花牛蘋果幼果多酚單體酚降血壓成分的篩選

高義霞 呼麗萍 袁毅君

摘要：為了充分利用農(nóng)業(yè)廢棄物蘋果疏果，以花牛蘋果疏果為材料，通過微波輔助提取蘋果多酚，利用大孔樹脂NKA-9對提取的粗多酚進(jìn)行分離，再通過Sephadex LH-20進(jìn)一步純化分離精制，得到5種單體酚，分別為綠原酸、表兒茶素、根皮苷類、兒茶素、槲皮素;利用分光光度法測定各單體酚對血管緊張素酶的抑制效果。結(jié)果表明，槲皮素、根皮苷、兒茶素、表兒茶素具有明顯的抑制ACE的作用，與陽性藥物相比較，槲皮素和根皮苷的效果明顯優(yōu)于卡托普利，表兒茶素和兒茶素的效果與卡托普利相當(dāng)。

關(guān)鍵詞：蘋果多酚;降血壓;ACE酶抑制;綠原酸;表兒茶素;根皮苷;兒茶素;槲皮素

中圖分類號： R284 ?文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A ?文章編號：1002-1302（2020）10-0232-04

收稿日期：2019-04-28

基金項(xiàng)目：甘肅省自然科學(xué)基金（編號：1610RJZE141）。

作者簡介：高義霞（1982—），女，甘肅白銀人，碩士，副教授，主要從事資源植物的開發(fā)利用研究。E-mail：egaoxy@126.com。

我國是世界蘋果產(chǎn)業(yè)規(guī)模最大的國家，2014年我國蘋果栽培面積和年產(chǎn)量分別達(dá)到 226.67萬hm2 和 3 800萬t，疏果量達(dá)285萬t[1];以甘肅省為例，蘋果栽培面積和年產(chǎn)量分別達(dá)到 32萬hm2 和320萬t，疏果量約為24萬t。而幼果中的多酚含量為成熟果實(shí)的10倍，約占幼果的 1%～2%，是蘋果多酚豐富的來源，開發(fā)價(jià)值很高[2]。據(jù)專家預(yù)測，多酚的需求量將會以每年40%的速度增長。目前，茶多酚制品已形成相當(dāng)?shù)氖袌鲆?guī)模，相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，蘋果多酚的許多生理功能比茶多酚要高100倍以上[3]，因此，開發(fā)蘋果多酚制品具有廣闊的銷售市場。目前，絕大多數(shù)的蘋果疏落果被丟棄，極少量以沼氣或者飼喂家禽等方式消化，既污染了自然環(huán)境，也產(chǎn)生大量的農(nóng)業(yè)垃圾，造成極大的資源浪費(fèi)[4]。相關(guān)報(bào)道表明，蘋果多酚混合物具有抑制血管緊張素轉(zhuǎn)化酶（ACE）的活性，具體作用機(jī)制不清楚。高血壓是威脅人類健康的“頭號殺手”，2010年，我國高血壓患者達(dá)2億人，且每年以1千萬人的速度增長，因此，如何有效預(yù)防高血壓成為人們共同面對的挑戰(zhàn)[5]。Tom等研究發(fā)現(xiàn)，血壓升高與ACE活性有著密切的聯(lián)系，抑制ACE活性可降壓[6]，如人工合成的降壓藥卡托普利正是利用這一治療機(jī)制，但副作用明顯，因此，人們試圖尋找天然的ACE抑制劑來開發(fā)天然降壓藥或具有降壓保健功能的藥食重組產(chǎn)品。目前，國內(nèi)關(guān)于茶多酚對ACE活性的降壓機(jī)制研究較為成熟，但關(guān)于蘋果多酚抑制ACE活性的研究卻鮮有報(bào)道。本研究將蘋果多酚中單體酚作為指標(biāo)成分，建立一種快速、簡便、靈敏、準(zhǔn)確、重復(fù)性好的檢驗(yàn)方法，旨在為蘋果多酚降血壓活性指標(biāo)的質(zhì)量控制和血管緊張素抑制劑的藥物研制提供試驗(yàn)依據(jù)。對蘋果多酚的開發(fā)和利用不僅可以減少大量廢棄蘋果幼果資源浪費(fèi)，而且可以變廢為寶，減少環(huán)境污染，構(gòu)建和諧文明社會，具有深遠(yuǎn)的現(xiàn)實(shí)意義和社會意義。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

