單倍體誘導(dǎo)創(chuàng)建二倍體技術(shù)在油菜遺傳育種中的研究進展

萬麗麗 王轉(zhuǎn)茸 范志雄 辛強 洪登峰 楊光圣 孫玉宏 譚慶

摘要：單倍體誘導(dǎo)創(chuàng)建二倍體的技術(shù)體系主要包括2種類型。（1）對植物中雄性或者雌性生殖器官進行培養(yǎng)獲得具有單套染色體組的組織，經(jīng)過天然或者加倍劑處理獲得二倍體;（2）對CENH3基因進行修飾獲得單倍體誘導(dǎo)系，利用單倍體誘導(dǎo)系與不同材料雜交獲得后者的單倍體，進而加倍成二倍體。在油菜中應(yīng)用最廣泛的單倍體誘導(dǎo)創(chuàng)建二倍體植株的技術(shù)是小孢子培養(yǎng)方法，其過程受到3個因素的影響，分別為小孢子胚發(fā)生能力、小孢子天然加倍和加倍劑處理后的加倍效率、從胚再生成完整植株的能力。經(jīng)過多年研究，在油菜中建立的小孢子誘導(dǎo)創(chuàng)建二倍體的技術(shù)為油菜遺傳育種研究提供了重要的技術(shù)支持。小孢子和小孢子培養(yǎng)得到的胚均能用于創(chuàng)造突變體及遺傳轉(zhuǎn)化試驗。通過遺傳學(xué)方法定位了決定油菜小孢子胚發(fā)生、天然加倍以及胚狀體直接成苗的數(shù)量性狀基因座（QTLs），可在不同群體中驗證候選基因。深入挖掘調(diào)控小孢子胚發(fā)生和再生成苗的分子機制，分析胚性細胞發(fā)育的轉(zhuǎn)變、起始細胞的分化以及胚形態(tài)發(fā)生的基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，進而為理解油菜單倍體誘導(dǎo)以及二倍體發(fā)生的作用機制提供依據(jù)。隨著植物單倍體誘導(dǎo)發(fā)生的分子機制被逐步揭示，在油菜中對與擬南芥染色體減數(shù)分裂相關(guān)的同源基因進行修飾能夠獲得單倍體誘導(dǎo)系，將其與待改良的父母本進行雜交可快速獲得具有不同親本背景的單倍體，經(jīng)過加倍劑處理可快速獲得純系，單倍體誘導(dǎo)技術(shù)能夠用于反向育種研究以及品種的遺傳改良。

關(guān)鍵詞：雙單倍體;油菜;遺傳育種;小孢子培養(yǎng);遺傳轉(zhuǎn)化;單倍體誘導(dǎo);數(shù)量性狀基因座（QTLs）;分子機制

中圖分類號： S634.303.2 ?文獻標志碼： A ?文章編號：1002-1302（2020）10-0038-08

收稿日期：2019-04-29

基金項目：中國博士后科學(xué)基金第65批面上資助項目（編號：2019M652726）;武漢市農(nóng)業(yè)科學(xué)院博士后項目。

作者簡介：萬麗麗（1982—），女，湖北武漢人，博士，農(nóng)藝師，主要從事油菜分子設(shè)計育種研究。E-mail：wanlili13226@163.com。

單倍體是含有單套染色體組的細胞或植株，由單倍體經(jīng)過染色體加倍后得到的二倍體被稱為雙單倍體（double haploid，DH）。單倍體或雙單倍體的獲得是單倍體育種的基礎(chǔ)，通?？梢酝ㄟ^不同的方法來誘導(dǎo)單倍體形成，如將植株離體的花藥或者分離的小孢子進行培養(yǎng)，形成胚狀體或者經(jīng)過愈傷組織脫分化成植株，或?qū)⒅参镂词芫呐咧榛蛘咦臃窟M行離體培養(yǎng)，使胚囊細胞發(fā)育成胚，繼而分化成單倍體植株。在油菜中應(yīng)用最為廣泛的單倍體誘導(dǎo)創(chuàng)建二倍體的技術(shù)體系是通過分離油菜花蕾中的單倍體小孢子，并對其進行加倍處理、成胚培養(yǎng)和胚性轉(zhuǎn)換成苗，最終獲得雙單倍體植株的過程。單倍體誘導(dǎo)小孢子胚發(fā)生途徑主要受供體植物的基因型、生長環(huán)境、選擇的小孢子發(fā)育階段（如單核小孢子的胚發(fā)生能力最強）、樣品預(yù)處理方法、胚發(fā)生培養(yǎng)基組分以及小孢子培養(yǎng)的溫度和光照度的影響[1]。通過單倍體誘導(dǎo)所得到的雙單倍體的優(yōu)勢是基因型純合，通過其創(chuàng)建的群體能夠直接用于育種以及基因定位研究[2]。單倍體小孢子由于具有細胞類型一致性、體積小等優(yōu)點，適合基因突變和遺傳轉(zhuǎn)化研究。小孢子染色體加倍以及植株再生的試驗體系等重要因素決定了雙單倍體的創(chuàng)建能否成功。大量研究表明，單倍體以及雙單倍體技術(shù)已成為植物尤其是蕓薹屬植物遺傳學(xué)和基因組學(xué)研究的重要工具[3-8]。DH育種技術(shù)目前已經(jīng)被用于超過250種作物的育種過程，為植物的遺傳研究和品種選育提供了有利條件。近年來，研究者們對玉米單倍體誘導(dǎo)系的分子機制進行了大量研究，并在模式作物擬南芥中開發(fā)了著絲粒介導(dǎo)染色體消失的技術(shù)，通過修飾著絲粒相關(guān)蛋白質(zhì)的重要基因，使得轉(zhuǎn)基因親本的染色體被選擇性丟失，進而誘導(dǎo)出父本或者母本單倍體[9]。這些基因廣泛存在于真核生物中，理論上在作物中應(yīng)用著絲粒介導(dǎo)法能夠產(chǎn)生單倍體后代。

