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    枸杞LbAPX基因cDNA片段的克隆及生物信息學(xué)分析

    2020-07-06 10:14:46郭寧強(qiáng)
    生物化工 2020年3期
    關(guān)鍵詞:過氧化物抗壞血酸枸杞

    郭寧強(qiáng)

    (平羅縣第二中學(xué),寧夏石嘴山 753400)

    枸杞(LyciumbarbarumL.)屬于茄科(Solanaceae)枸杞屬(Lycium),通稱茨圓或紅果子[1]。抗壞血酸過氧化物酶(Aseorbateperoxidase,APX),也叫維生素C過氧化物酶,普遍存在于高等植物、真核藻類和部分藍(lán)細(xì)菌中,在部分昆蟲中也檢測(cè)出APX活性[2]??箟难徇^氧化物酶屬于末端氧化酶的一種,在1976年才被Foyer和Halliwell發(fā)現(xiàn)[3]。近十幾年來,其重要的生理生化功能受到研究者的廣泛關(guān)注。

    抗壞血酸過氧化物酶(APX)是一種亞鐵血紅素蛋白[4],對(duì)底物抗壞血酸(Ascorbic acid,AsA)有極高的專一性[5]。AsA是植物體內(nèi)合成的一類己糖內(nèi)酯化合物,在植物的生長(zhǎng)以及發(fā)育中發(fā)揮著重要作用,如抗氧化和清除自由基、光合作用和光保護(hù)、細(xì)胞的生長(zhǎng)和分裂以及參與乙烯的合成等[6]。

    APX是眾多植物活性氧代謝中非常重要的抗氧化酶之一,不僅是植物葉綠體中清除H2O2的關(guān)鍵酶,還是維生素C代謝中主要的酶類。而在植物的光合作用中起到一定的催化作用。經(jīng)相關(guān)研究表明,通過對(duì)抗壞血酸過氧化物酶的克隆,可以提高植物的抗逆性和光合作用能力。目前,少見有枸杞抗壞血酸過氧化物酶的相關(guān)研究報(bào)道,本研究克隆到LbAPX基因cDNA片段,并對(duì)其序列進(jìn)行生物信息學(xué)分析,分析結(jié)果為進(jìn)一步研究該基因在枸杞中的功能研究奠定了基礎(chǔ)。

    1 材料與方法

    1.1 實(shí)驗(yàn)材料

    枸杞品種“寧杞1號(hào)”生長(zhǎng)于育新公司試驗(yàn)基地,自然條件生長(zhǎng),于2015年6—7月采摘花蕾冰盒帶回實(shí)驗(yàn)室。液氮速凍后貯于-80 ℃?zhèn)溆谩?/p>

    1.2 主要試劑

    LA-Taq 聚合酶、連接載體 pMD? 19-T Vector,TaKaRa 公司;RNA Plant Extraction Kit DP419,天根公司;普通瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒,天根公司;PrimeScriptTM1 Strand cDNA Synthesis Kit、SMART PCRcDNA Synthesis Kit,Clontech 公司。

    1.3 主要儀器

    KYC-1102C型恒溫培養(yǎng)搖床,上海浦東物理光學(xué)儀器;高速冷凍離心機(jī),意大利ALC公司;DTC型PCR儀,西安天隆科技有限公司;Gel doc2000型凝膠成像儀,美國BIO-RAD公司;DYY-8C型電泳儀,北京市六一儀器廠。

    1.4 實(shí)驗(yàn)方法

    1.4.1 總RNA提取和純化、cDNA第一鏈的合成

    1.4.1.1 總RNA的提取(TRIZOL法)

    用北京天根公司(TIANGEN)的RNA Plant Extraction Kit DP419試劑盒對(duì)總RNA進(jìn)行提取。

    1.4.1.2 RNA的純化與檢測(cè)

    為了防止基因組DNA污染,對(duì)總RNA樣品進(jìn)行DNAase I消化和苯酚/氯仿抽提純化。純化后,用1%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳(電泳條件:1×TAE;130 V,15 min),后續(xù)對(duì)總RNA的質(zhì)量進(jìn)行了檢測(cè)。若非常明顯看到28S rRNA和18S rRNA的兩條帶,證明其完整性較好。若出現(xiàn)彌散狀或條帶看不清說明總RNA已嚴(yán)重降解。

    1.4.1.3 cDNA第一鏈合成

    參 照 SMART PCRcDNA Synthesis Kit說 明 書 對(duì)cDNA第一鏈進(jìn)行合成。

    1.4.2 LbAPX基因cDNA保守區(qū)片段的克隆

    1.4.2.1 引物設(shè)計(jì)

    根據(jù)先前枸杞花藥蛋白質(zhì)組學(xué)的研究中,質(zhì)譜鑒定的肽段序列信息,進(jìn)行了數(shù)據(jù)庫搜索,通過對(duì)比番茄、煙草、大豆和棉花等同源基因的氨基酸序列保守區(qū),采用primer5軟件并設(shè)計(jì)LbAPX引物序列。

