白花丹醌對(duì)大鼠肝細(xì)胞肝癌自噬活性的影響并機(jī)制初探

陳 懿,李 雪,陳金霞,林文雅,張友才

陳懿,李雪,陳金霞,林文雅,張友才,溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院感染內(nèi)科 浙江省溫州市 325000

0 引言

肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)惡性程度高,發(fā)展迅速,且易于復(fù)發(fā).手術(shù)難以切除或失去根治機(jī)會(huì),對(duì)化療藥物不敏感,經(jīng)導(dǎo)管動(dòng)脈化療栓塞術(shù)等可能會(huì)加重癌腫組織缺血、缺氧,改變腫瘤細(xì)胞內(nèi)基因轉(zhuǎn)錄活性,啟動(dòng)應(yīng)激反應(yīng),誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞逃逸凋亡,是嚴(yán)重危害人類(lèi)生命健康的重大疾病之一.

PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路在細(xì)胞適應(yīng)生理?xiàng)l件和環(huán)境壓力過(guò)程中,發(fā)揮極其重要的負(fù)向調(diào)節(jié)作用,是自噬啟動(dòng)階段的關(guān)鍵分子之一,同時(shí)參與腫瘤細(xì)胞遷移、黏附、細(xì)胞基質(zhì)的降解[1,2].白花丹醌是天然的植物化學(xué)物質(zhì),具有抗菌、抗氧化、抗肝損傷以及逆轉(zhuǎn)肝纖維化的作用[3-5].有報(bào)道稱(chēng)白花丹醌可能通過(guò)PI3K/AKT信號(hào)傳導(dǎo)途徑,影響腫瘤細(xì)胞自噬活性,具有抗腫瘤作用[6,7].但其對(duì)肝細(xì)胞癌的發(fā)生和進(jìn)展的影響目前仍未見(jiàn)報(bào)道.本研究擬借助黃曲霉毒素B1 (aflatoxin B1,AFB1)誘導(dǎo)型大鼠HCC模型,研究中藥白花丹醌對(duì)大鼠早期HCC細(xì)胞自噬活性的影響,并探討其抗肝細(xì)胞癌機(jī)制是否與PI3K/AKT信號(hào)通路相關(guān).

1 材料和方法

1.1 材料 4周齡清潔級(jí)近交系雄性Wistar大鼠,體重60-80 g,由中國(guó)科學(xué)院上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供.AFB1為美國(guó)Sigma公司產(chǎn)品(批號(hào)A6636),白花丹醌購(gòu)自美國(guó)Sigma公司,二甲基亞砜(DMSO)和2-乙酰氨基芴(2-AAF)購(gòu)于廣州偉伯化工有限公司(編號(hào)226388、304-28-9),2-AFF飼料為將基本飼料粉碎后,按150 g/1000 g比例充分混合而成.總RNA提取(TaKaRa RNAiso Plus)、cDNA合成及RT-PCR擴(kuò)增試劑盒(TaKaRa RNA PCR Kit 3.0)均為大連寶生物工程有限公司產(chǎn)品.Akt抗體購(gòu)自上海雷浩信息科技有限公司; 磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)一抗購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司; 二抗、二氨基聯(lián)苯胺(DAB)購(gòu)自北京中衫金橋生物技術(shù)有限公司.兔抗LC3B抗體(北京華夏遠(yuǎn)洋科技有限公司,產(chǎn)品編號(hào)：AL221).二喹啉甲酸(BCA)購(gòu)自上海潤(rùn)成生物科技有限公司.