1 小孢子誘導(dǎo)單倍體創(chuàng)建DH系的應(yīng)用現(xiàn)狀

1.1 小孢子誘導(dǎo)獲得的雙單倍體在油菜育種中的應(yīng)用

通過雙單倍體技術(shù)創(chuàng)建油菜DH系受到小孢子胚發(fā)生能力、小孢子對有絲分裂抑制劑（加倍劑）的敏感性和胚再生成苗能力等3個因素的影響。由于不同基因型材料受以上3個因素的影響且遺傳模式存在顯著差異，研究人員對不同基因型材料探索出不同的試驗條件，以獲得較高的加倍成苗率[10-12]。為進一步優(yōu)化雙單倍體技術(shù)，研究者們挖掘了在小孢子培養(yǎng)過程中表現(xiàn)再生能力強的株系作為育種研究的供體。Ferrie等在甘藍型油菜中通過小孢子培養(yǎng)獲得了胚再生能力強的品種Topas DH系用于育種[13]。在自花授粉或者常異花授粉作物中培育新品種需要10年時間，自交授粉6代也只能獲得98%的純合率;而通過創(chuàng)建DH系能將育種時間縮短至3～4年，且基因型純合率為100%。在開放授粉作物中，DH植株可以作為親本自交系用于雜交種制種。此外，構(gòu)建DH系能夠固定重要性狀以及定位顯性和隱性基因或在一個較小群體中進行選擇研究。Dirks等利用DH系群體進行反向育種（reverse breeding，RB）[14]，這種育種方法可以從雜交種中分離得到不同來源的親本材料，但是這種方法并不能完全有效地應(yīng)用到育種程序中，因為有利的基因重組伴隨著不利的連鎖累贅，且DH技術(shù)受到基因型和物種的限制[15]。Thomas等總結(jié)了12種作物中的200個DH商業(yè)種信息，其中甘藍型油菜有49個栽培種，芥菜型油菜中有2個栽培種[16]。目前加拿大育種單位利用DH技術(shù)選育出了雙低優(yōu)質(zhì)油菜品種?？傊?，DH技術(shù)在植物遺傳研究和品種選育中的優(yōu)勢表現(xiàn)在以下幾個方面：（1）顯著縮短育種周期。傳統(tǒng)育種須要連續(xù)自交多個世代才能選育出純合度高達99%的自交系。（2）簡化育種流程。通過DH技術(shù)的應(yīng)用，減少了純系選育所需要的時間、人力資源，降低了成本。（3）提高選育效率。通過結(jié)合分子標記輔助選擇技術(shù)和加代繁育技術(shù)提高了選育的效率。（4）符合植物新品種保護中植物新品種測試（DUS測試）的品種要求。對通過優(yōu)勢組合構(gòu)建的DH群體進行直接評價，能夠獲得符合品種獨特性、一致性和穩(wěn)定性測試要求的優(yōu)勢組合。

