鳳丹牡丹二氫黃酮醇-4-還原酶基因克隆及表達特性分析

甘林鑫 李厚華 李果 劉鵬遠 韓美玲

摘要：以鳳丹種皮為材料，克隆花青素生物合成中的關(guān)鍵基因DFR，并進行功能驗證。結(jié)果表明，鳳丹DFR基因含有長度為1 092 bp的開放閱讀框（ORF），共編碼364個氨基酸。其中，鳳丹DFR蛋白的相對分子量為 40 796.17 u，理論等電點（PI）為5.76。實時熒光定量分析鳳丹牡丹種子4個發(fā)育階段的PoDFR基因表達水平，結(jié)果表明，在鳳丹種子發(fā)育過程中，PoDFR基因的表達水平先增加后減少，在S2時期達到最高。構(gòu)建PoDFR基因的原核表達載體并在大腸桿菌中表達以獲得PoDFR的原核表達蛋白。體外酶促反應和高效液相色譜法表明，PoDFR蛋白可以催化二氫槲皮素合成無色花青素，通過與PoANS蛋白結(jié)合合成花青素，證明PoDFR基因具有相應的功能活性。

關(guān)鍵詞：鳳丹牡丹;DFR基因;二氫槲皮素;花青素;表達特性;功能

中圖分類號： S685.110.1 ?文獻標志碼： A ?文章編號：1002-1302（2020）10-0073-07

收稿日期：2019-05-06

基金項目：公益性行業(yè)（林業(yè)）科研重大專項（編號：201404701）;國家自然科學基金（編號：31570697）。

作者簡介：甘林鑫（1994—），女，云南昆明人，碩士，主要從事園林植物分子生物學研究。E-mail：597807188@qq.com。

通信作者：李厚華，博士，教授，主要從事園林植物研究。E-mail：lihouhua73@163.com。

鳳丹牡丹，別稱銅陵牡丹，栽培歷史悠久，因其結(jié)實量大，栽培管理方便，已成為油用牡丹的主要品種[1]。然而，在實際生產(chǎn)榨油和使用過程中，由于成熟的牡丹種子外殼呈現(xiàn)黑色（圖1），壓榨后的原油會出現(xiàn)有異味的黑色物質(zhì)，降低了牡丹原油的品質(zhì)，而脫殼又會降低出油量。因此，研究黑色物質(zhì)合成的相關(guān)基因，可以為下一步在基因工程層面上改善鳳丹牡丹的種殼特性提供理論依據(jù)[2]。研究發(fā)現(xiàn)，類黃酮物質(zhì)是牡丹種殼中的主要色素成分，包含花青素類、黃酮類和原花青素類[3]，DFR基因作為類黃酮合成途徑中的關(guān)鍵基因，還未在鳳丹牡丹中被克隆。DFR（dihydroflavonol 4-reductase，二氫黃酮醇-4-還原酶）可以催化二氫黃酮醇合成無色的天竺葵素、飛燕草素或矢車菊素，再結(jié)合ANS（anthocyanidin synthase）催化合成有色花青素[4-6]。

為了解鳳丹牡丹種皮中DFR基因的表達和調(diào)控，通過RT-PCR從鳳丹牡丹種殼中克隆了類黃酮合成途徑的重要基因DFR，并分析該基因的生物學信息。通過原核表達的方法獲得該基因翻譯的相應蛋白，再進行酶促反應，利用高效液相色譜法驗證該基因的功能，分析了鳳丹牡丹中類黃酮化合物代謝的分子機制。

1 試驗材料與方法

1.1 植物材料與菌株

本試驗以鳳丹牡丹種子為材料，于西北農(nóng)林科技大學牡丹種質(zhì)資源圃中分別采集白色期、變色期、褐色期、黑色期的鳳丹種子（圖2），在液氮中快速冷凍后，將其儲存在-80 ℃冰箱中用于基因克隆及表達分析。

1.2 鳳丹總RNA提取與cDNA合成

使用OMEGA Plant Total RNA提取盒進行RNA提取，根據(jù)說明書操作。通過1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，使用外分光光度計檢測濃度。以每個時期總RNA為模板，使用PrimeScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser，先消除基因組DNA后，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈，置于-80 ℃?zhèn)溆肹7-8]。

1.3 基因克隆

基于NCBI上其他植物的DFR基因序列，使用軟件Primer 5.0設(shè)計引物（表1）。以逆轉(zhuǎn)錄獲得的cDNA為模板，用PrimeSTAR HS DNA聚合酶高保真酶擴增靶基因全長，瓊脂糖凝膠電泳檢測反應結(jié)果。