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物模型的建立： 55只雄性Wistar大鼠按清潔級(jí)動(dòng)物要求養(yǎng)在溫州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心,溫度控制在24℃±1 ℃,相對(duì)濕度45%-70%.基本飼料安靜飼養(yǎng)1 wk后分成對(duì)照組,AFB1誘癌模型組、2 mg/kg白花丹醌處理組和3 mg/kg白花丹醌處理組; 對(duì)照組10只,其他每組15只.對(duì)照組給予0.9%氯化納溶液 2 mL/Kg腹腔注射,其他組大鼠腹腔注射AFB1 (400 μg/kg,AFB1用15 mL DMSO溶劑混勻),每周6次,持續(xù)2 wk; 2-AFF飼料喂養(yǎng)2 wk后,重復(fù)上述制作過(guò)程(13 wk后用基本飼料喂養(yǎng)),于37周時(shí)停藥[8].白花丹醌處理組大鼠在應(yīng)用AFB1基礎(chǔ)上,于第6周起腹腔注射白花丹醌,每周2次.于實(shí)驗(yàn)第37周斷頸處死所有大鼠.模型制作過(guò)程中任大鼠自由飲水、進(jìn)食.

1.2.2 透射電鏡組織超微病理觀察： 將所取新鮮肝組織切成1 mm3大小,用2.5%戊二醛固定,PBS 漂洗后,1%鋨酸固定,制成2 μm超薄切片,用醋酸雙氧鈾、枸椽酸鉛雙重染色,HITACHI日本H-7500型透射電鏡觀察.

1.2.3 AKT1mRNA表達(dá)(RT-PCR)： 用RNAiso Plus試劑提取總R N A,紫外分光光度計(jì)測(cè)吸光度(A)值,以A260/A280=1.8-2.0為RNA質(zhì)量判斷標(biāo)準(zhǔn).按試劑盒說(shuō)明書(shū)要求合成cDNA.AKT1上游引物： 5’-CCACAGGTCGCTACTATGCC-3’,下游引物： 5’-GTCCAGGGCGGACACAATCT-3’; GAPDH上游引物5’-TTCAACGGCACAGTCAAGG-3’,下游引物5’-CACCAGTGGATGCAGGGAT-3’; 產(chǎn)物長(zhǎng)度分別為275 bp、477 bp.反應(yīng)條件： 94 ℃預(yù)變性5 min后,95 ℃ 30 s,52℃ 30 s,72 ℃ 45 s,循環(huán)30次后,72 ℃延伸5 min.取PCR反應(yīng)產(chǎn)物5 μL,用2%瓊脂糖凝膠電泳分離后,在凝膠成像系統(tǒng)(Biosens Sc 810)分析結(jié)果.

1.2.4 AKT1免疫組織化學(xué)染色： 按過(guò)氧化物酶標(biāo)記鏈霉親和素法試劑盒說(shuō)明書(shū)操作.60 ℃烤片1 h,二甲苯、乙醇脫蠟至水,3%過(guò)氧化氫溶液 37 ℃溫育阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶,0.01%枸櫞酸緩沖液高壓修復(fù),自然冷卻后滴加AKT1一抗(1：50稀釋),4 ℃溫育過(guò)夜; 滴加二抗及鏈霉親和素-過(guò)氧化物酶,DAB顯色,蘇木精復(fù)染,脫水、封片.用PBS代替一抗作陰性對(duì)照.

1.2.5 Western Blot檢測(cè)肝組織中LC3BⅠ、LC3BⅡ蛋白： 自噬形成時(shí),胞漿型LC3(即LC3-I)會(huì)酶解掉一小段多肽,轉(zhuǎn)變?yōu)?自噬體)膜型(即LC3-II),因此,LC3-II/I比值的大小可估計(jì)自噬水平的高低.取-80 ℃保存的肝組織,各組大鼠肝組織均取0.1 g,冰浴,加500 μL組織裂解液和5 μL 磷酸酶抑制劑,冰浴勻漿,4 ℃,以13800íg離心10 min,收集上清液置-80 ℃冰箱保存.使用前用BCA蛋白濃度檢測(cè)法檢測(cè)蛋白水平,蛋白稀釋至50 ng/μL 后取15 μL上樣,進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳,轉(zhuǎn)膜至二氟化樹(shù)脂膜,5%脫脂奶粉封閉,一抗封閉4 ℃過(guò)夜,二抗(羊抗兔) 37 ℃溫育1 h,增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)蛋白表達(dá),Gel-Pro 3.1軟件測(cè)定各條帶的灰度值,經(jīng)內(nèi)參照GAPDH校正后得到蛋白相對(duì)表達(dá)量.