花牛蘋果疏除幼果，采自甘肅省天水市麥積區(qū)中灘鎮(zhèn)九龍山蘋果基地，采集時(shí)間為2016年6月5日，處理前保存于0 ℃冷庫中。福林酚試劑（Folin-Ciocalteu），上海潤順化工有限公司;沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品（≥99%），阿拉丁試劑;果膠酶（>500 AJDU/mg），Sigma公司;異抗壞血酸，湖南世紀(jì)華星生物工程有限公司;無水乙醇，國產(chǎn)分析純。

KQ-500型超聲波清洗器，昆山市超聲儀器公司;紫外-可見分光光度計(jì)（UV-2450），日本島津生產(chǎn);九陽料理機(jī)（JYL-C022），九陽集團(tuán);TGL-20M 型高速臺式冷凍離心機(jī)，湖南湘儀公司生產(chǎn)。

1.2 蘋果多酚的提取

取花牛蘋果幼果，切塊后，按10 g ∶ 1 mL的比例（蘋果樣品：異抗壞血酸）加入10%異抗壞血酸水溶液作為護(hù)色劑，破碎后，精確稱取樣品10.000 g，加入1.7 mg果膠酶于50 ℃酶解2 h，按照料液比 1 g ∶ 10 mL 加入50%（體積分?jǐn)?shù)，下同）乙醇，380 W 下微波提取2 min，提取次數(shù)2次，提取液抽濾，收集濾液，定容備用[7]。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作及多酚含量的測定

多酚含量的測定采用Folin-Ciocalteu法[8]。取0.1 g沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品，用100 mL 50 %乙醇溶液溶解，搖勻后，分別取1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5 mL 標(biāo)準(zhǔn)液，加入3 mL稀釋3倍的Folin-Ciocalteu試劑，搖勻，反應(yīng)2 min后加入2 mL 7.5 %碳酸鈉溶液，用蒸餾水定容至25 mL，搖勻，30 ℃保溫30 min，740 nm處測定D值。標(biāo)準(zhǔn)曲線方程：y=0.088 7x+0.005 5，r2=0.9 993，式中：x為吸光度，y為沒食子酸質(zhì)量濃度（μg/mL）。蘋果多酚含量的測定按同法操作。計(jì)算多酚含量的公式：多酚得率=C×V×N/m×100%，式中：C為測量液總酚質(zhì)量濃度（μg/mL）;V為粗提液體積（mL）;N為稀釋倍數(shù);m為樣品質(zhì)量（g）。

1.4 蘋果多酚的純化

采用大孔樹脂柱NKA-9，以丙酮為溶劑，柱層析初步分離蘋果粗多酚。根據(jù)其對蘋果多酚動(dòng)態(tài)吸附、解吸附柱層析試驗(yàn)，每5 mL收集1次，氮吹濃縮后，通過理化性質(zhì)進(jìn)行鑒別。利用Sephadex LH-20進(jìn)一步純化分離精制，得到分離物質(zhì)，與標(biāo)準(zhǔn)品對比，經(jīng)高效液相色譜（HPLC）比對確定為5種單體酚[9-11]。

1.5 單體酚降血壓活性研究

以對ACE的抑制能力為靶標(biāo)，以降壓藥物卡托普利（ACE抑制劑）為陽性對照，體外研究蘋果多酚各單體的降血壓活性，篩選出活性明顯的成分。基本方法為在模擬人體生理?xiàng)l件下，利用ACE催化水解馬尿酰組氨酰亮氨酸生成馬尿酸，當(dāng)加入ACE抑制劑時(shí)，催化水解反應(yīng)被抑制，生成的馬尿酸含量減少。馬尿酸在存在喹啉的條件下與苯磺酰氯反應(yīng)生成黃色化合物，在乙醇溶液中最大吸收波長為470 nm，故可比色定量，根據(jù)馬尿酸吸收值的大小來衡量ACE的抑制活性[12]。

2 結(jié)果與分析

2.1 蘋果多酚的分離鑒定

利用大孔樹脂柱NKA-9，分離得到4組成分，分別為FA、FB、FC、FD。組分FA通過Sephadex LH-20 分離（重復(fù)操作2次），分離洗脫曲線見圖1-a，得到1個(gè)組分FA1（480.2 mg）。組分FC通過Sephadex LH-20分離（重復(fù)操作4次），分離洗脫曲線見圖1-b。通過大孔樹脂及Sephadex LH-20 分離（重復(fù)操作3次），最終得到4個(gè)組分FC1（182.0 mg）、FC2（273.6 mg）、FC3（123.6 mg）、FC4（1 079.0 mg）。由于組分FB、FD均為分離到的非有效的酚類物質(zhì)，故棄去。