擴增條件為98 ℃預變性1 min;98 ℃變性10 s，58 ℃ 退火5 s，72 ℃延伸1 min（35個循環(huán)）;將反應在 72 ℃ 延伸5 min，在4 ℃下儲存。在1%瓊脂糖凝膠上檢測擴增產(chǎn)物，純化并回收目標條帶，把回收產(chǎn)物連接到pGEM-T載體上，通過熱擊法轉(zhuǎn)化大腸桿菌E.coli DH5α感受態(tài)細胞，經(jīng)藍白斑篩選和菌落PCR驗證后，將陽性菌液培養(yǎng)過夜，送至公司進行測序[9-11]。

1.4 生物信息學分析

使用NCBI BLAST進行氨基酸序列的同源分析，利用ExPASyProtParam Tool（http：//web.expasy.org/protparam/），HNN SECONDARY STRUCTURE PREDICTION METHOD，Swiss-Model Workplace（http：//swissmodel.expasy.org/）和TMGMM 2.0等軟件進行蛋白質(zhì)各級結(jié)構(gòu)預測。編碼蛋白的修飾位點檢測在KinasePhos（http：//kinasephos. mbc.nctu.edu.tw/）中完成[12-15]。

1.5 PoDFR基因的表達分析

用不同時期的種皮cDNA為模板，選用牡丹 β- 微管蛋白基因beta-Tubulin（登錄號：EF608942）為實時定量反應的參考基因[2]。采用SYBR Green法在Applied Biosystems StepOne Plus實時定量PCR儀上按照儀器說明進行試驗。每個樣品重復3次，并使用2-ΔΔCT方法進行數(shù)據(jù)分析[16]。

1.6 PoDFR基因的原核表達分析

首先用EcoRI、HindⅢ雙酶切線性化處理原核表達載體pET-28a[17]。基于載體切口兩端的 15 bp 同源序列設(shè)計特異性引物nrDFRf和nrDFRr（表1）。使用cDNA作為模板，高保真酶擴增靶基因，并通過凝膠電泳檢測回收產(chǎn)物和線性化載體，在重組酶的作用下進行連接。根據(jù)熱激法連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)移至DH5α感受態(tài)細胞，并在過夜培養(yǎng)后挑斑用于PCR驗證。將驗證后的陽性細菌溶液送去測序以確保沒有位點突變。在37 ℃下培養(yǎng)合格的陽性細菌溶液過夜后，提取質(zhì)粒并轉(zhuǎn)移到大腸桿菌BL21（DE3）感受態(tài)細胞中。在證實為正確且沒有位點突變的重組載體菌液過夜培養(yǎng)后，將LB液體培養(yǎng)基稀釋50倍并繼續(xù)培養(yǎng)直至D600 nm約為0.6。通過加入終濃度為1.0 mmol/L的IPTG誘導外源基因的表達，并分別在0、2、4、6、8 h后收集細菌溶液，同時用PET-28a載體作為對照。確定了最佳誘導時間后，IPTG的終濃度分別設(shè)定為0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mmol/L，以確定最佳誘導濃度并收集誘導菌液。吸取上清液進行SDS-PAGE電泳?？捡R斯亮藍染色后，再脫色并拍照保存[18-19]。

1.7 原核表達蛋白酶促反應

通過獲得的最佳誘導方法誘導重組蛋白，并使用溶菌酶法提取蛋白質(zhì)。誘導后，4 ℃收集菌液，4 000 r/min 離心5 min，去除上清液，用Buffer（100 mmol/L Tris-HCl，1 mmol/L EDTA，100 μg/mL 的溶菌酶，pH值8.0）重懸，室溫條件下孵育15 min，超聲15～20 s，12 000 r/min離心 15 min，取上清液[20]。根據(jù)DFR蛋白的特性，使用二氫槲皮素作為反應的底物，選擇粗提蛋白作為催化劑進行酶促反應，并設(shè)定對照組PET-28a誘導提取蛋白。將單獨DFR原核表達蛋白催化、DFR和ANS原核表達蛋白聯(lián)合催化設(shè)置為2個試驗組。反應條件為30 ℃、30 min，結(jié)束后保存于4 ℃。

