專一性酶解-高效液相色譜-熒光檢測法測定3種食用油中4種多環(huán)芳烴

章再婷，楊 燕，王永健，王春芳?，李 雙，陳樹兵，曹國洲

(1.寧波中盛產(chǎn)品檢測有限公司，寧波 315012；2.寧波海關(guān)技術(shù)中心，寧波 315012)

多環(huán)芳烴(PAHs)作為一類強(qiáng)致癌性化合物，主要來源于反復(fù)使用或高溫油炸的非正常食用油中[1-2]。苯并[a]蒽(Ba A)、苯并[b]熒蒽(BbF)、苯并[k]熒蒽(Bk F)和苯并[a]芘(BaP)是毒性較強(qiáng)的4種PAHs，其中BaP被國際癌癥研究機(jī)構(gòu)歸為1類致癌物，其余3種被歸為2B 類致癌物[3-5]。受暴利的驅(qū)使，非正常食用油越來越頻繁的出現(xiàn)在人們的生活中，對人們的身體健康造成巨大的威脅，是國家嚴(yán)厲打擊的食品違法行為的對象。因此，建立能夠快速同時(shí)測定食用油中這4 種PAHs含量的方法尤為重要。

目前建立的食用油中單一或多個(gè)PAHs的快速篩查方法主要涉及兩方面內(nèi)容:前處理方法和儀器分析方法。儀器分析方法包括液相色譜-熒光檢測法(LC-FLD)、氣相色譜-氫火焰離子化檢測法(GC-FID)、氣相色譜-質(zhì)譜法(GC-MS)和液相色譜-質(zhì)譜法(LC-MS)等[6-13]。其中，GC-MS 和LC-MS對前處理凈化條件要求比較嚴(yán)格，油脂的離子化抑制效應(yīng)明顯，其回收率及穩(wěn)定性均劣于LC-FLD 和GC-FID 的。由于4 種上述PAHs均具有多環(huán)結(jié)構(gòu)，LC-FLD 的專一性更強(qiáng)，其對加工處理的或按照比例滲入的食用油的檢出限均能達(dá)到ng·kg－1級，更適用于食用油中微量化合物的鑒別分析。前處理方法主要包括基質(zhì)分散萃取法(Qu ECh ERS等)，固相萃取法(HLB小柱、中性氧化鋁柱等)和凝膠滲透色譜法(GPC)等[6-13]。其中固相萃取法中是通過氫鍵作用將待測物保留在吸附劑上，其雖能有效除去油脂基質(zhì)，但操作過程繁瑣耗時(shí)、重現(xiàn)性差。文獻(xiàn)[8]建立了地溝油中BaP含量檢測的Oasis HLB小柱凈化方法，但該方法對于含有多個(gè)環(huán)狀結(jié)構(gòu)的親脂性待測物的回收率不高；GPC雖具備自動(dòng)化優(yōu)勢，但單樣凈化耗時(shí)較長(3 h)，且消耗有機(jī)溶劑較多，試驗(yàn)成本高。油脂中親脂性待測物的快速、高效提取，是食用油中PAHs含量檢測面臨的一個(gè)艱巨挑戰(zhàn)。

目前，脂肪酶酶解技術(shù)主要應(yīng)用于營養(yǎng)成分分析，如脂肪酸及各種維生素的檢測，在食品添加劑及有毒有害物質(zhì)檢測方面應(yīng)用甚少。本工作根據(jù)這4種PAHs的多環(huán)結(jié)構(gòu)和食用油基質(zhì)中高脂肪含量的特點(diǎn)，前處理采用專一性酶解法處理樣品，采用高效液相色譜-熒光檢測法(HPLC-FLD)對樣品提取液中Ba A、Bb F、Bk F 和BaF 等4種PAHs的含量進(jìn)行了測定，以期為提高政府監(jiān)管部門的監(jiān)管工作效率，保證食品安全提供了基礎(chǔ)。

1 試驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

LC-20AT 型高效液相色譜儀，配熒光檢測器；Milli-Q 型高純水發(fā)生器；SF-40R 型冷凍離心機(jī)；TKA 型漩渦振動(dòng)器；Hei-VAP Expert型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀；DK-S28型電熱恒溫水浴鍋；0.22μm 尼龍濾膜。