圖2、圖3為經(jīng)過Sephadex LH-20進(jìn)一步分離純化所得到的高純度產(chǎn)物色譜，圖3為同等色譜條件下5種標(biāo)準(zhǔn)品混合溶液的HPLC結(jié)果。將圖2與圖3相對照，可知經(jīng)大孔樹脂初步分離，所得到的高純度單一產(chǎn)物FA1可能是綠原酸，F(xiàn)C1可能是表兒茶素，F(xiàn)C2可能是根皮苷類，F(xiàn)C3可能是兒茶素，F(xiàn)C4可能是槲皮素。

2.2 蘋果單體酚對ACE的抑制作用

以上述步驟分離的5種單體酚為研究對象，利用其對ACE的抑制作用，模擬人體生理?xiàng)l件，測定各單體酚對ACE的抑制作用，以其評價(jià)其降血壓活性。

2.2.1 馬尿酸標(biāo)準(zhǔn)曲線 參照文獻(xiàn)[13]的測定方法，稱取適量馬尿酸標(biāo)準(zhǔn)品，分別配成含量為0.00、002、0.04、0.06、0.08、0.10、0.12、0.16 mg/mL的馬尿酸水溶液，向各管中加入0.6 mL喹啉，混勻后再加入0.2 mL苯磺酰氯，立即蓋緊比色管塞，手動(dòng)強(qiáng)烈振蕩25～30次，在（30±2） ℃條件下避光放置30 min。加入3.7 mL 95%（體積分?jǐn)?shù)）乙醇，混勻，繼續(xù)避光放置30 min。用10 mm比色杯取中間濃度管掃描，確定最大吸收波長為470 nm，以試劑空白（0號管）為參比，在470 nm處測量各管的吸光度。最后以吸光度為縱坐標(biāo)、馬尿酸含量為橫坐標(biāo)，繪制馬尿酸含量與混合溶液吸光度的標(biāo)準(zhǔn)曲線，詳見圖4。

2.2.2 卡托普利對ACE抑制作用 為了確立ACE的活性測定體系，進(jìn)行不同濃度卡托普利對ACE抑制活性的測定。從圖5可以看出，隨卡托普利質(zhì)量濃度不斷增大，其對ACE的抑制作用不斷增強(qiáng)，當(dāng)卡托普利質(zhì)量濃度增至100 μg/mL時(shí)，卡托普利對ACE的抑制作用不再明顯增加，說明其趨于飽和，利用SPSS 16.0計(jì)算得出卡托普利對ACE的IC50為67.49 μg/mL。

2.2.3 不同抑制劑對ACE活性的抑制效果 根據(jù)上述方法，對每一種試劑在不同濃度下進(jìn)行測定，研究不同濃度下各成分對兔肺ACE活性的影響，結(jié)果見圖6。計(jì)算得綠原酸、根皮苷、兒茶素、槲皮素、表兒茶素IC50分別為138.43、38.23、68.28、28.33、62.09 μg/mL，表明槲皮素、根皮苷、兒茶素、表兒茶素具有明顯的抑制ACE的作用，與陽性藥物相比較，槲皮素和根皮苷的效果明顯優(yōu)于卡托普利，表兒茶素和兒茶素的效果與卡托普利相當(dāng)。

3 結(jié)論

以花牛蘋果疏果為材料，通過微波輔助提取蘋果多酚，利用大孔樹脂NKA-9對提取的粗多酚進(jìn)行分離，再通過Sephadex LH-20進(jìn)一步純化分離精制，得到5種單體酚，分別為綠原酸、表兒茶素、根皮苷類、兒茶素、槲皮素。利用分光光度法測定各單體酚對血管緊張素酶的抑制效果，結(jié)果表明，槲皮素、根皮苷、兒茶素、表兒茶素具有明顯的抑制ACE的作用，與陽性藥物相比較，槲皮素和根皮苷的效果明顯優(yōu)于卡托普利，表兒茶素和兒茶素的效果與卡托普利相當(dāng)。

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