黃芩射干湯主要黃酮類成分與H7N9病毒神經(jīng)氨酸酶的分子對接

劉志強

(1.鶴壁職業(yè)技術學院，河南 鶴壁，458030； 2.鶴壁市天然藥物研究與開發(fā)重點實驗室,河南 鶴壁,458030)

黃芩射干湯首見于翁藻的《醫(yī)鈔類編》,全方由黃芩、射干兩藥配伍而成,主治肺胃熱毒壅盛所致的喉中腥臭等病[1]。藥材黃芩為唇形科植物黃芩的根,富含黃酮、萜類、揮發(fā)油、多糖等,其最主要的藥效物質成分為黃酮類，具有解熱、抗炎、抗菌以及抗病毒等藥理作用[2]。藥材射干為鳶尾科植物射干的根莖,主要含有鳶尾苷、鳶尾素等黃酮類,具有抗炎、抗氧化、雌激素樣作用,且抗菌抗病毒效果明顯[3]。黃芩與射干均為常用清熱解毒中草藥,具有抗病毒活性,能抑制H7N9病毒的復制生長[2-3]。

H7N9病毒屬于正黏病毒科、RNA病毒,具有外包膜,核衣殼為螺旋對稱狀顆粒,主要經(jīng)呼吸道在人類之間進行傳播,具有變異性和潛在大流行性風險[4-5]。其神經(jīng)氨酸酶(neuraminidase)是該病毒復制、感染過程中的關鍵酶,也是扎那米韋、奧司他韋等抗流感藥物阻斷病毒感染和傳播的主要靶酶[6]。神經(jīng)氨酸酶活性位點高度保守,是抗流感病毒藥物研究中的理想靶標,許多黃酮類等天然物質可以通過抑制神經(jīng)氨酸酶產(chǎn)生抗病毒效應[7-8]。以往研究表明:H7N9病毒對奧司他韋、扎那米韋等神經(jīng)氨酸酶抑制劑敏感,而對利巴韋林、M2阻滯劑金剛烷胺等抗病毒藥耐藥[9],但目前研究發(fā)現(xiàn),H7N9病毒的神經(jīng)氨酸酶R292K、R152K，E119V和I222K/R的突變,會導致對奧司他韋、扎那米韋等神經(jīng)氨酸酶抑制劑耐藥[10],因此,開發(fā)研究新一代抗H7N9病毒神經(jīng)氨酸酶抑制劑,提高對H7N9流感的防控治療措施刻不容緩。

鑒于黃芩射干湯中黃酮類物質具有一定抗流感病毒作用,本研究利用分子對接技術將黃芩射干湯中主要黃酮類成分與H7N9病毒神經(jīng)氨酸酶逐一對接,探究其抗病毒作用機制,為進一步研究黃芩射干湯抗流感病毒物質基礎與藥理機制提供線索與參考。

1 材料與方法

1.1 軟件與數(shù)據(jù)庫

(1)中藥系統(tǒng)藥理學數(shù)據(jù)庫與分析平臺TCMSP[11](網(wǎng)址更新為:http:∥tcmspw.com/tcmsp.php)。(2)蛋白質數(shù)據(jù)庫PDB(https:∥www.rcsb.org/)。(3)化學成分繪制軟件ChemBio3D Ultra 14.0。(4)分子對接圖像處理軟件PyMOL。(5)分子對接軟件AutoDock Vina與AutoDock Tools。

1.2 H7N9病毒神經(jīng)氨酸酶準備

本研究以WU等[12]發(fā)現(xiàn)的扎那米韋與H7N9神經(jīng)氨酸酶的共晶體為模型,將扎那米韋與H7N9神經(jīng)氨酸酶用PyMOL分離,對神經(jīng)氨酸酶進行前處理,去除水分子、磷酸根以及一些非活性位點的其他配體,利用AutoDock Tools對靶蛋白進行加氫、加電荷、設置為半柔性對接模式,統(tǒng)一轉換為AutoDock Vina軟件可識別的pdbqt文件。

1.3 黃酮類成分收集與前處理

檢索CNKI數(shù)據(jù)庫,查閱文獻[13-16]收集黃芩射干湯中主要黃酮活性成分,黃芩含有漢黃芩素、黃芩苷、黃芩素、千層紙素A-7-O-葡萄糖醛酸苷、木蝴蝶素A；射干含有白射干素、次野鳶尾黃素、芒果苷、射干苷、射干苷元、野鳶尾苷、野鳶尾黃素以及鳶尾黃素。本課題組以以上13種主要黃酮類成分為研究對象,研究黃芩射干湯主要黃酮類成分與H7N9神經(jīng)氨酸酶分子對接情況。