此外，研究人員采用小孢子成胚率高的油菜品種Topas和成胚率低的品種Westar構(gòu)建了F2代群體和2個DH群體，分子標記分析結(jié)果顯示，在DH群體中與Topas成胚率高的等位基因連鎖的標記表現(xiàn)為偏分離，而在F2代群體中沒有這種現(xiàn)象，這可能是由于在DH群體中，等位基因高度純合化，導(dǎo)致隱性致死基因大量表達，進而出現(xiàn)較高的偏分離比例[47]。Cloutier等發(fā)現(xiàn)，定位在第1條連鎖群（LG1）和第18條連鎖群（LG18）上的標記在2個DH群體中與Topas等位基因偏分離，而在F2代群體中符合孟德爾分離比例，由此推測在LG1和LG18上的部分染色體區(qū)段與小孢子胚發(fā)生能力相關(guān)[48]。同樣的現(xiàn)象也發(fā)生在采用大白菜Homei09（產(chǎn)胚力高）和蘿卜Siloga S2（產(chǎn)胚能力低）構(gòu)建的DH群體和F2代群體的RAPD標記分析試驗中，在6個連鎖群中，與Homei09等位基因連鎖標記發(fā)生偏分離，而在2個連鎖群中，與Siloga S2等位基因連鎖的標記發(fā)生偏分離;對F2代群體進行分析發(fā)現(xiàn)，來自Homei 09的優(yōu)良等位基因并沒有總是表現(xiàn)出與較高胚發(fā)生頻率相關(guān)[49]。有研究者采用花椰菜DH系（early big）和DH rapid cycling（TO1000DH3）構(gòu)建DH群體并對其進行分析，發(fā)現(xiàn)了139個與產(chǎn)胚能力相關(guān)的標記，其中分布在C1、C2、C4、C5和C7染色體上的77個位點與產(chǎn)胚率低的性狀相關(guān);與產(chǎn)胚率高的性狀相關(guān)的62個位點分布在C3、C6、C8染色體上[15，50]。研究人員認為，與小孢子胚發(fā)生相關(guān)的標記能夠用于胚再生能力性狀的遺傳選擇。實際上胚再生能力只是產(chǎn)胚能力的單一表現(xiàn)，而胚發(fā)生后秋水仙堿加倍以及直接再生成苗的過程也是雙單倍體育種的關(guān)鍵，所以要排除胚再生但不能成苗的表型，因此在偏分離標記與MDE表型相關(guān)性分析試驗中還需要考慮胚活力、加倍率和植株再生頻率3個因素的作用[51]。

研究者認為，在DH群體中偏分離標記可能與減數(shù)分裂早期遺傳因素控制的單核小孢子胚再生能力有關(guān)，如果在減數(shù)分裂過程中配子體發(fā)育受到抑制，那么在F2代群體和DH群體中會發(fā)生同樣的偏分離現(xiàn)象;此外在100多個DH系的出胚能力評估試驗中，由于小孢子發(fā)生與供體植株的生長狀態(tài)以及花蕾發(fā)育時期密切相關(guān)，導(dǎo)致統(tǒng)計上出錯的概率增加[52]。假設(shè)在DH群體中偏分離的標記位點與小孢子胚發(fā)生相關(guān)的基因是連鎖的，那么從雙親而來的DH群體中優(yōu)良等位基因組合的DH系與沒有聚合優(yōu)良等位基因的DH系比較，會表現(xiàn)出超高的小孢子胚發(fā)生頻率。研究人員結(jié)合之前發(fā)現(xiàn)的在DH群體中偏分離標記所在的基因組區(qū)段，在不同品種間構(gòu)建替換系，并驗證了這些區(qū)段與小孢子胚發(fā)生率的相關(guān)性。通過繁殖純合的品種間替換系使小孢子培養(yǎng)試驗獲得穩(wěn)定、準確、可重復(fù)的數(shù)據(jù)。分離F2代群體雖然能夠避免發(fā)生偏分離現(xiàn)象，但是F2代群體的高度雜合性使得表型考察結(jié)果不具有代表性，采用重組自交系能夠保證后代基因型純合，使小孢子胚發(fā)生能力的表型數(shù)據(jù)準確，此外通過關(guān)聯(lián)分析群體能夠在豐富的種質(zhì)資源群體中評估小孢子出胚能力[53-54]。

