小麥新種質(zhì)系SN0594春化和光周期反應(yīng)特性鑒定

王東　王崇宇　徐勤省　王洪剛　李興鋒

摘要：為了明確本實驗室創(chuàng)制的小麥新種質(zhì)SN0594的光溫反應(yīng)特性及其利用價值，本研究以SN0594和不同春化習性的小麥品種為材料，在明確不同材料的春化基因和光周期基因組成特點的基礎(chǔ)上，對其在不同環(huán)境條件進行生育期鑒定。結(jié)果表明，在Vrn-A1位點含有顯性等位變異的多數(shù)小麥材料在人工氣候室不經(jīng)過低溫春化且滿足長日照的條件下都能夠完成抽穗，其中小麥種質(zhì)系SN0594在Vrn-A1位點含有顯性等位變異基因Vrn-A1a，揚麥14和揚麥15含有顯性等位變異基因Vrn-A1b，中國春等則含有顯性等位變異基因Vrn-D1;不同環(huán)境鑒定結(jié)果表明，SN0594在人工氣候室不經(jīng)春化處理條件下，能夠較早開花并完成生育周期，不同顯性變異基因春性效應(yīng)大小為Vrn-A1a>Vrn-A1b>Vrn-B1>Vrn-D1;田間鑒定結(jié)果表明，不同小麥材料在經(jīng)過冬季低溫春化后，其抽穗期與在人工氣候室調(diào)查發(fā)生較大差異，其中SN0594和中國春抽穗較其他品種晚，證明除了春化基因以外，光周期Ppd-D1b等其他基因?qū)π←溕谟绊懸草^大，需滿足一定的長日照條件才能促使小麥抽穗開花。

關(guān)鍵詞：小麥;新種質(zhì);春化基因;光周期基因;生育期

中圖分類號：S512.102 文獻標識號：A 文章編號：1001-4942（2020）04-0001-09

Abstract In order to make clear the response characteristics to temperature and photoperiod and utilization value of SN0594， a new wheat germplasm created in our laboratory， the growth period was identified under different environment conditions based on the identification of vernalization and photoperiod gene types of SN0594 and some wheat varieties with different vernalization habits. The results showed that most wheat materials with dominant allelic variation at Vrn-A1 locus could complete heading under long-day photoperiod without low temperature vernalization in the artificial climate chamber. SN0594 had a dominant allele Vrn-A1a at Vrn-A1 locus; Yangmai 14 and Yangmai 15 had a dominant allele Vrn-A1b， and other varieties such as Chinese Spring had a dominant allele Vrn-D1. According to the results of different environmental identification， SN0594 could flower earlier to complete the growth cycle in the artificial climate chamber without vernalization treatment; and the spring effect of different dominant variation genes was Vrn-A1a>Vrn-A1b>Vrn-B1>Vrn-D1. The field investigation showed that the heading time of different wheat materials after vernalization in winter was quite different from that in the artificial climate chamber. The heading of SN0594 and Chinese Spring was later compared with the other varieties， which indicated that in addition to vernalization genes， other genes such as photoperiod gene Ppd-D1b also had great influences on the growth period of wheat， and they would promote wheat heading and flowering through meeting a certain long-day photoperiod conditions.

Keywords Wheat; New germplasm; Vernalization gene; Photoperiod gene; Growth period

小麥（Triticum aestivum L.）是我國重要的糧食作物[1]。我國復雜的地形地勢造就了不同的氣候環(huán)境，普通小麥也進化出了不同的生育期以增加對外界環(huán)境的適應(yīng)性。春化基因和光周期基因是影響小麥抽穗期的兩個最主要因素，春化基因決定小麥是否通過低溫誘導由營養(yǎng)生長轉(zhuǎn)化為生殖生長（即小麥的冬春性），決定著小麥生長周期長短的70%～75%;光周期基因是決定小麥開花早晚的關(guān)鍵基因[2]。研究小麥的春化和光溫反應(yīng)機制進而提高廣適性對于小麥生產(chǎn)具有重要意義。

小麥春化現(xiàn)象是指小麥必須經(jīng)歷一段時間的持續(xù)低溫才能由營養(yǎng)生長階段轉(zhuǎn)入生殖生長階段的現(xiàn)象。前人研究表明，小麥春化至少受4個春化基因的影響，分別命名為Vrn-1、Vrn-2、Vrn-3和Vrn-4。Vrn-1位于小麥的A、B、D染色體組的第5染色體長臂上[3-19];