利用TCMSP數(shù)據(jù)庫下載以上13種活性成分的mol2格式文件,然后利用ChemBio3D Ultra 14.0軟件進行能量最小化處理,最后利用AutoDock Tools將活性分子轉換為AutoDock Vina軟件可識別的pdbqt文件,以備分子對接使用。

1.4 分子對接方法

以扎那米韋的坐標為標準位點,設置活性口袋位置,將標準品扎那米韋進行分子對接,測試分子對接的準確性,研究扎那米韋的分子對接結合能、氨基酸殘基作用情況。并以扎那米韋與H7N9神經(jīng)氨酸酶作用情況為“金標準”,研究黃芩射干湯中主要黃酮活性成分與H7N9神經(jīng)氨酸酶的分子對接結合能、氨基酸殘基作用情況。

2 結果

2.1 分子對接結合能

如圖1所示,扎那米韋與H7N9神經(jīng)氨酸酶分子對接前后位置基本不變,說明AutoDock Vina分子對接準確性高,得到扎那米韋與H7N9神經(jīng)氨酸酶分子對接結合能為-8.3 kcal/mol(1 kcal/mol=4.18 kJ/mol)。將13種主要黃酮類成分與H7N9神經(jīng)氨酸酶逐個分子對接,結果如表1所示。從表1可見，大多數(shù)黃酮類成分與H7N9神經(jīng)氨酸酶具有一定結合力,其中漢黃芩素、黃芩素、木蝴蝶素A與H7N9神經(jīng)氨酸酶的結合能最佳,分別為-7.1，-7.2和-7.2 kcal/mol。如圖2所示,漢黃芩素、黃芩素、木蝴蝶素A與H7N9神經(jīng)氨酸酶分子對接位置基本重合、作用模式一致,表明黃芩射干湯抗H7N9的主要成分為漢黃芩素、黃芩素以及木蝴蝶素A。

圖1 扎那米韋與H7N9神經(jīng)氨酸酶結合情況 Fig.1 Combination of zanamivir with H7N9 neuraminidase

圖2 漢黃芩素、黃芩素、木蝴蝶素A與H7N9神經(jīng)氨酸酶結合情況Fig.2 Combination of hanbaicalin,huangqinsu,wood butterfly A and H7N9 neuraminidase

表1 黃芩射干湯主要黃酮成分與H7N9神經(jīng)氨酸酶分子對接結合能
Table 1 The binding energy of main flavonoids components of huangqin-shegan decoction and H7N9neuraminidase molecular

中藥來源黃酮類物質最佳結合能/(kcal·mol-1)黃芩漢黃芩素-7.1黃芩黃芩苷-4.5黃芩黃芩素-7.2黃芩千層紙素A-7-O-葡萄糖醛酸苷-5.8黃芩木蝴蝶素A-7.2射干白射干素-5.8射干次野鳶尾黃素-5.4射干芒果苷-6.9射干射干苷-1.6射干射干苷元-6.3射干野鳶尾苷-2.2射干野鳶尾黃素-6.0射干鳶尾黃素-6.4

2.2 分子對接情況

WU等[12]發(fā)現(xiàn)扎那米韋主要是通過與H7N9神經(jīng)氨酸酶的Arg-119，Asp-152，Arg-153，Trp-180，Glu-278，Lys-294和Arg-372等氨基酸殘基相互作用,產(chǎn)生抑制作用。如圖3～6和表2所示,扎那米韋、漢黃芩素、黃芩素、木蝴蝶素A能與神經(jīng)氨酸酶活性位點上的Arg-119，Asp-152，Arg-153，Trp-180，Arg-372，Glu-278和Lys-294產(chǎn)生相互作用,可能具有抑制H7N9神經(jīng)氨酸酶的作用。

表2 研究藥物與H7N9神經(jīng)氨酸酶相互作用情況
Table 2 Study on drug interaction with H7N9neuraminidase