統(tǒng)計(jì)學(xué)處理應(yīng)用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理,計(jì)量數(shù)據(jù)用mean±SD表示,各組樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析,Levene法檢驗(yàn)方差齊性,方差齊時(shí)采用LSD-t檢驗(yàn),方差不齊時(shí)采用Dunnett T3檢驗(yàn),P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義.

2 結(jié)果

2.1 大鼠肝組織超微病理改變 實(shí)驗(yàn)大鼠中,對(duì)照組大鼠無(wú)死亡,AFB1誘癌模型組7只大鼠死亡,死亡率為46.67% (7/15),2 mg/kg白花丹醌處理組5只大鼠死亡,死亡率為33.33% (5/15),3 mg/kg白花丹醌處理組3只大鼠死亡,死亡率為 20.00% (3/15).對(duì)照組大鼠肝組織質(zhì)地柔軟,表面光滑,邊緣整齊,肝小葉結(jié)構(gòu)正常,肝細(xì)胞索排列規(guī)則有序,未見(jiàn)炎性反應(yīng)、變性和壞死.模型組和處理組大鼠,肝表面可見(jiàn)微小顆粒,或大小不一結(jié)節(jié),或腫塊,肝細(xì)胞核異型性明顯,病理檢查證實(shí)有肝癌發(fā)生.

電鏡下肝細(xì)胞腫脹明顯,核體積增大,核膜固縮,異染色質(zhì)在核膜下聚集,核仁深染(圖1A).細(xì)胞漿內(nèi)線粒體數(shù)目增多、腫脹,嵴變短、減少,基質(zhì)密度增加,呈粗顆粒狀.粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)增生,呈囊性擴(kuò)張或成泡狀.部分肝細(xì)胞內(nèi)可見(jiàn)線管狀滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)增生.糖原顆?？梢?jiàn).瘤細(xì)胞大小不一致,胞核深染、大小不均.核膜曲折內(nèi)陷或外凸,異染色質(zhì)豐富,呈粗顆粒狀彌漫分布或凝集成塊堆集在核膜下.可見(jiàn)巨核、雙核,甚至多核,胞核形態(tài)不規(guī)整,可見(jiàn)怪異核,核仁體積增大,數(shù)目增多,形態(tài)不規(guī)則,靠邊(圖1B).

圖1 大鼠肝組織超微病理.A:腫瘤組織; B腫瘤組織; C:自噬細(xì)胞; D:自噬細(xì)胞.

3 mg/kg白花丹醌處理組大鼠肝癌組織中多見(jiàn)細(xì)胞自噬現(xiàn)象(8例),AFB1誘癌模型2例,2 mg/kg白花丹醌處理組4例.電鏡下細(xì)胞內(nèi)大塊致密物沉積,核固縮、濃集,細(xì)胞器少見(jiàn)(圖1B),新月?tīng)罨虮瓲?雙層或多層膜,有包繞胞漿成分的趨勢(shì)(圖1C).雙層或多層膜的液泡狀結(jié)構(gòu),內(nèi)含胞漿成分,如線粒體(圖1D).