Vrn-2位于5A染色體上[16];Vrn-3位于7BS染色體長臂上，其候選基因命名為TaFT1[18];Vrn-4被定位于六倍體小麥5D染色體靠近著絲粒的位置[19]。Vrn-1基因編碼API基因家族的MADS-box轉(zhuǎn)錄因子，是開花促進因子。Vrn-1在六倍體小麥基因組中存在3個部分同源基因：Vrn-A1、Vrn-B1和Vrn-D1，分別位于第5同源群的5A、5B、5D染色體長臂上。這3個等位基因中有任何一個為顯性，小麥的發(fā)育特性就表現(xiàn)為春性，即不經(jīng)過春化就可抽穗開花，全為隱性時表現(xiàn)為冬性[16]。袁秀云[20]利用不同品種小麥研究發(fā)現(xiàn)，三個顯性等位基因的春性效應(yīng)表現(xiàn)為Vrn-A1>Vrn-B1>Vrn-D1的趨勢，且品種的春性強弱表現(xiàn)也基本與基因型一致。Vrn-2位點包括兩個標準復制的包含CCT結(jié)構(gòu)域（CONSTANS、CO-like和TOC1）的基因ZCCT1和ZCCT2，它們表現(xiàn)為長日開花抑制因子[21]，含有該顯性基因的小麥春化特性表現(xiàn)為冬性。但當Vrn-1 和Vrn-3 基因為顯性時，Vrn-2等位基因差異對開花時間的影響也會減弱或消除[22]。Vrn-3具有編碼PEBP蛋白的功能，與擬南芥和大麥中的FT（Flowering Locus T）基因同源，是春化和光周期信號的主要集成商[18，23]。日照長短以及春化時間共同調(diào)控Vrn-3，促進植物開花。Pugsley 等發(fā)現(xiàn)第4個春化基因Vrn-4[14，24]，Yoshida等[19]將該基因定位到小麥5D染色體短臂靠近著絲粒的區(qū)域，并且證明該基因與Vrn-B1及Vrn-D1具有相似的功能，通過調(diào)控春化作用來影響小麥開花，但是效應(yīng)要小于Vrn-A1。

普通小麥是典型的長日照作物，日照長度對其抽穗開花具有重要的調(diào)控作用。當小麥低溫累積和持續(xù)時間的春化條件達到小麥成花要求后，光照時間長度是影響植物開花的重要因素。小麥光周期反應(yīng)主要由Ppd-D1、Ppd-B1和Ppd-A1這三個部分同源基因調(diào)控，已被定位于2D、2B和2A染色體的短臂上。其中Ppd-D1位點對光周期反應(yīng)起主導作用，已成功開發(fā)出Ppd-D1位點的分子標記，用于小麥在此位點上的光周期基因型檢測[25-27]。

本實驗室前期創(chuàng)制了春化不敏感的小麥新種質(zhì)SN0594為了明確其光溫反應(yīng)特性，本研究比較了SN0594和所收集的黃淮海麥區(qū)、長江中下游麥區(qū)具有不同生長習性的小麥品種的光溫反應(yīng)特性和基因組成，以期了解不同春化基因和光周期基因組成對小麥在不同光溫環(huán)境下生育期的影響，進而為其在小麥遺傳改良中的應(yīng)用提供借鑒。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本研究所用材料包括小麥新種質(zhì)SN0594及從黃淮海小麥種植區(qū)以及長江中下游揚州種植區(qū)獲得的不同生活習性的小麥品種泰山5號、揚麥11、煙農(nóng)15和中國春等，共23份，具體見表1。

1.2 試驗方法

1.2.1 小麥材料春化和光周期基因型鑒定

利用CTAB法分別提取各品種材料基因組DNA，利用Yan、Fu等設(shè)計的STS引物，對春化基因Vrn-A1、Vrn-B1、Vrn-D1、Vrn-2、Vrn-B3和光周期基因Ppd-D1進行分子檢測。PCR擴增引物等相關(guān)信息見表2。PCR擴增總體系

為10 μL，包括模板DNA 30～40 ng、10×buffer 1 μL、dNTPs 150 μmol·L-1、Taq DNA聚合酶1 U，引物每條5 pmol。反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性10 min;94℃變性45 s，50～65℃退火30 s，延伸43～90 s，共38個循環(huán);最后70℃延伸10 min。擴增產(chǎn)物用8%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳（Native-PAGE）檢測，定壓105 V電泳3.5 h，使用0.2%的硝酸銀溶液銀染2 min，去離子水洗滌2次，用3%的NaOH溶液顯色，最后用Tanon Gis-2010型凝膠成像系統(tǒng)照相觀察記錄分析擴增產(chǎn)物的片段大小。

1.2.2 小麥人工氣候室內(nèi)生育期鑒定

材料催芽后直接種植于98孔發(fā)苗盤中，每個材料重復3次。培養(yǎng)條件為16 h光照、8 h黑暗，溫度25℃，適時澆水，調(diào)查材料的抽穗日期和開花日期并記錄。