單標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液:取0.01 g單標(biāo)準(zhǔn)品，用二氯甲烷溶解，轉(zhuǎn)移至10 mL 的容量瓶中，用乙腈稀釋至刻度，得到1.0 g·L－1的單標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液，于－20 ℃下保存。

磷酸鹽緩沖溶液:0.108 g·mL－1，稱取54 g的磷酸二氫鉀，用500 mL 水溶解，氫氧化鉀調(diào)至p H為8.0。

混合標(biāo)準(zhǔn)溶液:稱取4種PAHs的單標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液各10μL，用乙腈定容至10.0 mL，配制成1.0 mg·L－1標(biāo)準(zhǔn)溶液，于－20 ℃避光保存。

混合標(biāo)準(zhǔn)溶液系列:稱取適量混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，用乙腈稀釋至刻度，配制0，0.1，0.5，1.0，2.0，5.0μg·L－1的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液系列。

Ba A、Bb F、Bk F 和BaF 的純度不小于95%；脂肪酶的酶活性大于700 U·mg－1。

正己烷、乙腈、二氯甲烷、乙醇均為色譜純；其他試劑為分析純；試驗(yàn)用水為超純水(電阻率18.2ΩM·cm)。

動(dòng)物油、植物油和煎炸油等3種常見食用油來自國家殘留監(jiān)控抽樣和進(jìn)出口送檢企業(yè)。

1.2 儀器工作條件

Dikma Plus C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5.0μm)，柱溫40 ℃；流動(dòng)相:A 為水，B 為乙腈；流量1.0 mL·min－1；進(jìn)樣量20μL；梯度洗脫程序見表1。0～10 min時(shí)，Ba A 的熒光激發(fā)波長(λex)為270 nm，發(fā)射波長(λem)為380 nm；10～20 min時(shí)，Bb F、Bk F和BaP的λex為294 nm，λem為406 nm。

表1 梯度洗脫程序Tab.1 Program of gradient elution

1.3 試驗(yàn)方法

稱取2.0 g樣品，依次加入5 mL磷酸鹽緩沖溶液(pH 8.0)和0.2 g脂肪酶，恒溫(37±2)℃振蕩酶解2 h。加入1.0 g碳酸鉀，5 mL 乙醇，渦旋混勻。在提取溶液中加入15 mL 正己烷，5 mL 水，振蕩5 min，以4 500 r·min－1轉(zhuǎn)速離心5 min，取下層水相按上述步驟重復(fù)萃取一次。合并萃取液，于40 ℃旋蒸至干，用1.0 mL乙腈復(fù)溶，過0.22μm 濾膜，濾液按照儀器工作條件進(jìn)行測定。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜行為

按照儀器工作條件，對5.0μg·L－1混合標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行測定，色譜圖見圖1。Ba A、BbF、Bk F和BaP的保留時(shí)間分別為9.3，12.0，12.6，13.9 min。

圖1 4種PAHs混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的色譜圖Fig.1 Chromatogram of mixed standard solution of the 4 PAHs

2.2 脂肪酶、酶解時(shí)間及碳酸鉀用量的選擇

針對食用油特殊基質(zhì)成分和4 種PAHs的弱極性性質(zhì)，試驗(yàn)采用專一性脂肪酶處理樣品，緩沖溶液選擇磷酸二氫鉀緩沖溶液(pH 8.0)，整個(gè)酶解過程溫度控制在(37±2)℃，此條件可以在保證酶活性的同時(shí)，又可以降低基質(zhì)中脂肪的干擾。皂化反應(yīng)經(jīng)常用來去除油脂，其通常在濃堿環(huán)境下進(jìn)行(氫氧化鉀或氫氧化鈉等強(qiáng)堿性化合物)，但在此環(huán)境中，待測化合物的結(jié)構(gòu)極易被破壞，且有機(jī)相中殘留的強(qiáng)堿性化合物需多次水洗才可以消除，不可避免的造成待測化合物的損失、檢測時(shí)間的加長和檢測成本的增加。因此，本工作采用碳酸鉀進(jìn)行皂化反應(yīng)，碳酸鉀不僅可以提供弱堿性環(huán)境和終止酶解反應(yīng)，還可以皂化油脂，確保最大的除油率，除油率(X)可通過測量氮吹充分后殘余油脂的精確質(zhì)量值計(jì)算:

式中:m X是指經(jīng)脂肪酶水解和碳酸鉀皂化除油后的殘余油脂質(zhì)量，g；m0是指未經(jīng)任何處理的殘余油脂質(zhì)量，g；X，%。

脂肪酶用量以及酶解時(shí)間都與除油率相關(guān)聯(lián)。試驗(yàn)考察了脂肪酶用量分別為0.05，0.1，0.2，0.5，1.0 g，酶解時(shí)間分別為1.0，2.0，3.0，5.0 h時(shí)對動(dòng)物油、植物油和經(jīng)用于煎炸的食用油(煎炸油)等3種常見食用油除油率的影響。

圖2 脂肪酶用量、酶解時(shí)間對3種食用油除油率的影響Fig.2 Effect of the amount of lipase and time of enzymolysis on the rate of oil-removal of the 3 edible oils

由圖2可知:當(dāng)脂肪酶用量為0.05 g和0.1 g時(shí)，除油率受酶解時(shí)間影響較大，此時(shí)，酶解時(shí)間大于等于2.0 h的除油率較1.0 h的明顯增加，但均低于80%；當(dāng)脂肪酶用量大于0.1 g 時(shí)，酶解時(shí)間2.0 h的除油率明顯高于1.0 h的，但2.0，3.0，5.0 h的除油率差別很小。從節(jié)約時(shí)間和成本的角度出發(fā)，試驗(yàn)選擇脂肪酶用量為0.2 g，酶解時(shí)間為2.0 h。

試驗(yàn)還考察了碳酸鉀用量分別為0，0.5，1.0，2.0 g時(shí)對除油率的影響。

圖3 碳酸鉀用量對3種食用油除油率的影響Fig.3 Effect of the amount of K2 CO3 added on the rate of oil-removal of the 3 edible oil samples

由圖3可知:當(dāng)碳酸鉀的用量不大于1.0 g時(shí)，除油率隨著碳酸鉀用量的增加而增加；當(dāng)碳酸鉀用量為1.0 g 時(shí)，除油率達(dá)到最大區(qū)間(98.1%～99.8%)；碳酸鉀用量為2.0 g時(shí)，除油率反而降低，推測可能是由于過量的碳酸鉀造成了過堿環(huán)境，破壞了酶的活性進(jìn)而降低了除油效率。因此，試驗(yàn)選擇碳酸鉀的用量為1.0 g。

2.3 乙醇和正己烷用量的選擇

萃取前，在待皂化的樣品溶液中加入適量乙醇可以有效防止乳化現(xiàn)象的發(fā)生，此外，乙醇還能起到預(yù)萃取的作用。同時(shí)，4種PAHs屬于弱極性化合物，萃取劑正己烷的用量對其回收率的影響較大。因此，試驗(yàn)考察了乙醇用量分別為2.5，5，10，15 mL，正己烷用量分別為15，30，45 mL時(shí)對混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的添加量為0.1μg·kg－1的動(dòng)物油、植物油和煎炸油等3類常見食用油中4種PAHs回收率的影響，試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)乙醇用量為2.5 mL時(shí)，體系乳化現(xiàn)象仍嚴(yán)重，無法計(jì)算回收率，其余結(jié)果見表2～表5。

表2 不同乙醇和正己烷用量下3種常見食用油中BaA回收試驗(yàn)結(jié)果Tab.2 Results of test for recovery of BaA in the 3 edible oils with different amounts of ethanol and n-hexane

表3 不同乙醇和正己烷用量下3種常見食用油中BbF回收試驗(yàn)結(jié)果Tab.3 Results of test for recovery of BbF in the 3 edible oils with different amounts of ethanol and n-hexane

表4 不同乙醇和正己烷用量下3種常見食用油中BkF回收試驗(yàn)結(jié)果Tab.4 Results of test for recovery of Bk F in the 3 edible oils with different amounts of ethanol and n-hexane