2.2 肝組織中AKT1表達(dá) AKT1 mRNA表達(dá)(RT-PCR)結(jié)果(圖2),AFB1誘癌模型組與對(duì)照組比較,大鼠肝組織中AKT1 mRNA 和蛋白表達(dá)水平均明顯增加,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t值分別為17.013、9.986,均P＜0.001); 2 mg/kg白花丹醌處理組與AFB1誘癌模型組,大鼠肝組織中AKT1 mRNA表達(dá)明顯下降,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=-2.378,P=0.030),蛋白表達(dá)水平稍有減少,但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=-1.811,P=0.089); 3 mg/kg白花丹醌處理組與AFB1誘癌模型組,大鼠肝組織中AKT1 mRNA和蛋白表達(dá)明顯下降,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t值分別為-17.980、-4.247,均P＜0.001)(見(jiàn)表1).免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示(圖3),AKT1陽(yáng)性為細(xì)胞核染成棕黃色,陰性為細(xì)胞核淡藍(lán)色.對(duì)照組大鼠肝組織AKT1蛋白在匯管周?chē)倭勘磉_(dá),肝細(xì)胞內(nèi)幾乎無(wú)表達(dá); AFB1誘癌模型組大鼠肝組織AKT1蛋白在匯管區(qū)和部分肝細(xì)胞核表達(dá),表達(dá)量較對(duì)照組明顯增加,經(jīng)白花丹醌處理后,肝組織AKT1蛋白表達(dá)量稍有減少,而3 mg/kg白花丹醌處理組表達(dá)顯著減少.

2.3 肝組織中LC3B-Ⅰ、LC3B-Ⅱ蛋白表達(dá) Western印跡檢測(cè)肝組織中LC3BⅠ、LC3BⅡ蛋白結(jié)果(圖4),與對(duì)照組比較,AFB1誘癌模型組大鼠肝組織中LC3B-II/I比值稍有上升,差異無(wú)顯著性(t=2.053,P=0.057).與AFB1誘癌模型組比較,2 mg/kg白花丹醌和3 mg/kg白花丹醌處理組大鼠肝組織中LC3B-II/I比值均明顯升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=2.420,P=0.028;t=35.136,P＜0.001),大鼠肝組織中LC3B-II/I比值在2 mg/kg白花丹醌和3 mg/kg白花丹醌處理組之間的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=21.316,P＜0.001)(表2).

2014年12月，國(guó)務(wù)院批準(zhǔn)了財(cái)政部制定的改革方案，確立了政府會(huì)計(jì)改革的指導(dǎo)思想、基本原則、主要任務(wù)、具體內(nèi)容、配套措施、實(shí)施步驟和組織保障。明確提出了此次改革任務(wù)：建立健全政府會(huì)計(jì)核算體系、報(bào)告體系。為以后建成我國(guó)特色的政府會(huì)計(jì)準(zhǔn)則體系奠定堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。

2.4 肝組織中AKT1 mRNA表達(dá)與LC3B-II/I比值的相關(guān)性 在3 mg/kg白花丹醌處理組大鼠肝細(xì)胞癌組織中,其AKT1 mRNA表達(dá)與LC3B-II/I比值間存顯著負(fù)相關(guān)(r=-0.611,P=0.035),見(jiàn)圖5.

3 討論

PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路在細(xì)胞適應(yīng)生理?xiàng)l件和環(huán)境壓力過(guò)程中,發(fā)揮極其重要的負(fù)向調(diào)節(jié)作用,是自噬啟動(dòng)階段的關(guān)鍵分子,參與腫瘤細(xì)胞遷移、黏附、細(xì)胞基質(zhì)的降解[9].活化的AKT可直接磷酸化mTOR的Ser2448位點(diǎn),激活下游分子mTOR,后者引起自噬蛋白Atg13過(guò)磷酸化,使Atg13與Atg1相互作用的親和力降低,調(diào)控與細(xì)胞自噬發(fā)生相關(guān)的多種效應(yīng)分子的磷酸化,調(diào)控自噬蛋白的轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)位過(guò)程.mTOR激酶活性受抑制時(shí),Atg13部分脫磷酸化,誘導(dǎo)自噬的發(fā)生[10].自噬是細(xì)胞質(zhì)蛋白和細(xì)胞器降解的主要途徑,與腫瘤抑制相關(guān),特別是在肝臟[11].

表1 AFB1誘導(dǎo)肝細(xì)胞癌模型大鼠肝組織中AKT1 mRNA、蛋白表達(dá)(mean±SD)

表2 AFB1誘導(dǎo)肝細(xì)胞癌模型大鼠肝組織中LC3-II/I比值的變化(mean±SD)

圖2 RT-PCR法測(cè)AKT mRNA表達(dá).1:分子量marker; 2:3 mg/kg白花丹醌處理組; 3:對(duì)照組; 4:AFB1誘癌模型組; 5:2 mg/kg白花丹醌處理組.