1.2.3 小麥田間生育期鑒定

試驗在山東農(nóng)業(yè)大學農(nóng)學實驗基地進行，每個品種種植兩行，行長1.5 m，行間距25 cm，常規(guī)田間管理，調(diào)查材料的抽穗日期和開花日期并記錄。

2 結(jié)果與分析

2.1 分子標記檢測結(jié)果

2.1.1 春化基因檢測在Vrn-A1位點上，用特異性引物VRN1AF/VRN1-INT1R對SN0594及其他22份材料進行檢測。結(jié)果（圖1A）表明，揚麥14和揚麥15兩份材料擴增出714 bp的條帶，說明在這兩份材料Vrn-A1位點上為顯性等位變異基因Vrn-A1b;SN0594擴增出（965+876）?bp條帶，證明該材料在Vrn-A1位點為顯性等位變異基因Vrn-A1a;在其他20份材料中均擴增出734 bp的條帶，說明這20份材料可能含有顯性等位變異基因Vrn-A1c或者隱性基因vrn-A1，待進一步檢測。在進一步檢測中，用特異性引物Intrl/A/F2和Intrl/A/R3檢測下均沒有擴增出1 170 bp的條帶，但在特異性引物Intrl/C/F和Intrl/AB/R引物檢測下這20份材料均擴增出1 068 bp的條帶（圖1B），說明這些材料在Vrn-A1位點上均為隱性基因vrn-A1。

在Vrn-B1位點上，用特異性引物Intrl/B/F和Intr/B/R3進行檢測，結(jié)果顯示，僅魯麥9號能擴增出709 bp的條帶，其余包括SN0594在內(nèi)的22份材料無條帶產(chǎn)生（圖2A），說明魯麥9號在Vrn-B1位點上為顯性等位變異基因Vrn-B1;用特異性引物Intrl/B/F和Intrl/B/R4進行檢測，結(jié)果顯示，SN0594等22份材料擴增出1 149 bp的條帶，魯麥9號無條帶產(chǎn)生（圖2B），說明SN0594等22份材料在Vrn-B1位點上為隱性基因vrn-B1。

在Vrn-D1位點上，用特異性引物Intrl/D/F和Intrl/D/R3進行檢測，結(jié)果顯示，中國春、揚麥11等15份材料擴增出1 671 bp的條帶，其余材料無條帶產(chǎn)生，說明中國春、揚麥11等15份材料在Vrn-D1位點上含有顯性等位變異基因Vrn-D1（圖3A）。用特異性引物Intrl/D/F和Intrl/D/R4進行檢測，SN0594和揚麥15、煙農(nóng)15等8份材料，擴增出997 bp的條帶，說明SN0594等8份材料在該位點上為隱性基因vrn-D1（圖3B）。

用一對引物V2ABD-F1/V2ABD-R2同時擴增六倍體小麥的三個ZCCT-1基因的啟動子區(qū)，包括302 bp的ZCCT-A1、294 bp的ZCCT-B1和320 bp的ZCCT-D1。分子標記結(jié)果（圖4）

顯示，揚麥14、揚麥15等15份材料缺失302 bp的ZCCT-A1，在Vrn-2位點上表現(xiàn)為隱性。SN0594、煙農(nóng)15等8份材料沒有發(fā)現(xiàn)缺失，在Vrn-2位點上表現(xiàn)為顯性。

在Vrn-B3位點上，用一對引物VRN4-B-NOINSF/VRN4-B-NOINSR進行檢測，結(jié)果顯示，23份小麥品種全部擴增出1 140 bp的條帶，說明這些品種在Vrn-B3位點上為隱性基因vrn-B3（圖5）。

2.1.2 光周期基因檢測

在光周期基因Ppd-A1和Ppd-B1位點上，未檢測到光周期不敏感型等位變異Ppd-A1a和Ppd-B1a，所有材料均攜帶光周期敏感型基因Ppd-A1b和Ppd-B1b。在Ppd-D1位點上，通過特異性引物Ppd-D1F和Ppd-D1R1的擴增，只有SN0594和中國春這兩份材料擴增出414 bp的條帶，說明SN0594和中國春在此位點上為光周期敏感型Ppd-D1b（圖6B）。其余21份材料在特異性引物Ppd-D1F和Ppd-D1R2的擴增下，擴增出288 bp的條帶，說明這21份材料在這個位點上為光周期不敏感型基因Ppd-D1a（圖6A）。