1.5 小孢子誘導(dǎo)單倍體發(fā)生途徑中關(guān)鍵基因的研究現(xiàn)狀

在單核小孢子向胚發(fā)育的過程中涉及很多基因的差異表達，這些基因參與的生物學(xué)功能主要分為3類，分別為脅迫誘導(dǎo)反應(yīng)途徑介導(dǎo)的胚性細胞發(fā)育轉(zhuǎn)變、起始細胞的分化、胚形態(tài)發(fā)生途徑。在甘藍型油菜小孢子培養(yǎng)試驗中，將單核小孢子置于42 ℃條件下脅迫處理2 d，促使與熱激反應(yīng)相關(guān)的基因表達;小孢子再生成胚的過程是單核小孢子終止了向正?；ǚ郯l(fā)育的程序，轉(zhuǎn)向成胚發(fā)育途徑，該過程涉及花粉發(fā)育中淀粉以及蔗糖等生物合成相關(guān)基因的下調(diào)表達[55]。對出胚率高和低的材料進行基因差異表達譜分析，挖掘出與胚發(fā)生頻率相關(guān)的基因（圖1），通過分析獲得的16個決定小孢子胚發(fā)生的關(guān)鍵基因發(fā)現(xiàn)，BnFUS3、BnLEC2、BnLEC1、BnUP1、BnUP2基因在小孢子誘導(dǎo)、發(fā)育以及合子胚發(fā)育時期表達，BnNAPIN、BnBBM1、BnFAD1、BnWOX9、BnABI3、BnATS1基因在胚誘導(dǎo)和發(fā)育階段以及根系中表達，BnLRR1、BnCP1、BnCYP78A、BnWOX2、BnCYP81F在發(fā)育的胚以及孢子體組織中表達，目前還沒有找到從小孢子向配子體（花粉）發(fā)育轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵基因。調(diào)控小孢子發(fā)生的大多數(shù)基因都是轉(zhuǎn)錄因子，如LEC1、LEC2、FUS3、ABI3、BBM1、WOX2和WOX9等。Malik等取培養(yǎng)3 d或 7 d 后產(chǎn)胚率高的Topas-DH4079和產(chǎn)胚率低的Allons、Westar以及Garrison等材料的小孢子研究基因表達譜，發(fā)現(xiàn)BnLEC1、BnLEC2、BnBBM1和BnUP1誘導(dǎo)模式與產(chǎn)胚率緊密相關(guān);異位表達分析結(jié)果表明，LEC1、LEC2和BBM1是體細胞組織中誘導(dǎo)胚發(fā)生的關(guān)鍵基因，LEC1、LEC2和FUS3是擬南芥合子胚和體細胞胚發(fā)生途徑中的關(guān)鍵基因;從胚再生能力低的油菜品種Westar中再生獲得4個DH系，這4個DH系具有比Westar材料更強的再生能力，且能夠穩(wěn)定遺傳[56-57]。通過分析胚發(fā)生相關(guān)基因在DH2家系與Westar材料中的表達模式發(fā)現(xiàn)，BnLEC1在Westar材料的小孢子培養(yǎng)中比DH2材料培養(yǎng)的1、3 d明顯推遲表達，BnLEC2、BnABI3、BnBBM1、BnUP1和BnWOX9的表達量在Westar品種小孢子培養(yǎng)的整個過程比DH2材料低。然而，花粉特異表達基因優(yōu)先在胚再生能力低的Westar品種中表達，結(jié)合油菜種子cDNA芯片數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)，在Westar和DH2材料熱處理7 d的小孢子中存在117個差異表達基因，其中部分差異表達基因可能由小孢子供體植株雜合基因型決定，或者是體細胞變異導(dǎo)致了基因功能的多方面改變。

油菜小孢子雄性單性生殖過程包含3個階段（1）胚性細胞發(fā)育途徑;（2）細胞起始分化;（3）小孢子胚形成過程。

2 單倍體誘導(dǎo)技術(shù)的研究現(xiàn)狀

2.1 單倍體誘導(dǎo)技術(shù)分子機制

首先在玉米中發(fā)現(xiàn)天然單倍體，之后對玉米自交系Stock6進行改良獲得一批優(yōu)良的玉米單倍體誘導(dǎo)系，誘導(dǎo)率高達11%～16%[58]。經(jīng)過研究其作用機理是雙受精完成后，原基細胞分裂前誘導(dǎo)系染色體逐漸消失而形成單倍體（圖2-A）[59-60]。Xu等發(fā)現(xiàn)，在授粉后7 d內(nèi)大部分誘導(dǎo)系的染色體被排出細胞外，初步確定了染色體選擇性消失的原因，另外在單倍體后代中發(fā)現(xiàn)了約44 Mb的父本染色體片段，證實了誘導(dǎo)系染色體發(fā)生滲入的過程[61]。為了開發(fā)出能夠在多數(shù)物種中都適用的單倍體誘導(dǎo)方法，近年來在模式植物擬南芥中采用著絲粒介導(dǎo)染色體消失的方法誘導(dǎo)單倍體，Cenh3（由CENH3在H3位點突變形成）是組蛋白H3的一個突變體，其特異性定位于著絲粒上，Dwivedi等通過對CENH3蛋白進行改造，如將CENH3的N末端用組蛋白H3的N末端代替，或?qū)ENH3蛋白進行點突變以及用其他類型的突變體進行替代等使得CENH3異位著陸形成雙著絲粒染色體，導(dǎo)致染色體在分離的時候發(fā)生斷裂[62]。擬南芥Cenh3突變體具有致死性，利用組蛋白H3的N末端尾部替換CENH3的N末端尾部，同時將綠色熒光蛋白（GFP）添加到N端終點，形成的GFPtailswap蛋白，定位于著絲粒上，該結(jié)構(gòu)克服了Cenh3突變體的致死表型。利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)獲得GFPtailswap Cenh3-/-基因型植株，該植株雄性不育但是能夠產(chǎn)生少量花粉，作為父本與野生型進行雜交能夠產(chǎn)生5%的母本單倍體，作為母本與野生型進行雜交能夠產(chǎn)生25%～50%的父本單倍體（圖2-B）。雖然GFPtailswap技術(shù)過程是含有轉(zhuǎn)基因事件的，但所得的單倍體植株的基因都來源于非轉(zhuǎn)基因的親本，不含有轉(zhuǎn)基因成分。CENH3在不同物種中存在進化的保守性，因而可以通過對油菜等近緣物種的CENH3基因進行修飾來獲得單倍體誘導(dǎo)系。

