馬泰勒蟲RAP-1 基因的原核表達(dá)及蛋白性質(zhì)分析

肖培培，張夢(mèng)圓，特列克·庫(kù)拉別克，劉世芳，宋晶晶，樊新麗，李 敏，張 楊

（1.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，新疆烏魯木齊 830052；2.新疆維吾爾自治區(qū)動(dòng)物衛(wèi)生監(jiān)督所，新疆烏魯木齊 830063；3.中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院藥用植物研究所云南分所藥理中心，云南景洪 666100；4.西雙版納州傣藥南藥重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南景洪 666100）

馬泰勒蟲（Theileria equi）屬頂復(fù)門、梨形蟲目、泰勒科、泰勒屬，是一種專性細(xì)胞內(nèi)寄生原蟲[1]，寄生于馬、驢、騾和斑馬等馬屬動(dòng)物的紅細(xì)胞、淋巴細(xì)胞內(nèi)，引起蜱傳血液原蟲病——馬泰勒蟲病[2-3]。該病具有明顯的季節(jié)性及地區(qū)性，與媒介硬蜱的活動(dòng)規(guī)律有關(guān)[4-5]。患病動(dòng)物臨床表現(xiàn)為發(fā)熱（多為稽留熱）、貧血、呼吸困難、水腫、血紅蛋白尿、黃疸及敗血癥，以及孕畜流產(chǎn)及新生幼畜死亡[6]。盡管患病動(dòng)物臨床癥狀可經(jīng)藥物治療后消失，但并不能清除患畜體內(nèi)的病原體，其將終生攜帶病原[7]，這為該病的傳播及流行提供了條件。由于媒介蜱的廣泛存在，馬泰勒蟲病發(fā)病率不斷上升，流行區(qū)域也不斷擴(kuò)大，嚴(yán)重制約了馬產(chǎn)業(yè)的發(fā)展[8]。目前沒(méi)有針對(duì)馬泰勒蟲病的有效疫苗，對(duì)馬泰勒蟲病的控制僅依賴于藥物治療、蜱媒控制以及限制受感染馬匹的移動(dòng)。

棒狀體相關(guān)蛋白1（rhoptry-associated protein 1，RAP-1）位于頂復(fù)門原蟲裂殖子的棒狀體上，在子孢子階段也有表達(dá)，是蟲體與宿主紅細(xì)胞粘附后，由棒狀體分泌的，與入侵紅細(xì)胞相關(guān)的蛋白[9]。研究表明：RAP-1 蛋白包含多個(gè)抗原表位，可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生體液免疫和細(xì)胞免疫；感染駑巴貝斯蟲的馬匹可產(chǎn)生針對(duì)RAP-1 蛋白的抗體，因此RAP-1 蛋白可用于駑巴貝斯蟲的血清學(xué)診斷[10]。對(duì)牛巴貝斯蟲RAP-1 與裂殖子表面抗原1（MSA-1）的研究表明，RAP-1 可能共同參與了裂殖子對(duì)紅細(xì)胞的侵襲過(guò)程[11]。對(duì)雙芽巴貝斯蟲RAP-1 直系同源物的研究表明：針對(duì)RAP-1 的單克隆抗體能夠在體外抑制蟲體增殖[12-13]；用天然的RAP-1 或重組融合蛋白免疫小牛，發(fā)現(xiàn)在裂殖子感染時(shí)，平均寄生蟲血癥峰值明顯減少[14-15]；用重組RAP-1 蛋白刺激淋巴細(xì)胞建立的T 細(xì)胞對(duì)牛巴貝斯蟲有應(yīng)答，但對(duì)雙芽巴貝斯蟲裂殖子無(wú)應(yīng)答，而通過(guò)用牛巴貝斯蟲膜抗原重復(fù)刺激淋巴細(xì)胞建立的T 細(xì)胞系可對(duì)RAP-1 強(qiáng)烈增殖，證明了該蛋白的免疫顯性特性[16]；用純化的牛雙芽巴貝斯蟲RAP-1 免疫牛，使其產(chǎn)生了部分保護(hù)性反應(yīng)，因此RAP-1 被作為澳大利亞研制的重組疫苗中的抗原之一[17]。以上研究有力證明了RAP-1 在巴貝斯蟲生物學(xué)和發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮了功能作用，作為免疫原性蛋白，參與對(duì)紅細(xì)胞的侵襲過(guò)程，被認(rèn)為是潛在的候選疫苗抗原[18]。