成分相互作用的氨基酸殘基扎那米韋Arg-119,Glu-120,Leu-135,Asp-152,Arg-153,Arg-157,Trp-180,Ser-181,Ile-224,Arg-226,Thr-227,Glu-229,Ala-248,Glu-278,Glu-279,Lys-294,Asn-296,Arg-372,Tyr-406漢黃芩素Arg-119,Glu-120,Asp-152,Arg-153,Arg-157,Trp-180,Ser-181,Ile-224,Arg-226,Glu-229,Ala-248,Glu-278,Glu-279,Lys-294,Asn-296,Asn-347,Asn-348,Arg-372,Gly-349,Tyr-406黃芩素Arg-119,Glu-120,Asp-152,Arg-153,Trp-180,Ser-181,Ile-224,Arg-226,Thr-227,Glu-229,Ala-248,Glu-278,Glu-279,Lys-294,Asn-296,Asn-347,Asn-348,Arg-372,Gly-349,Tyr-406木蝴蝶素AArg-119,Glu-120,Leu-135,Asp-152,Arg-153,Trp-180,Ser-181,Ile-224,Arg-226,Glu-229,Ala-248,Glu-278,Glu-279,Lys-294,Asn-296,Asn-348,Arg-372,Gly-349,Tyr-406

圖3 扎那米韋與H7N9神經(jīng)氨酸酶分子對接Fig.3 Zanamivir and H7N9 neuraminidase molecular docking

圖4 漢黃芩素與H7N9神經(jīng)氨酸酶分子對接Fig.4 Hanbaicalin and H7N9 neuraminidase molecular docking

圖5 黃芩素與H7N9神經(jīng)氨酸酶分子對接Fig.5 Huangqinsu and H7N9 neuraminidase molecular docking

圖6 木蝴蝶素A與H7N9神經(jīng)氨酸酶分子對接Fig.6 Wood butterfly A and H7N9 neuraminidase molecular docking

3 討論與結論

計算機輔助藥物設計、分子對接等新概念迅速發(fā)展,為藥物研發(fā)注入了新的活力[17],本研究將黃芩射干湯中13種主要黃酮成分與H7N9神經(jīng)氨酸酶進行了分子對接,發(fā)現(xiàn)漢黃芩素、黃芩素、木蝴蝶素A與H7N9神經(jīng)氨酸酶結合能最高,能與神經(jīng)氨酸酶Arg-119，Asp-152，Arg-153，Trp-180，Arg-372，Glu-278和Lys-294產(chǎn)生相互作用,具有類似扎那米韋樣抗H7N9神經(jīng)氨酸酶作用,這可能是黃芩射干湯抗H7N9病毒的藥理學作用之一。漢黃芩素是從唇形植物黃芩、半枝蓮等分離出的一種天然活性物質,具有顯著抗病毒作用,能對乙肝病毒以及呼吸道合胞病毒產(chǎn)生抑制作用[10]。本研究分子對接發(fā)現(xiàn),漢黃芩素能抑制H7N9病毒神經(jīng)氨酸酶活性,說明漢黃芩素抗病毒效果確切。吳瑩等[18]發(fā)現(xiàn),漢黃芩素還能調控病毒感染的肺泡巨噬細胞NF-κB p62的核轉移,減輕病毒導致的炎癥反應,說明漢黃芩素具有抗炎、抗病毒等多靶點藥理作用。黃芩素是從中藥黃芩提取的一種黃酮類物質,對小鼠流感模型有明顯抗病毒作用[19]。楊令芝等[20]發(fā)現(xiàn),黃芩素不僅能抑制神經(jīng)氨酸酶,而且對耐藥型神經(jīng)氨酸酶也具有明顯的抗性作用,該報道與本研究結果相互佐證,表明黃芩素確能抑制神經(jīng)氨酸酶作用。木蝴蝶素A與漢黃芩素是一對同分異構體[21],同為黃芩中的黃酮類活性物質,目前暫未見有關其具有神經(jīng)氨酸酶抑制劑作用的報道,但本研究發(fā)現(xiàn),其與H7N9病毒神經(jīng)氨酸酶結合能為-7.2 kcal/mol,結合模式與結合能與黃芩素、漢黃芩素的相當,推測木蝴蝶素A亦能通過抑制神經(jīng)氨酸酶活性發(fā)揮抗病毒作用。

綜上所述,黃芩射干湯黃酮類成分抗H7N9病毒神經(jīng)氨酸酶效果顯著,其中漢黃芩素、黃芩素、木蝴蝶素A結合能最高,還具有一定抗炎作用,對耐藥型神經(jīng)氨酸酶也具有一定抗性。本研究基于中藥有效成分配伍模式,以黃芩射干湯主要藥效成分——黃酮類化合物為研究對象,分析了其抑制H7N9神經(jīng)氨酸酶的分子機制,在一定程度上反映了黃芩射干湯抗H7N9病毒的藥理作用。但鑒于中藥湯劑化學成分復雜、計算機技術與現(xiàn)實的差異,黃芩射干湯抗H7N9病毒的更深層次藥理機制仍待進一步深入研究。