他化學試劑均為國產分析純。實驗所用水符合GB/T 6682—2008《分析實驗室用水規(guī)格和實驗方法》的要求。

1.2 儀器與設備

UV-2800型紫外可見光光度計；SCIENTZ-ⅡD超聲波細胞粉碎機；HPP600/5L超高壓食品處理設備；RE-52AA 旋轉蒸發(fā)儀。

1.3 方法

1.3.1 超高壓-超聲波協同提取藜麥β-葡聚糖

稱取粉碎后的藜麥粉若干，按一定比例添加蒸餾水后混勻。調節(jié)pH10，進行功率300 W、15 min的超聲波處理后裝入雙層高壓袋中，封口后在超高壓裝置內以300 MPa處理4 min。離心(6 000 r/min、20 min)得到上清液，濾渣再重復處理1次。將2次上清液合并后調pH至6.0，以4 U/mL加入耐高溫α-淀粉酶，95 ℃、30 min除去酶解淀粉。在溶液冷至室溫后調其pH為8.0，以1∶50的體積比添加1%胰蛋白酶溶液在37 ℃、30 min處理后以90 ℃、10 min滅酶。溶液冷卻后調pH至4.5，4 ℃靜置12 h，離心(6 000 r/min、20 min)取上清液。加入上清液3倍體積的95%乙醇，4 ℃靜置12 h后收集沉淀，冷凍干燥得到β-葡聚糖粗提物。

1.3.2 β-葡聚糖含量測定及得率計算

相較于酶聯免疫試劑盒和苯胺藍熒光檢測法，剛果紅法測定β-葡聚糖操作簡單、較易實現[20]。實驗選擇剛果紅分光光度法[21]測定β-葡聚糖含量，將凍干的β-葡聚糖復溶于蒸餾水中，稀釋到一定倍數n后測定其吸光度。由標準曲線計算出樣液中β-葡聚糖含量，并按式(1)計算β-葡聚糖得率：

(1)

式中：m為測定的藜麥中β-葡聚糖的質量/g；M為藜麥質量/g。

1.3.3 單因素實驗

選擇超聲波功率、超聲波時間、超高壓壓力、超高壓時間、提取液pH、料液比為影響因素，研究各因素對實驗結果的影響。

1.3.3.1 超聲波功率對得率的影響

以超聲時間15 min，超高壓壓力300 MPa，超高壓時間4 min，料液比1∶15，pH10，研究超聲波功率分別為200、300、400、500 W時對藜麥β-葡聚糖得率的影響。

1.3.3.2 超聲時間對得率的影響

以超聲波功率300 W，超高壓壓力300 MPa，超高壓時間4 min，料液比1∶15，pH10，研究超聲時間為9、12、15、18、21 min時對藜麥β-葡聚糖得率的影響。

1.3.3.3 超高壓壓力對得率的影響

以超聲波功率300 W，超聲時間15 min，超高壓時間4 min，料液比1∶15，pH10，研究超高壓壓力為200、250、300、350、400 MPa時對藜麥β-葡聚糖得率的影響。

1.3.3.4 超高壓時間對得率的影響

以超聲波功率300 W，超聲時間15 min，超高壓壓力300 MPa，料液比1∶ 15，pH10，研究超高壓時間為3.0、3.5、4.0、4.5、5.0 min時對藜麥β-葡聚糖得率的影響。

1.3.3.5 料液比對得率的影響

以超聲波功率300 W，超聲時間15 min，超高壓壓力300 MPa，超高壓時間4 min，pH10，研究料液比為1∶12、1∶15、1∶18、1∶21、1∶24時對藜麥β-葡聚糖得率的影響。

1.3.3.6 pH對得率的影響

以超聲波功率300 W，超聲時間15 min，超高壓壓力300 MPa，超高壓時間4 min，料液比1∶15，研究pH為8、9、10、11、12時對藜麥β-葡聚糖得率的影響。

1.3.4 正交實驗

在單因素實驗的基礎上，選擇4個影響較大的因素并各取3個水平，采用L9(34)正交實驗對β-葡聚糖的提取工藝進行優(yōu)化，實驗因素與水平見表1。

表1 超聲波-超高壓協同法因素水平表

1.4 不同提取方法對比實驗

分別采用水提法[料液比1∶15(g/mL)、提取溫度60 ℃、提取時間1.5 h、pH 10]、超聲法(超聲功率300 W、超聲時間15 min)、超高壓法(超高壓壓力300 MPa、超高壓時間4 min)和本研究中的超聲波-超高壓協同法提取藜麥β-葡聚糖，比較不同方法間的提取效果，其中超高壓和超聲波的提取條件選擇正交優(yōu)化的結果。

2 結果與分析

2.1 β-葡聚糖含量的標準曲線

以β-葡聚糖含量20、40、60、80、100 μg為橫坐標，吸光度值為縱坐標，繪制標準曲線，結果如圖1所示。吸光度與β-葡聚糖含量的相關性方程為y=0.025x+0.078，相關系數為0.997 6，表現出良好的相關性。