由于頂復(fù)門原蟲裂殖子的表面蛋白或由細(xì)胞器所分泌的蛋白介導(dǎo)蟲體侵入宿主的紅細(xì)胞過(guò)程，因此這些蛋白被作為抗原蛋白或藥物靶點(diǎn)的研究重點(diǎn)。目前已經(jīng)鑒定了巴貝斯蟲屬和瘧原蟲屬中的RAP-1 蛋白[19]，但關(guān)于馬泰勒蟲RAP-1 蛋白的研究目前開(kāi)展較少。本研究擴(kuò)增了馬泰勒蟲RAP-1基因片段；對(duì)重組蛋白進(jìn)行了表達(dá)純化，檢測(cè)了其免疫原性，又以巴貝斯屬、泰勒屬、瘧原蟲屬的頂復(fù)門原蟲的RAP-1 蛋白為靶標(biāo)，構(gòu)建了進(jìn)化樹(shù)；對(duì)RAP-1蛋白理化性質(zhì)及結(jié)構(gòu)進(jìn)行了分析和預(yù)測(cè)，以期為進(jìn)一步研究該蛋白的生物學(xué)功能或研制亞單位疫苗提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

馬泰勒蟲陽(yáng)性血液、pET-32a（+）表達(dá)載體以及馬泰勒蟲標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性、陰性血清，均由新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)醫(yī)學(xué)學(xué)院寄生蟲實(shí)驗(yàn)室提供；pMD 19-T載體、DH5a 感受態(tài)細(xì)胞、限制性內(nèi)切酶EcoRI 和XhoI、T4DNA 連接酶、Total RNA 提取試劑盒、Fast King RT Kit 反轉(zhuǎn)錄試劑盒、瓊脂糖凝膠回收試劑盒，均購(gòu)自北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司；BL21 感受態(tài)細(xì)胞和Protein Marker，購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司；質(zhì)粒小量提取試劑盒，購(gòu)自O(shè)MEGA 生物試劑公司；2×EsTaqMaster Mix，購(gòu)自康為世紀(jì)生物科技有限公司；HisSep Ni-NTA 6FF Chromatography Column，購(gòu)自上海翊圣生物科技有限公司；辣根過(guò)氧化物酶（HRP）標(biāo)記的兔抗馬IgG，購(gòu)自北京博奧森生物技術(shù)有限公司。所用水為超純水。

1.2 總RNA 提取

按照RNA 提取試劑盒說(shuō)明書，提取馬泰勒蟲陽(yáng)性血液樣品的總RNA。應(yīng)用Fast King RT Kit 反轉(zhuǎn)錄試劑盒，以提取的RNA 為模板，合成第一鏈cDNA；cDNA 合成后分裝，一部分用于基因擴(kuò)增，其余置于-80 ℃保存。

1.3 引物設(shè)計(jì)與合成

參考GenBank 報(bào)道的馬泰勒蟲RAP-1基因序列和原核表達(dá)載體pET-32a（+）圖譜酶切位點(diǎn)，使用Oligo 軟件設(shè)計(jì)引物RAP-1-P1（5'-GAATTCCTCATAAGGCACAGAGAAA-3'） 和RAP-1-P2（5'-CCGCTCGAGAAGCTTAATCTCAGAGGG-3'）。加下劃線的序列分別對(duì)應(yīng)EcoRI、XhoI 酶切位點(diǎn)。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.4 RAP-1 基因擴(kuò)增

以1.2 制備的cDNA 為模板，用1.3 設(shè)計(jì)的引物，通過(guò)PCR 技術(shù)擴(kuò)增RAP-1基因（95 ℃5 min，95 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s，30個(gè)循環(huán)，72 ℃ 5 min）。反應(yīng)結(jié)束后，取5 μL PCR產(chǎn)物于1%的瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳檢測(cè)。

1.5 RAP-1 基因進(jìn)化樹(shù)分析

選取頂復(fù)門原蟲駑巴貝斯蟲（B.caballi，登錄號(hào)GQ871780.1、KF059876.1），雙芽巴貝斯蟲（B.bigemina，登錄號(hào)AB586126.1、KT312797.1），分歧巴貝斯蟲（B.divergens，登錄號(hào)HQ538420.1、HQ538430.1），惡性瘧原蟲（P.falciparum，登錄號(hào)FJ407006.1、GQ281628.1），牛巴貝斯蟲（B.bovis，登錄號(hào)FJ588009.1、L77326.1），馬泰勒蟲（T.equi，登錄號(hào)XM_004830353.1），應(yīng)用MEGA 6.0 軟件，以選取的11種頂復(fù)門原蟲及本研究測(cè)定的RAP-1基因?yàn)榘袠?biāo)，以最大似然法構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)。