由表2～表5結(jié)果可知:正己烷用量為15 mL時(shí)，4種PAHs的回收率較低，均低于77%；當(dāng)正己烷用量為30 mL和45 mL 時(shí)，回收率趨于穩(wěn)定，均能達(dá)到90%以上。當(dāng)乙醇用量不小于5 mL 時(shí)，4種PAHs回收率相差不大，而乙醇用量為5 mL時(shí)即可保持液-液界面清晰消除乳化現(xiàn)象。從節(jié)約濃縮時(shí)間和成本的角度出發(fā)，試驗(yàn)選擇的乙醇用量為5 mL，正己烷用量為30 mL。

表5 不同乙醇和正己烷用量下3種常見食用油中BaP回收試驗(yàn)結(jié)果Tab.5 Results of test for recovery of BaP in the 3 edible oils with different amounts of ethanol and n-hexane

2.4 流動(dòng)相及色譜柱的選擇

采用液相色譜檢測目標(biāo)化合物時(shí)，經(jīng)常在流動(dòng)相中加入緩沖鹽以增加儀器的響應(yīng)靈敏度，但緩沖鹽的大量長期使用會(huì)對儀器造成損害。試驗(yàn)考察了分別以甲醇-水和乙腈-水體系作流動(dòng)相時(shí)對4 種PAHs的色譜行為的影響。結(jié)果表明:乙腈-水體系柱壓更低、安全性好，所以，試驗(yàn)選擇乙腈-水體系為流動(dòng)相，通過對其梯度洗脫條件的優(yōu)化，得到了合適的保留時(shí)間、峰形及分離效果。另外，試驗(yàn)還對Dikma Plus C18色譜柱和Hypersile Gold C18色譜柱的分離效果進(jìn)行了考察，結(jié)果顯示，2種色譜柱僅表現(xiàn)出組分保留時(shí)間的差異，分離度均可滿足檢測需要，考慮到經(jīng)濟(jì)成本，試驗(yàn)選擇了Dikma Plus C18色譜柱。

2.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線、檢出限和測定下限

按照試驗(yàn)方法對混合標(biāo)準(zhǔn)溶液系列進(jìn)行測定，以保留時(shí)間定性、外標(biāo)法定量。以4種PAHs的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，其對應(yīng)的儀器響應(yīng)值(響應(yīng)值＝標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的峰面積/標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的質(zhì)量濃度為縱坐標(biāo)繪制工作曲線。4 種PAHs標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性范圍為0.1～5.0μg·L－1，線性回歸方程、相關(guān)系數(shù)見表6。

以3倍信噪比和10倍信噪比計(jì)算檢出限(3S/N)和測定下限(10S/N)，結(jié)果見表6。

2.6 精密度和回收試驗(yàn)

在3種常見食用油中進(jìn)行3個(gè)濃度水平的加標(biāo)回收試驗(yàn)，計(jì)算回收率和測定值的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)，結(jié)果見表7。

表6 線性參數(shù)、檢出限和測定下限Tab.6 Linearity parameters，detection limits and lower limits of determination

表7 精密度和回收試驗(yàn)結(jié)果(n＝5)Tab.7 Results of tests for precision and recovery(n＝5)

由表7可知:4種PAHs的回收率為90.4%～99.9%，RSD 均在10%以內(nèi)，說明本方法對這3種食用油均具有較強(qiáng)的適用性，可實(shí)現(xiàn)油脂中4 種PAHs的快速提取、凈化的目的。

本工作根據(jù)4種PAHs的多環(huán)結(jié)構(gòu)以及食用油基質(zhì)中高脂肪含量的特點(diǎn)，建立了專一性酶解-高效液相色譜-熒光檢測法測定3 種食用油中4 種PAHs含量的方法，該方法大大降低了前處理時(shí)間和油脂的基質(zhì)抑制效應(yīng)，檢出限遠(yuǎn)低于現(xiàn)有方法[6-11]，為各類食用油中這4種PAHs的檢測開辟了新的途徑，可作為油脂中親脂性化合物的快速檢測技術(shù)廣泛推廣。