1.8 高效液相色譜法檢測

通過日立L-2000高效液相色譜儀檢測酶促反應物，檢測器為L-2455型二極管陣列檢測器，檢測波長為200～700 nm，C18柱（Hitachi，Japan，250 nm×4.6 mm，5 μm），柱溫40 ℃，進樣量為 10 μL，流速為0.5 mL/min。流動相參數(shù)A：0.04%甲酸水溶液，B：乙腈（色譜級）。采用梯度洗脫，洗脫程序為0～40 min，A為0～95%，B為5%～100%;40～60 min，A為0，B為100%。

2 結(jié)果與分析

2.1 PoDFR基因的序列與分析

以鳳丹牡丹的cDNA為模板，通過RT-PCR擴增PoDFR基因全長，獲得1 000 bp的基因序列（圖3）。它包含1個完整的開放閱讀框（open reading frame，ORF），共有1 095個堿基編碼364個氨基酸殘基（圖4）。

2.2 PoDFR基因的生物信息學分析

用Blast比較鳳丹牡丹的DFR基因序列與NCBI中其他植物的DFR基因序列，結(jié)果表明，鳳丹牡丹DFR基因與芍藥DFR基因（GenBank登錄號：JQ070804.1）、楓香DFR基因（GenBank登錄號：JX944785.1）、圓葉葡萄DFR基因（GenBank登錄號：KC460268.1）的同源性分別為97%、83%、80%，與胡楊DFR基因（GenBank登錄號：XM011009150.1）、歐洲草莓DFR基因（GenBank登錄號：KC894052.1）、雜交月季DFR基因（GenBank登錄號：AY780885.1）等的同源性也在70%以上。鳳丹PoDFR蛋白相對分子質(zhì)量為40 796.17 u，通過Expasy Protparam在線預測PoDFR蛋白氨基酸成分及比例如表2所示。

利用CELLO v.2.5在線軟件預測PoDFR蛋白在真核生物中的亞細胞定位，發(fā)現(xiàn)它在細胞質(zhì)中具有最高的定位概率，可靠性為4.063。其理化性質(zhì)詳見表3。

HNN用于預測鳳丹PoDFR的二級結(jié)構(gòu)。結(jié)果表明，PoDFR由35.44%的α-螺旋（α-helices），17.86%的延伸鏈（extended strands）和 46.79%的無規(guī)則卷曲（random coils）組成。PoDFR蛋白的三級結(jié)構(gòu)預測如圖5所示。分析了PoDFR蛋白的保守結(jié)構(gòu)域（圖6），PoDFR蛋白具有典型的PLN02650結(jié)構(gòu)特征，其是DFR蛋白的特定位點，因此推測該蛋白是DFR。

由激酶Phos預測PoDFR的蛋白磷酸化位點含有2個絲氨酸磷酸化位點（分別位于297、304氨基酸）和3個蘇氨酸磷酸化位點（分別位于39、123、322氨基酸）和1個酪氨酸磷酸化位點（255氨基酸）（圖7）。

2.3 PoDFR基因表達分析

根據(jù)DFR基因序列，使用特異引物，通過實時定量方法（real-time PCR）對鳳丹種殼發(fā)育過程中

DFR基因的表達量進行分析。結(jié)果（圖8）顯示，DFR基因在S2時期達到最高表達水平，是S1時期的7.31倍;S2時期后，DFR基因的表達量逐漸降低。

2.4 原核表達分析

2.4.1 重組載體pET-PoDFR 原核表達載體pET-28的雙切線性化處理a質(zhì)粒，如圖9所示，由于各種形式，在載體被消化之前，存在多個電泳條帶，并且消化后的載體和預期的大小基本相同。如圖10、圖11所示，有一個陽性轉(zhuǎn)化體存在于重組載體pET-PoDFR中。在驗證陽性轉(zhuǎn)化體被搖動過夜并進行測序后，與第一次測序結(jié)果相比沒有發(fā)現(xiàn)突變位點，因此表明成功構(gòu)建了原核表達載體。

2.4.2 重組蛋白的誘導表達 誘導重組表達載體表達具有約45 000 u的相對分子量的特定蛋白質(zhì)條帶。PoDFR蛋白大小為40 796.17 u，加上原核表達載體pET-28a表達的約3 400 u的融合標簽，與預期相符合（圖11、圖12）。此外，誘導約6 h后，PoDFR的表達水平最高。外源蛋白的表達水平明顯高于載體pET-28a本身的表達水平，從中可以得出，這是誘導的最佳時間。而PoDFR表達量在02 mmol/L IPTG濃度誘導下外源蛋白表達量最高，結(jié)果表明這是最佳誘導濃度。