2.2 單倍體誘導(dǎo)技術(shù)的應(yīng)用前景

CENH3介導(dǎo)的單倍體誘導(dǎo)相比目前單倍體誘導(dǎo)方法的優(yōu)勢在于不須要經(jīng)過組織培養(yǎng)的過程，能夠避免組織培養(yǎng)中小孢子胚的發(fā)生過程受限于植株基因型?；ǚ叟囵B(yǎng)產(chǎn)生來源于父本的單倍體，雌蕊培養(yǎng)產(chǎn)生來源于母本的單倍體。而單倍體誘導(dǎo)系統(tǒng)既可用于父本又可用于母本單倍體的誘導(dǎo)。單倍體誘導(dǎo)系能夠用于細胞質(zhì)雄性不育（cytoplasmic male sterility，CMS）系的背景改良，比如具有CMS遺傳背景的單倍體誘導(dǎo)系作為母本與不同基因型的材料進行雜交所得到的單倍體后代具有母本的CMS遺傳背景。雖然單倍體誘導(dǎo)系是轉(zhuǎn)基因材料，但是雜交后所得到的單倍體是非轉(zhuǎn)基因材料，能夠直接應(yīng)用于植物育種。此外，單倍體誘導(dǎo)技術(shù)能夠用于反向育種的研究，2012年Wijnker等將擬南芥Landsberg和Columbia 2種生態(tài)型F1代雜交種中決定減數(shù)分裂交換的DMC1基因進行突變，使得雜交種重組抑制[63]。采用單倍體誘導(dǎo)系與雜交種進行雜交得到單倍體，加倍后獲得雙單倍體。對含有不同親本染色體組合的雙單倍體進行基因分型，選擇不同親本染色體的組合進行性狀考察，可確定原始雜交種的類別。油菜與擬南芥屬于近緣種，通過GFPtailswap技術(shù)創(chuàng)建油菜單倍體誘導(dǎo)系，能夠重現(xiàn)優(yōu)勢雜交油菜品種的親本基因型。

3 展望

從20世紀60年代單倍體誘導(dǎo)創(chuàng)建二倍體技術(shù)體系建立以來，研究者們不斷致力于體系改進，以提高效率。隨著在育種過程中的不斷實踐，該技術(shù)體系在遺傳轉(zhuǎn)化以及基因組研究等領(lǐng)域的應(yīng)用不斷拓展，與此同時，人們對其提出了更高的要求，建立適用性更廣泛、效率更高的技術(shù)體系是目前研究的重點。