1.6 RAP-1 蛋白理化特性和二、三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

運(yùn)用在線工具ProtParam（https://web.expasy.org/protparam/） 及ProtScale（http://web.expasy.org/protscale/），分析蛋白的理化特性、親（疏）水性；用TMHMM 法，分析蛋白質(zhì)跨膜區(qū)；運(yùn)用DNAstar 軟件，預(yù)測(cè)分析RAP-1 蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)；用在線工具Swiss model（https://swissmodel.expasy.org/），構(gòu)建RAP-1 蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)模型；用PyMOL 分子三維結(jié)構(gòu)，顯示軟件分析該蛋白的三維結(jié)構(gòu)。

1.7 pET-32a-RAP-1 重組質(zhì)粒構(gòu)建

根據(jù)膠回收純化試劑盒說(shuō)明書回收目的片段，用純化后的RAP-1 片段與克隆載體pMD 19-T連接，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α 感受態(tài)細(xì)胞中，菌液鑒定為陽(yáng)性的克隆，送至上海生工生物工程有限公司測(cè)序，將測(cè)序正確的克隆命名為19-T-RAP-1；根據(jù)質(zhì)粒小提試劑盒說(shuō)明書提取19-T-RAP-1、pET-32a（+）質(zhì)粒，將重組質(zhì)粒和pET-32a 載體雙酶切（EcoRI、XhoI），回收目的片段和空載體，用T4DNA 連接酶于16 ℃過(guò)夜連接，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21 感受態(tài)細(xì)胞；37 ℃培養(yǎng)12～14 h 后，挑取單個(gè)菌落，通過(guò)菌液PCR 鑒定陽(yáng)性克隆；提取質(zhì)粒進(jìn)行酶切驗(yàn)證并測(cè)序，將經(jīng)測(cè)序鑒定正確的重組質(zhì)粒命名為pET-32a-RAP-1。

1.8 重組蛋白誘導(dǎo)表達(dá)及純化

將pET-32a-RAP-1 陽(yáng)性菌液于含100 μg/mL氨芐青霉素的LB 液體培養(yǎng)基（50 mL）中小量誘導(dǎo)，測(cè)定重組蛋白的表達(dá)情況。于37 ℃ 180 r/min 培養(yǎng)至OD 值達(dá)0.4～0.6 時(shí)，分別加入終濃度為0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mmol/L 的IPTG，37 ℃誘導(dǎo)表達(dá)，然后分別收集1～7 h 的菌液進(jìn)行SDS-PAGE 電泳分析；以最佳的誘導(dǎo)時(shí)間和濃度進(jìn)行表達(dá)，超聲破碎菌體后離心，分別取上清和沉淀進(jìn)行可溶性分析。

將pET-32a-RAP-1 陽(yáng)性菌液擴(kuò)培至400 mL 的含100 μg/mL 氨芐青霉素的LB 液體培養(yǎng)基，當(dāng)OD 值達(dá)0.4～0.6 時(shí)，加入終濃度為0.4 mmol/L 的IPTG，誘導(dǎo)2 h，離心收集誘導(dǎo)表達(dá)后的菌液；加10 mL 的破菌液，混勻，超聲破碎（功率為40 W，超聲5 s，間歇5 s，40 min）；8 000 r/min，4 ℃離心10 min，最后收集上清/沉淀進(jìn)行蛋白純化。

1.9 Western-blot

取10 μL 重組蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE 電泳后，半干轉(zhuǎn)印于硝酸纖維素膜（NC 膜）上，用封閉液（5%脫脂乳，含0.5% Tween 的PBS 稀釋）封閉1 h，加馬泰勒蟲陽(yáng)性血清作為一抗（1:100），37 ℃ 反應(yīng)2 h；將二抗辣根過(guò)氧化物酶（HRP）標(biāo)記的兔抗馬IgG（HRP-兔抗馬IgG）用5%脫脂乳1:6 000 稀釋，37 ℃ 孵育1.5 h；最后，于DAB 顯色液中37 ℃避光孵育5 min，觀察結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 RAP-1 基因擴(kuò)增

PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳，得到1 236 bp 的片段（圖1），與預(yù)期片段大小一致。

2.2 遺傳進(jìn)化分析

分別選取巴貝斯屬、泰勒屬及瘧原蟲屬的頂復(fù)門原蟲RAP-1基因序列（登錄號(hào)GQ871780.1、KF059876.1、AB586126.1、KT312797.1、HQ538420.1、HQ538430.1、FJ407006.1、GQ281628.1、FJ588009.1、L77326.1、XM_004830353.1），應(yīng)用MEGA 6.0 軟件構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)，進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析。結(jié)果顯示：本試驗(yàn)所得RAP-1基因序列與GenBank 上發(fā)表的馬泰勒蟲序列聚為一支，置信度為100%；巴貝斯屬的不同蟲株相聚類，馬泰勒蟲蟲株與惡性瘧原蟲蟲株相聚類，表明兩者親緣關(guān)系較近（圖2）。

圖2 運(yùn)用最大似然法構(gòu)建的RAP-1 基因核苷酸序列系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)

2.3 RAP-1 蛋白理化特性和二、三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)分析

蛋白理化性質(zhì)結(jié)果顯示，RAP-1 蛋白理論等電點(diǎn)為9.85，半衰期為30 h，不穩(wěn)定系數(shù)為43.33，總平均親水性為-0.368。ProtScale（http://web.expasy.org/protscale/）分析蛋白的親（疏）水性結(jié)果顯示（圖3-A）：MIN 為-2.600，MAX 為2.011；由圖可以看出，標(biāo)度值＜0 的區(qū)域與＞0的區(qū)域相比較為密集，結(jié)合理化性質(zhì)中的總平均親水性（GRAVY）值，總體上認(rèn)為是親水性蛋白。使用TMHMM 法分析蛋白質(zhì)跨膜區(qū)，發(fā)現(xiàn)氨基酸位于細(xì)胞膜表面，無(wú)跨膜區(qū)（圖3-B）。二級(jí)結(jié)構(gòu)（圖3-C）顯示：RAP-1 蛋白結(jié)構(gòu)主要包括α-螺旋、β-折疊、β-轉(zhuǎn)角和無(wú)規(guī)卷曲4種類型，占比分別為38.5%、15.5%、27.8%、18.1%。通過(guò)Swiss model軟件，對(duì)馬泰勒蟲RAP-1 蛋白進(jìn)行同源建模，用PyMOL 分子三維結(jié)構(gòu)顯示軟件，對(duì)該蛋白的三維結(jié)構(gòu)進(jìn)行比對(duì)分析。結(jié)果（圖3-D）顯示：藍(lán)色為α-螺旋結(jié)構(gòu)、β-折疊結(jié)構(gòu)，紅色標(biāo)注位置為半胱氨酸所在位置。該蛋白結(jié)構(gòu)比較簡(jiǎn)單，在RAP-1三級(jí)結(jié)構(gòu)中α-螺旋占據(jù)較多構(gòu)象。

圖3 馬泰勒蟲RAP-1 理化特性和二、三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)分析結(jié)果

2.4 重組質(zhì)粒雙酶切

重組質(zhì)粒經(jīng)過(guò)EcoRI 和XhoI 雙酶切，酶切產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果得到兩條特異性條帶（圖4），表明目的基因RAP-1插入到表達(dá)載體pET-32a（+）中，并測(cè)序成功，說(shuō)明重組質(zhì)粒pET-32a-RAP-1 構(gòu)建成功。

2.5 RAP-1 重組蛋白SDS-PAGE 誘導(dǎo)表達(dá)

將pET-32a-RAP-1 陽(yáng)性菌液加入含100 μg/mL氨芐青霉素的LB 液體培養(yǎng)基中，180 r/min，37 ℃ 培養(yǎng)至OD 值達(dá)到0.4～0.6 時(shí)，加入終濃度為1 mmol/L IPTG 進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，篩選誘導(dǎo)時(shí)間；于不同IPTG 濃度下誘導(dǎo)表達(dá)，篩選最佳誘導(dǎo)時(shí)間。SDS-PAGE 分析結(jié)果顯示，以終濃度為0.4 mmol/L IPTG 誘導(dǎo)2 h 時(shí)，蛋白表達(dá)量最高（圖5～6）。誘導(dǎo)后的表達(dá)產(chǎn)物大小約65 kDa，與其理論值基本一致。選用最佳誘導(dǎo)時(shí)間和誘導(dǎo)濃度，經(jīng)過(guò)超聲破碎，離心分別收集上清和沉淀，進(jìn)行SDS-PAGE檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)沉淀中表達(dá)蛋白雜帶較少，表達(dá)蛋白主要存在于沉淀中，為包涵體蛋白（圖7）。