白花丹醌,為一種具有潛在的抗癌活性的萘醌化合物.有研究報(bào)道,白花丹醌的提純物可能通過(guò)ERK和PI3K抑制劑,快速誘導(dǎo)自噬活性,顯著抑制祼鼠MDAMB-231乳腺癌細(xì)胞的生長(zhǎng),具有強(qiáng)有力的廣譜抗腫瘤活性[6].Ma等[12]報(bào)道,白花丹醌通過(guò)活化細(xì)胞自噬途徑和線粒體介導(dǎo)的凋亡途徑,顯著抑制AGS胃癌細(xì)胞增殖、抑制細(xì)胞浸潤(rùn)和遷移.Lin等[13]報(bào)道,白花丹醌以劑量和時(shí)間依賴(lài)方式,抑制人肝癌SMMC-7721細(xì)胞株的細(xì)胞增殖,SMMC-7721 細(xì)胞內(nèi)有自噬體形成和LC3 蛋白表達(dá),有效抑制祼鼠移植瘤的生長(zhǎng),誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、自噬.我們的實(shí)驗(yàn)電鏡結(jié)果顯示,白花丹醌處理組大鼠肝癌組織中多見(jiàn)細(xì)胞自噬現(xiàn)象.與AFB1誘癌模型組比較,2 mg/kg白花丹醌和3 mg/kg白花丹醌處理組大鼠肝組織中LC3B-II/I比值均明顯升高,以3 mg/kg白花丹醌處理組更顯著.結(jié)合電鏡結(jié)果,我們發(fā)現(xiàn),白花丹醌可顯著增加AFB1誘導(dǎo)型大鼠肝癌細(xì)胞自噬活性.

圖3 各組實(shí)驗(yàn)大鼠肝組織AKT 1免疫組織化學(xué)染色(DAB顯色).A:對(duì)照組; B:AFB1誘癌模型組; C:2 mg/kg白花丹醌處理組; D:3 mg/kg白花丹醌處理組(A、B放大100倍,C、D放大200倍).DAB:二氨基聯(lián)苯胺.

圖4 Western blot法測(cè)肝組織中LC3BⅠ、LC3BⅡ蛋白表達(dá).1:對(duì)照組; 2:3 mg/kg白花丹醌處理組; 3:2 mg/kg白花丹醌處理組; 4:AFB1誘癌模型組.

圖5 3 mg/kg白花丹醌處理組肝細(xì)胞癌組織中AKT1 mRNA表達(dá)與LC3B-Ⅱ/Ⅰ比值間相關(guān)性分析.

白花丹醌具有抗腫瘤作用,但其抗癌機(jī)制尚未闡明.Xue等[14]報(bào)道,白花丹醌可能通過(guò)抑制AKT/mTOR信號(hào)通路,增加細(xì)胞內(nèi)活性氧物質(zhì)的含量,提高順鉑對(duì)CAL27細(xì)胞、順鉑耐受的CAL27/CDDP細(xì)胞的細(xì)胞毒性、凋亡和自噬作用,抑制舌鱗狀細(xì)胞癌發(fā)生和進(jìn)展.我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,AFB1誘癌模型組大鼠肝組織中AKT1 mRNA和蛋白表達(dá)水平均明顯增加,應(yīng)用3 mg/kg白花丹醌預(yù)處理后,大鼠肝組織中AKT1 mRNA和蛋白表達(dá)明顯下降.這些證據(jù)表明,白花丹醌能有效抑制AFB1誘導(dǎo)性大鼠肝細(xì)胞癌組織中AKT1表達(dá),這證實(shí)了白花丹醌可能通過(guò)抑制AKT/mTOR信號(hào)通路,發(fā)揮抗肝臟腫瘤作用.