前人利用單倍體誘導(dǎo)創(chuàng)建二倍體的技術(shù)創(chuàng)建了不同的DH群體，并分別定位了小孢子胚再生途徑的主效QTL，同時通過比較基因組學(xué)挖掘出大量在小孢子胚發(fā)生過程中的相關(guān)基因，將這些基因與QTL定位區(qū)間進行比較，可以快速獲得油菜小孢子誘導(dǎo)胚發(fā)生的關(guān)鍵基因。由于甘藍型油菜基因組復(fù)雜，數(shù)量性狀控制基因的圖位克隆進展緩慢，同源基因的拷貝數(shù)較多，阻礙了差異表達基因與定位區(qū)間的匹配。目前可以利用白菜、甘藍和甘藍型油菜的基因組比對，篩選出更為準確的候選基因。此外，基于華中農(nóng)業(yè)大學(xué)建立的60K SNP芯片檢測平臺，利用與油菜重要性狀關(guān)聯(lián)的分子標記，加快重要農(nóng)藝性狀關(guān)鍵基因的克隆。如果利用分子設(shè)計育種方法將與小孢子胚發(fā)生途徑相關(guān)的基因組區(qū)間與控制油菜產(chǎn)量以及含油量的位點關(guān)聯(lián)，則可以在對小孢子胚發(fā)生、秋水仙堿誘導(dǎo)染色體加倍以及誘導(dǎo)小孢子直接成苗等3個關(guān)鍵步驟進行改良的同時，快速獲得油菜栽培種或者育種材料。隨著模式植物擬南芥單倍體誘導(dǎo)系統(tǒng)的創(chuàng)建和完善，在油菜中開發(fā)的著絲粒蛋白修飾介導(dǎo)的單倍體誘導(dǎo)系統(tǒng)可被用于不同細胞質(zhì)來源親本的改良以及反向育種研究。

參考文獻：

[1]Ferrie A M R，Caswell K L. Isolated microspore culture techniques and recent progress for haploid and doubled haploid plant production[J]. Plant Cell Tissue and Organ Culture，2011，104（3）：301-309.

[2]Szarejko I，F(xiàn)orster B P. Doubled haploidy and induced mutation[J]. Euphytica，2007，158（3）：359-370.

[3]Custers J B M. Microspore culture in rapeseed （Brassica napus L.）[M]. Dordrecht：Springer Netherlands，2003.

[4]da Silva D J C.Protocol for broccoli microspore culture[M]. Dordrecht：Springer Netherlands，2003.

[5]Ferrie A. Microspore culture of Brassica species[M]. Dordrecht：Springer Netherlands，2003.

[6]Ferrie A M R，Keller W A. Optimization of methods for using polyethylene glycol as a non-permeating osmoticum for the induction of microspore embryogenesis in the Brassicaceae[J]. In Vitro Cellular & Developmental Biology Plant，2007，43（4）：348-355.

[7]Friedt W，Zarhloul M K. Haploids in the improvement of Crucifers[M]. Berlin：Springer，2005.

[8]Hansen M. Protocol for microspore culture in Brassica[M]. Dordrecht：Springer Netherlands，2003.

[9]Ravi M，Chan S W L. Haploid plants produced by centromere-mediated genome elimination[J]. Nature，2010，464（7288）：615-618.

[10]Barro F，Martín A. Response of different genotypes of Brassica carinata to microspore culture[J]. Plant Breeding，2008，118（1）：79-81.

[11]Siebel J，Pauls K P. A comparison of anther and microspore culture as a breeding tool in Brassica napus[J]. Theoretical and Applied Genetics，1989，78（4）：473-479.

[12]Takahata Y，F(xiàn)ukuoka H，Wakui K. Utilization of microspore-derived embryos[M]//Biotechnology in Agriculture and Forestry，2005.

[13]Ferrie A M R，Palmer C E，Keller W A. Haploid embryogenesis[M]//Thorpe T A. In vitro embryogenesis in plants. Dordrecht：Kluwer Academic Publishers，1995：309-344.

[14]Dirks R，van Dun K，de Snoo C B，et al. Reverse breeding：a novel breeding approach based on engineered meiosis[J]. Plant Biotechnology Journal，2009，7（9）：837-845.

[15]Pink D，Bailey L，McClement S，et al. Double haploids，markers and QTL analysis in vegetable brassicas[J]. Euphytica，2008，164（2）：509-514.

[16]Thomas W T B，F(xiàn)orster B P，Gertsson B. Doubled haploids in breeding[M]. Dordrecht：Springer Netherlands，2003.

[17]Maluszynski M. Officially released mutant varieties — The FAO/IAEA database[J]. Plant Cell Tissue and Organ Culture，2001，65（3）：175-177.

[18]Ferrie A M R，Taylor D C，Mackenzie S L，et al. Microspore mutagenesis of Brassica species for fatty acid modifications：a preliminary evaluation[J]. Plant Breeding，2008，127（5）：501-506.

[19]Barro F，F(xiàn)ernandezescobar J，Mdela V，et al. Modification of glucosinolate and erucic acid contents in doubled haploid lines of Brassica carinata by UV treatment of isolated microspores[J]. Euphytica，2003，129：1-6.

[20]Beaith M E，F(xiàn)letcher R S，Kott L S. Reduction of saturated fats by mutagenesis and heat selection in Brassica napus L.[J]. Euphytica，2005，144：1-9.

[21]Sonntag K，Rudloff E. Microspore mutagenesis in transgenic oilseed rape for the modification of fatty-acid composition[J]. Acta Universitatis Latviensis Biology，2004，676：227-230.