2.6 重組蛋白純化

使用鎳柱純化試劑盒純化濃縮蛋白，將制備樣品進(jìn)行SDS-PAGE 電泳，收集后檢測(cè)其濃度。純化結(jié)果見(jiàn)圖8。

圖6 重組蛋白最佳誘導(dǎo)濃度

圖7 重組蛋白最佳誘導(dǎo)時(shí)間和IPTG 濃度誘導(dǎo)后可溶性蛋白分析結(jié)果

2.7 表達(dá)產(chǎn)物Western-blot 分析

用破菌液懸浮收集菌體，超聲破碎至半透明狀態(tài)，進(jìn)一步處理表達(dá)產(chǎn)物，經(jīng)SDS-PAGE 電泳后轉(zhuǎn)移至NC 膜上。結(jié)果表明，馬泰勒蟲陽(yáng)性血清與蛋白反應(yīng)，在65 kDa 處有條帶出現(xiàn)（圖9），表明該重組蛋白具有特異性和反應(yīng)原性。

圖8 pET-32a-RAP-1 重組蛋白純化結(jié)果

圖9 pET-32a-RAP-1 重組蛋白Western-blot 結(jié)果

3 討論

頂復(fù)門原蟲的分泌型細(xì)胞器棒狀體和微線體在蟲體侵入宿主紅細(xì)胞過(guò)程中分泌的，與入侵相關(guān)的保守蛋白——棒狀體相關(guān)蛋白（rhoptry associated protein，RAP）可與微線體頂端膜抗原（microneme protein apical membrane antigen，AMA1）形成運(yùn)動(dòng)結(jié)合體，在蟲體入侵過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用[20]。棒狀體相關(guān)蛋白被認(rèn)為是保護(hù)蟲體侵入以及入侵后期進(jìn)行繁殖的關(guān)鍵分子，在納蟲空泡形成過(guò)程中發(fā)揮重要作用，被認(rèn)為是侵入宿主細(xì)胞的主要毒力因子[21]。在頂復(fù)門原蟲RAP 的研究中，弓形蟲、瘧原蟲和柔嫩艾美耳球蟲的RAP 研究較深入。以往的相關(guān)研究成果表明了棒狀體蛋白在抵御蟲體侵入和免疫保護(hù)方面起到了關(guān)鍵作用，指明RAP 研究將作為未來(lái)疫苗及診斷抗原研究的重要方向[22-24]。目前對(duì)RAP 的研究主要集中在RAP 對(duì)宿主侵入功能等的初步驗(yàn)證，尚無(wú)對(duì)宿主細(xì)胞相互作用影響的文獻(xiàn)發(fā)表。本試驗(yàn)結(jié)果表明，原核表達(dá)所獲得的融合蛋白R(shí)AP-1 分子質(zhì)量為65 kDa；Western-blot 分析結(jié)果表明，該重組蛋白能被馬泰勒蟲標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清識(shí)別，具有良好的反應(yīng)原性。對(duì)以巴貝斯屬、泰勒屬及瘧原蟲屬頂復(fù)門原蟲RAP-1基因?yàn)榘袠?biāo)構(gòu)建的進(jìn)化樹(shù)的結(jié)果顯示，巴貝斯蟲屬的不同蟲株相聚類，惡性瘧原蟲與馬泰勒蟲蟲株序列相聚類。與巴貝斯蟲相比，惡性瘧原蟲與馬泰勒蟲這兩種蟲體的入侵方式可能更為相似，其原因還有待研究。RAP-1 的二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果顯示：其含有豐富的α-螺旋和β-轉(zhuǎn)角，推測(cè)該蛋白性質(zhì)穩(wěn)定；三級(jí)結(jié)構(gòu)的構(gòu)建直觀立體地展現(xiàn)了RAP-1 的形態(tài)，為進(jìn)一步研究該蛋白功能提供可視化依據(jù)。RAP-1基因的獲得為我國(guó)馬泰勒蟲病的流行病學(xué)調(diào)查、免疫學(xué)診斷、篩選藥物靶標(biāo)，以及該基因在入侵中的明確作用、疫苗候選奠定了基礎(chǔ)。