有部分研究報(bào)道了自噬與腫瘤進(jìn)展的關(guān)系,但HCC腫瘤組織中AKT表達(dá)與自噬活性之間相關(guān)性的研究,目前少有報(bào)道.我們的研究結(jié)果顯示,AFB1誘導(dǎo)型大鼠肝細(xì)胞癌組織中,AKT1 mRNA表達(dá)與LC3B-II/I比值存在顯著負(fù)相關(guān)(P=0.035).我們推測(cè)HCC組織中自噬活性的增加,可能抑制AKT的表達(dá).

綜上所述,我們發(fā)現(xiàn)AFB1誘導(dǎo)HCC模型大鼠肝組織中,AKT1表達(dá)明顯升高,應(yīng)用白花丹醌可顯著抑制AKT1表達(dá),使肝腫瘤組織中自噬活性增加,且AKT1表達(dá)與自噬活性之間存在顯著負(fù)相關(guān).因此,我們推測(cè)白花丹醌可能通過(guò)抑制PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路,抑制AFB1誘導(dǎo)型大鼠肝細(xì)胞癌組織中AKT1的表達(dá),增加肝癌細(xì)胞自噬活性,從而發(fā)揮抗肝臟腫瘤的作用.然而,白花丹醌藥理活性廣泛,對(duì)組織氧環(huán)境、細(xì)胞內(nèi)氧壓力的改變,也有可能改變細(xì)胞自噬活性,除PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路外,且存在多種影響細(xì)胞自噬活性的信號(hào)傳導(dǎo)途徑.因此,白花丹醌抗腫瘤的機(jī)制有待進(jìn)一步研究.

實(shí)驗(yàn)背景

自噬在調(diào)節(jié)肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)的進(jìn)展中起重要作用.白花丹醌具有抗腫瘤作用,但抗癌機(jī)制未明確.本研究采用白花丹醌干預(yù)黃曲霉毒素B1 (aflatoxin B1,AFB1)誘導(dǎo)型大鼠HCC細(xì)胞,探究其對(duì)HCC自噬活性影響及潛在機(jī)制.

實(shí)驗(yàn)動(dòng)機(jī)

白花丹醌是天然的植物化學(xué)物質(zhì),探究其對(duì)HCC自噬活性的影響及潛在機(jī)制,對(duì)藥物的臨床應(yīng)用具有積極意義.

實(shí)驗(yàn)?zāi)繕?biāo)

探究白花丹醌對(duì)大鼠HCC自噬活性影響,并初步探究其潛在機(jī)制.

實(shí)驗(yàn)方法

制作大鼠HCC模型并用白花丹醌干預(yù),透射電鏡觀察肝組織和自噬細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu).RT-PCR和免疫組織化學(xué)染色技術(shù)測(cè)AKT1 mRNA和蛋白的表達(dá).Western Blot測(cè)肝組織中LC3BⅠ、LC3BⅡ蛋白表達(dá).比較各組間AKT1 mRNA和蛋白表達(dá)差異,及LC3B-Ⅱ/Ⅰ比值差異.

實(shí)驗(yàn)結(jié)果

白花丹醌可顯著增加AFB1誘導(dǎo)型大鼠HCC細(xì)胞自噬活性.AFB1誘癌模型組大鼠肝組織中AKT1 mRNA 和蛋白表達(dá)水平均明顯增加,應(yīng)用3 mg/kg白花丹醌預(yù)處理后,大鼠肝組織中AKT1 mRNA和蛋白表達(dá)明顯下降.

實(shí)驗(yàn)結(jié)論

白花丹醌可能通過(guò)抑制PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路,抑制AFB1誘導(dǎo)型大鼠HCC組織中AKT1的表達(dá),增加HCC細(xì)胞自噬活性,從而發(fā)揮抗HCC的作用.

展望前景

白花丹醌可以增加HCC自噬活性,抑制早期HCC進(jìn)展,為藥物的臨床應(yīng)用提供一定的理論基礎(chǔ).