[22]Barro F，F(xiàn)ernandez-Escobar J，de la Vega M，et al. Doubled haploid lines of Brassica carinata with modified erucic acid content through mutagenesis by EMS treatment of isolated microspores[J]. Plant Breeding，2008，120（3）：262-264.

[23]McClinchey S L，Kott L S. Production of mutants with high cold tolerance in spring canola （Brassica napus）[J]. Euphytica，2008，162（1）：51-67.

[24]Liu S，Wang H，Zhang J，et al. In vitro mutation and selection of doubled-haploid Brassica napus lines with improved resistance to Sclerotinia sclerotiorum[J]. Plant Cell Reports，2005，24（3）：133-144.

[25]Beversdorf W D，Kott L S. An in vitro mutagenesis/selection system for Brassica napus[J]. Iowa State Journal of Research，1987（4）：435-443.

[26]Xu L，Najeeb U，Naeem M S，et al. In vitro mutagenesis and genetic improvement[M]. New York：Springer，2012.

[27]Yun H E，Wan G，Chen S，et al. Effects of mutagenic treatments of isolated microspores and microspore-derived embryos on embryogenesis and plant regeneration in oilseed rape[C]//International Rapeseed Congress，2007.

[28]Dormann M，Oelck M，Wang H M. Transformed embryogenic microspores for the generation of fertile homozygous plants：USA，6316694[P]. 2001-11-13.

[29]Fukuoka H，Ogawa T，Matsuoka M，et al. Direct gene delivery into isolated microspores of rapeseed （Brassica napus L.） and the production of fertile transgenic plants[J]. Plant Cell Reports，1998，17：323-328.

[30]Guerche P，Charbonnier M，Jouanin L，et al. Direct gene transfer by electroporation in Brassica napus[J]. Plant Science，1987，52（1/2）：111-116.

[31]Jardinaud M F，Souvré A，Alibert G. Transient GUS gene expression in Brassica napus electroporated microspores[J]. Plant Science，1993，93：177-184.

[32]Jones-Villeneuve E，Huang B，Prudhomme I，et al. Assessment of microinjection for introducing DNA into uninuclear microspores of rapeseed[J]. Plant Cell Tissue & Organ Culture，1995，40（4）：97-100.

[33]Nehlin L，Mllers C，Bergman P，et al. Transient β-gus and gfp gene expression and viability analysis of microprojectile bombarded microspores of Brassica napus L.[J]. Journal of Plant Physiology，2000，156（2）：175-183.

[34]Pechan P M. Successful cocultivation of Brassica napus microspores and proembryos with Agrobacterium[J]. Plant Cell Reports，1989，8（7）：387.

[35]Abdollahi M R，Moieni A，Salmanian A H，et al. Secondary embryogenesis and transient expression of the β-glucuronidase gene in hypocotyls of rapeseed microspore-derived embryos[J]. Biologia Plantarum，2009，53（3）：573-577.

[36]Chugh A，Amundsen E，Eudes F. Translocation of cell-penetrating peptides and delivery of their cargoes in triticale microspores[J]. Plant Cell Reports，2009，28（5）：801-810.

[37]Chen J L，Beversdorf W D. A combined use of microprojectile bombardment and DNA imbibition enhances transformation frequency of canola （Brassica napus L.）[J]. Theoretical & Applied Genetics，1994，88（2）：187.

[38]Huang B. Genetic manipulation of microspores and microspore-derived embryos[J]. Vitro Plant，1992，28：53-58.

[39]Neuhaus G，Spangenberg G，Scheid O M，et al. Transgenic rapeseed plants obtained by the microinjection of DNA into microspore-derived embryoids[J]. Theoretical & Applied Genetics，1987，75（1）：30-36.

[40]Swanson E B，Erickson L R. Haploid transformation in Brassica napus using an octopine-producing strain of Agrobacterium tumefaciens[J]. Theoretical & Applied Genetics，1989，78（6）：831-835.

[41]Abdollahi M R，Moieni A，Mousavi A，et al. High frequency production of rapeseed transgenic plants via combination of microprojectile bombardment and secondary embryogenesis of microspore-derived embryos[J]. Molecular Biology Reports，2011，38（2）：711-719.

[42]Cegielska-Taras T，Pniewski T，Szaa L. Transformation of microspore-derived embryos of winter oilseed rape （Brassica napus L.） by using Agrobacterium tumefaciens[J]. Journal of Applied Genetics，2008，49（4）：343-347.