2.5 酶促反應

使用在前一步驟中獲得的最佳條件誘導外源PoDFR在大腸桿菌中的表達，底物是二氫槲皮素。

在NADPH和粗蛋白提取物的作用下，僅用PoDFR蛋白的催化進行酶促反應，二氫槲皮素的顏色變暗;

PoANS蛋白質(zhì)結(jié)合起來催化，顏色迅速變紅（圖13），可以發(fā)現(xiàn)B管反應的顏色明顯比A管中PoDFR單獨反應的顏色更紅。PoANS的催化底物為無色花青素，可初步推斷二氫槲皮素在PoDFR蛋白的催化下合成了無色花青素。對照組空載體 pET-28蛋白質(zhì)提取物與二氫槲皮素反應，沒有任何顏色變化。

2.6 高效液相色譜分析

將前一步獲得的酶促反應物液體于520 nm波長下檢測。結(jié)果顯示，在空載體pET-28a中沒有檢測到吸收峰（圖14），PoDFR和PoANS的聯(lián)合反應物檢測到吸收峰（圖15），結(jié)合酶促反應的結(jié)果表明，PoDFR和PoANS聯(lián)合催化出了花青素，兩者都具有催化反應性。而ANS催化合成花青素的反應底物是無色花青素，證明了DFR基因能夠?qū)⒍溟纹に卮呋铣蔁o色花青素。進一步說明了本試驗克隆的DFR基因是與鳳丹相對應的花青素催化合成的相關(guān)基因。

3 結(jié)論與討論

在該研究中，通過RT-PCR技術(shù)獲得PoDFR基因序列。鳳丹DFR基因的生物信息學分析表明，

它與芍藥DFR基因具有最高同源性，達到97%，證明了芍藥與牡丹有著十分接近的親緣關(guān)系，PoDFR蛋白也具有典型的DFR保守結(jié)構(gòu)域。

DFR基因表達量與花青素合成密切相關(guān)。本試驗實時定量結(jié)果表明，PoDFR基因的表達量在S2時期達到最高，然后表達水平逐漸下降。可能是在早期階段，作為合成花青素的上游基因DFR蛋白，催化合成了大量的無色花青素，在后期，則需要ANS基因?qū)o色花青素催化合成為花青素，DFR基因不參與花青素合成的后期反應。

本研究成功構(gòu)建了pET-PoDFR原核表達載體，IPTG誘導了外源基因的原核表達蛋白。通過聚丙烯胺凝膠電泳確定6 h為原核表達載體最佳的表達時間。結(jié)果表明，常用的1 mmol/L IPTG誘導濃度不適用于該原核表達載體，可能因為高濃度的IPTG抑制了大腸桿菌細胞的正常生長活性，此濃度不利于外源基因在質(zhì)粒載體上的表達。在確定 0.2 mmol/L IPTG作為原核表達載體的最佳濃度后，聚丙烯胺凝膠電泳還顯示原核表達的蛋白與預測位置處的空載體明顯不同。此外， 它在大腸桿菌中表達的蛋白中占比較高，這也表明IPTG的誘導促進了插入質(zhì)粒載體pET-28a上的外源基因的表達。

牡丹中的花青素主要是矢車菊素和芍藥素，二氫槲皮素是這2種花青素的上游前體，因此，用二氫槲皮素作為原核表達PoDFR的催化反應底物。結(jié)果顯示，PoDFR原核表達的粗蛋白提物可以催化二氫槲皮素合成無色花青素，無色花青素不穩(wěn)定，在自然條件下轉(zhuǎn)化為紅色花青素，而對照組空載體原核表達蛋白粗提物沒有發(fā)生相應的顏色變化，證實獲得的DFR基因具有相應的功能活性。同時，本研究還利用李果等獲得的PoANS原核表達蛋白粗提物[21]與PoDFR蛋白聯(lián)合催化，發(fā)現(xiàn)反應產(chǎn)物比PoDFR單獨催化時更紅。再用高效液相色譜法進行驗證，在520 nm波長下，空載體沒有檢測到吸收峰，而PoANS與PoDFR聯(lián)合催化的反應物檢測到了吸收峰，這也進一步證明了DFR是鳳丹牡丹花青素合成的相關(guān)基因。本研究旨在通過RNAi及病毒干擾技術(shù)干擾花青素合成途徑的下游基因，調(diào)節(jié)花青素的合成與積累，為培育具有經(jīng)濟價值和觀賞價值的鳳丹新品種奠定一定的理論基礎(chǔ)。

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