圖1 β-葡聚糖測定標準曲線

2.2 單因素實驗結果分析

圖2顯示了各個因素對β-葡聚糖得率的影響。超聲時間12 min時得率顯著高于其他超聲時間時的得率，超聲時間大于12 min后得率明顯下降。在一定的超聲時間內，超聲時間的延長使得溶液的振動時間延長，有利于β-葡聚糖的溶出；但超聲時間過長會增大超聲波作用強度，使β-葡聚糖的降解程度加大，導致β-葡聚糖得率下降[22]。因此，超聲時間考慮為12 min。

在超聲功率為200～300 W時，β-葡聚糖的得率隨著功率的增大而增大，在功率大于300 W后，得率逐漸下降。由于超聲功率較小時，超聲波的空化作用隨著功率的加大而增強，有利于原料組織破碎。超聲功率的增加加速了溶液的水循環(huán)，使得β-葡聚糖更容易溶出和擴散到溶液中。當超聲波功率過大時，藜麥中非糖類雜質溶出和β-葡聚糖的降解程度變大，使其得率降低[23]。當超聲功率為300 W時β-葡聚糖的得率顯著高于其他實驗組，因此，超聲波提取時功率選取300 W。

在超高壓時間為4 min后繼續(xù)超高壓處理，β-葡聚糖得率無顯著變化。這可能由于4 min 后細胞已基本破裂[24]。因此，加壓時間選擇4 min。在壓力小于300 MPa時，β-葡聚糖得率隨壓力增加而顯著增加，而達到300 MPa后繼續(xù)增加壓力，β-葡聚糖得率無顯著變化。一定的超高壓壓力使細胞發(fā)生破裂，溶劑溶出 β-葡聚糖，300 MPa后細胞破裂完全，更高的壓力對提取影響不大且增加耗能[19]。因此，選擇300 MPa的壓力。

β-葡聚糖是一種可溶于弱酸性和弱堿性溶液中的可溶性纖維，在不同pH溶液中 β-葡聚糖的溶解度不同。β-葡聚糖得率在pH10時達到最大值，呈現明顯的先增后減趨勢。由于β-葡聚糖本身具有堿溶性，堿性較強時有利于其從細胞中溶出，提高提取率；但β-葡聚糖在強堿性條件下發(fā)生糖苷鍵的斷裂，并且溶液中雜質的增多增加了溶液黏度，使β-葡聚糖溶出受阻[18]，降低了β-葡聚糖得率。因此，選擇提取的pH為10。

在料液比1∶12～1∶18之間增加溶劑用量可顯著提高β-葡聚糖得率。料液比達到1∶18后，增加溶劑用量，β-葡聚糖得率變化不顯著。增大溶劑量有利于溶質的析出和擴散，當溶質的析出達到一個動態(tài)平衡后，繼續(xù)通過加大溶劑的量來提高溶質的析出量的意義不大[19]。因此，采用1∶18的料液比。

注：同一曲線不同小寫字母表示各處理組間差異顯著(P<0.05)。

圖2各單因素對得率的影響

2.3 超聲波—超高壓協同法正交實驗結果分析

從表2可以看出，影響藜麥中β-葡聚糖得率的主次順序為超聲功率(A)>超高壓壓力(C)>超高壓時間(D)>超聲時間(B)，且可確定提取藜麥中β-葡聚糖工藝的最佳參數為A2B3C2D1，即超聲功率為300 W，超聲時間為15 min，超高壓壓力為300 MPa，超高壓時間4 min，根據此參數得出的β-葡聚糖得率為1.66%。

2.4 不同提取方法的效果比較

超高壓-超聲波協同法、水提法、超聲法和超高壓法提取β-葡聚糖的得率分別為1.66%、0.64%、1.16%、1.34%，超高壓-超聲波協同法得率較后三者分別提高了159.38%、43.10%、23.88%。如圖3所示，超高壓-超聲波協同法顯著提高了β-葡聚糖的得率(P<0.05)。

表2 協同法正交實驗結果及分析

注：相同字母表示差異不顯著，不同小寫字母表示各處理組間差異顯著(P<0.05)，不同大寫字母表示各處理組間差異極顯著(P<0.01)。

圖3不同提取方法的效果比較

3 結論

在利用堿性溶劑提取葡聚糖的同時，結合超高壓與超聲波時間短、效率高的優(yōu)點對藜麥中的β-葡聚糖進行提取。超高壓-超聲波協同法提取β-葡聚糖的最佳工藝條件為：超聲功率300 W，超聲時間15 min，超高壓壓力300 MPa，超高壓時間4 min，水提pH10，水提料液比1∶18。在最優(yōu)條件下，得出超高壓-超聲波協同法的提取率為1.66%，與水提法、超聲法、超高壓法相比，提取率分別提高了159.38%、43.10%、23.88%，超高壓-超聲波協同法提取β-葡聚糖得率顯著提高。由此可見，超高壓-超聲波協同法在藜麥β-葡聚糖的提取應用中具有較大潛力。