    上游引物:5'-GGAATATGCAGAGAAGTATGCT GTAGATCAAG-3'。

    下游引物:5'-CAAATCTTAAGCTTCCATTAGCT CCACCTC-3'。

    1.4.2.2 PCR擴(kuò)增

    PCR產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳、染色以及凝膠成像系統(tǒng)拍照。

    1.4.2.3 目的片段的回收

    PCR目的片段采用TaKaRa公司的Agrose Gel DNA Extraction Kit回收。

    1.4.3 大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備、連接、轉(zhuǎn)化及鑒定

    1.4.3.1 大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備

    用CaCl2法制備大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞。

    1.4.3.2 目的基因與T載體連接

    回收產(chǎn)物 4 μL、SolutionⅠ 5 μL、pMD18-T Vector 1 μL 混合后離心混勻,在 16 ℃恒溫條件下連接 3 h。

    1.4.3.3 轉(zhuǎn)化

    連接產(chǎn)物10 μL,DH5α感受態(tài)細(xì)胞50 μL,二者混勻,冰上放置 30 min;隨后 42 ℃熱激 90 s,冰上放 5 min 后加入 200 μL LB 液體培養(yǎng)基,培養(yǎng) 1 h(110 r/min、37 ℃);取LB培養(yǎng)液,均勻涂板在LB的固體培養(yǎng)基(100 μg/mL Amp),先正面培養(yǎng) 1 h,再倒置培養(yǎng) 12~16 h(37 ℃恒溫)。

    1.4.3.4 鑒定

    用1.0%瓊脂糖凝膠來檢測(cè)PCR產(chǎn)物,其中陽性克隆的菌液送上海生工生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測(cè)序。

    1.4.4 LbAPX基因系統(tǒng)進(jìn)化分析

    采用NCBI網(wǎng)站(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast)下載了部分來源于其他植物的APX類蛋白序列信息,經(jīng)過BioXM2.6軟件進(jìn)行了同源性比對(duì),用MEGA 4.1軟件對(duì)上述植物的APX基因進(jìn)行了系統(tǒng)發(fā)生分析。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 RNA完整性檢測(cè)

    由圖1可以看出,在0.1%的瓊脂糖凝膠上,RNA泳道無背景,28S和18S兩條帶的帶型清晰。經(jīng)分光光度計(jì)測(cè)定其A260/A280介于1.8~2.0。表明提取到的枸杞花藥總RNA質(zhì)量較高,可用于后續(xù)的反轉(zhuǎn)錄研究。

    圖1 枸杞花藥RNA電泳圖

    2.2 LbAPX基因cDNA保守區(qū)序列的獲得及同源性分析

    2.2.1 LbAPX基因cDNA保守區(qū)序列的獲得

    以枸杞花藥cDNA為模板,經(jīng)RT-PCR得到一條大小約為670 bp的特異片斷,如圖2所示。

    對(duì)特異片段進(jìn)行回收,隨后連接和轉(zhuǎn)化,進(jìn)行陽性克隆篩選及PCR鑒定,鑒定結(jié)果如圖3所示。

    圖2 枸杞LbAPX基因PCR

    圖3 枸杞LbAPX基因菌液PCR

    對(duì)菌液進(jìn)行測(cè)序,測(cè)序結(jié)果序列如表1所示。該序列長(zhǎng)670 bp,具有完整的ORF。

    2.2.2 LbAPX花藥基因cDNA編碼產(chǎn)物的同源性和系統(tǒng)發(fā)生分析

    用Blast分析了LbAPX的ORF編碼的氨基酸序列,結(jié)果如圖4。其氨基酸保守結(jié)構(gòu)區(qū)域位于3~145 AA,證明屬APX超基因家族。該氨基酸序列與馬鈴薯植物葉綠體抗壞血酸過氧化物酶同源性高達(dá)96%。

    圖4 LbAPX基因氨基酸的保守結(jié)構(gòu)域

    采用MEGA4.1軟件對(duì)枸杞、馬鈴薯、煙草、棉花和大豆等來自于不同物種的APX進(jìn)行進(jìn)化分析,結(jié)果如圖5所示。從系統(tǒng)發(fā)生分析可看到,LbAPX與煙草和馬鈴薯的APX蛋白進(jìn)化關(guān)系最近,與棉花的親緣關(guān)系則相對(duì)較遠(yuǎn)。

    圖5 LbAPX蛋白的進(jìn)化分析

    表1 菌液測(cè)序結(jié)果

    3 討論與結(jié)論

    APX蛋白是一類酸性、可溶性蛋白,已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的蛋白種類約200多種。伴隨克隆技術(shù)的發(fā)展及APX蛋白的cDNA文庫建立,人們漸漸認(rèn)識(shí)到這是一類任何真核細(xì)胞中都普遍存在的蛋白質(zhì)。研究發(fā)現(xiàn),APX蛋白在植物中的功能主要集中在植物種子的萌發(fā)、植物細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、植物營養(yǎng)物質(zhì)代謝、物質(zhì)運(yùn)輸、細(xì)胞周期的調(diào)控等方面。植物中該蛋白克隆已經(jīng)有很多報(bào)道,尤其在對(duì)該蛋白的生理生化功能方面有相關(guān)報(bào)道。通過克隆技術(shù),在馬鈴薯和番茄以及油菜植物中可調(diào)節(jié)植物的抗逆性[7-8]。

    利用TRIZOL法提取了“寧杞1號(hào)”花藥總RNA,采用 SMART PCRcDNA Synthesis Kit試劑盒合成cDNA,并設(shè)計(jì)引物克隆了抗壞血酸過氧化物酶的cDNA片段。通過相關(guān)軟件進(jìn)行了生物信息學(xué)分析,得到了長(zhǎng)度為670 bp的片段和完整的ORF,該ORF長(zhǎng)為456 bp,編碼146個(gè)氨基酸。經(jīng)cDNA編碼產(chǎn)物的同源性和系統(tǒng)發(fā)生分析,表明枸杞LbAPX基因?qū)儆贏PX超基因家族。該氨基酸序列與馬鈴薯的同源性高達(dá)96%。實(shí)驗(yàn)結(jié)果為進(jìn)一步深入研究LbAPX編碼的蛋白在枸杞中的相關(guān)功能及相應(yīng)的生理生化性質(zhì)奠定了前期基礎(chǔ)。

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