[43]hman I M，Kazachkova N I，Kamnert I M，et al. Characterisation of transgenic oilseed rape expressing pea lectin in anthers for improved resistance to pollen beetle[J]. Euphytica，2006，151（3）：321-330.

[44]Reiss E，Schubert J，Scholze P，et al. The barley thaumatin-like protein Hv-TLP8 enhances resistance of oilseed rape plants to Plasmodiophora brassicae[J]. Plant Breeding，2010，128（2）：210-212.

[45]Zhang F L，Takahata Y. Inheritance of microspore embryogenic ability in Brassica crops[J]. Theoretical & Applied Genetics，2001，103（2/3）：254-258.

[46]Zhang F，Aoki S，Takahata Y. RAPD markers linked to microspore embryogenic ability in Brassica crops[J]. Euphytica，2003，131（2）：207-213.

[47]Wan Y，Rocheford T R，Widholm J M. RFLP analysis to identify putative chromosomal regions involved in the anther culture response and callus formation of maize[J]. Theoretical & Applied Genetics，1992，85（2/3）：360-365.

[48]Cloutier S，Cappadocia M，Landry B S. Study of microspore-culture responsiveness in oilseed rape （Brassica napus L.） by comparative mapping of a F2 population and two microspore-derived populations[J]. Theoretical & Applied Genetics，1995，91（6/7）：841-847.

[49]Ajisaka H，Kuginuki Y，Shiratori M，et al. Mapping loci affecting the cultural efficiency of microspore culture of Brassica rapa L. syn. campestris L. using DNA polymorphism[J]. Breed Sci，1999，49（3）：187-192.

[50]Iniguez-Luy F L，Lukens L，F(xiàn)arnham M W，et al. Development of public immortal mapping populations，molecular markers and linkage maps for rapid cycling Brassica rapa and B. oleracea[J]. Theoretical & Applied Genetics，2009，120（1）：31-43.

[51]Ujjalkumar N，Mohammedcm I，Christian M. Early，non-destructive selection of microspore-derived embryo genotypes in oilseed rape （Brassica napus L.） by molecular markers and oil quality analysis[J]. Molecular Breeding，2007，19（3）：285-289.

[52]Kitashiba H，Taguchi K，Kaneko I，et al. Identification of loci associated with embryo yield in microspore culture of Brassica rapa by segregation distortion analysis[J]. Plant Cell Reports，2016，35（10）：2197-2204.

[53]Ecke W，Clemens R，Honsdorf N，et al. Extent and structure of linkage disequilibrium in canola quality winter rapeseed （Brassica napus L.）[J]. Theoretical & Applied Genetics，2010，120（5）：921-931.

[54]Hasan M，F(xiàn)riedt W，Ponskühnemann J，et al. Association of gene-linked SSR markers to seed glucosinolate content in oilseed rape （Brassica napus ssp. napus）[J]. Theoretical & Applied Genetics，2008，116（8）：1035-1049.

[55]Maraschin S F，de Priester W，Spaink H P，et al. Androgenic switch：an example of plant embryogenesis from the male gametophyte perspective[J]. Journal of Experimental Botany，2005，56（417）：1711-1726.

[56]Malik M R，Wang F，Dirpaul J M，et al. Transcript profiling and identification of molecular markers for early microspore embryogenesis in Brassica napus[J]. Plant Physiology，2007，144（1）：134-154.

[57]Malik M R，Wang F，Dirpaul J M，et al. Isolation of an embryogenic line from non-embryogenic Brassica napus cv. Westar through microspore embryogenesis[J]. Journal of Experimental Botany，2008，59（10）：2857-2873.

[58]Rotarenco V，Dicu G，State D，et al. New inducers of maternal haploids in maize[J]. Maize Genet Coop Newslett，2010，84：1-7.

[59]Britt A B，Kuppu S. Cenh3：an emerging player in haploid induction technology[J]. Front. Plant Sci，2016，7，357.

[60]Watts A，Kumar V，Bhat S R. Centromeric histone H3 protein：from basic study to plant breeding applications[J]. Plant Biochem，Biotechnol，2016，25：339-348.

[61]Xu X W，Li L，Dong X，et al. Gametophytic and zygotic selection leads to segregation distortion through in vivo induction of a maternal haploid in maize[J]. J Exp Bot，2013，64（4）：1083-1096.

[62]Dwivedi S L，Britt A B，Tripathi L，et al. Haploids：constraints and opportunities in plant breeding[J]. Biotechnol Adv，2015，33（6）：812-829.

[63]Wijnker E，van Dun K，de Snoo C B，et al. Reverse breeding in Arabidopsis thaliana generates homozygous parental lines from a heterozygous plant[J]. Nature Genetics，2012，44（4）：467-470.