2.1.3 春化基因和光周期基因組合類型

分子標記檢測結(jié)果（表3）顯示，包括SN0594在內(nèi)的23份材料在Vrn-1位點上共存在6種春化基因型組合類型。其中，SN0594不同于其他供試材料，基因型組合為Vrn-A1a+vrn-B1+vrn-D1;揚麥14和揚麥15基因型組合分別為Vrn-A1b+vrn-B1+Vrn-D1和Vrn-A1b+vrn-B1+vrn-D1;魯麥9號vrn-A1+Vrn-B1+vrn-D1;揚麥11等14份材料基因型組合為vrn-A1+vrn-B1+Vrn-D1;煙農(nóng)15等5份材料為vrn-A1+vrn-B1+vrn-D1。SN0594在光周期基因位點Ppd-D1上含有對光周期敏感的Ppd-D1b基因，[JP]僅中國春在這個位點上與SN0594含有相同的基因，其他21份材料均為對光周期不敏感的Ppd-D1a基因。SN0594、煙農(nóng)15等8份材料在Vrn-2位點上為顯性，其它15份材料在Vrn-2位點表現(xiàn)為隱性。

根據(jù)分子標記檢測結(jié)果推測SN0594及其它供試材料冬春性（表3），推測原則為：Vrn-1位點有一個顯性等位變異即表現(xiàn)為春性，其中Vrn-A1的春性效應(yīng)最強，對顯性等位變異基因Vrn-B1和Vrn-D1具有上位性效應(yīng)，Vrn-B1和Vrn-D1對春化作用的敏感性較弱，[JP]Vrn-B1春性效應(yīng)強于Vrn-D1[20，29-31]，全為隱性時則表現(xiàn)為冬性[16];含有Vrn-2顯性基因的小麥春化特性表現(xiàn)為冬性，但當Vrn-1 和Vrn-3 基因為顯性基因時，Vrn-2 等位基因差異對開花時間的影響也會減弱或消除[22]。

小麥種質(zhì)系SN0594在Vrn-A1位點含有顯性等位變異基因Vrn-A1a;揚麥14和揚麥15在Vrn-A1位點含有顯性等位變異基因Vrn-A1b，且揚麥14還同時含有顯性等位變異基因Vrn-D1，兩品種在Vrn-2位點為隱性;魯麥9號在Vrn-B1位點檢測出含有顯性等位變異基因Vrn-B1，在Vrn-2位點為顯性。這四個小麥品種屬于春麥且SN0594春性最強，魯麥9號春性較SN0594、揚麥14和揚麥15弱。揚麥11、中國春和魯麥4號等14個品種在Vrn-D1位點檢測出含有春性效應(yīng)較弱的顯性等位變異基因Vrn-D1，除魯麥4號外其他13個品種在Vrn-2位點均為隱性等位基因。以上18個品種均為春麥，其中SN0594、揚麥14、揚麥15屬于春性較強的春麥，其次是魯麥9號，春性較弱的是中國春等14個品種。金鐸1號、煙農(nóng)15等5個品種在Vrn-1位點沒有檢測到顯性等位變異基因，除高38外，其他4個品種在Vrn-2位點均為顯性，說明這5個品種均屬于冬麥。

2.2 不同生活習性小麥品種人工氣候室抽穗期鑒定結(jié)果

23份供試材料在Vrn-1位點上共有6種春化基因型組合，在人工氣候室滿足長日照的條件下，比較分析其抽穗期和開花期（表4）發(fā)現(xiàn)：含有Vrn-A1a顯性等位變異基因的SN0594 35天即可完成抽穗，在所有供試材料中抽穗最早;含有兩個顯性等位變異基因Vrn-A1b和Vrn-D1的揚麥14和含有顯性等位變異基因Vrn-A1b的揚麥15分別比SN0594晚抽穗11和14天，說明含有Vrn-A1a顯性等位變異的品種被賦予較強的春性，即春性效應(yīng)Vrn-A1a>Vrn-A1b。含有顯性等位基因Vrn-B1的魯麥9號較含有Vrn-A1顯性等位變異基因的品種抽穗晚，說明顯性等位變異基因春性效應(yīng)Vrn-A1>Vrn-B1;僅含有Vrn-D1顯性等位變異的14個品種抽穗期差異明顯，揚麥158抽穗最早，揚輻麥6號和揚輻麥9號則抽穗最晚，均比揚麥158晚19天，推測除在Vrn-1位點的影響下，可能還有其他因素的影響。泰山5號和煙農(nóng)15等5個供試材料在Vrn-1位點上不存在顯性等位變異基因，調(diào)查發(fā)現(xiàn)：煙農(nóng)15等3份材料表現(xiàn)出明顯的冬性，在不經(jīng)過低溫春化的條件下，無法進入生殖生長;泰山5號和高38較春麥抽穗晚，仍能在不經(jīng)低溫春化的條件下抽穗開花，說明Vrn-1位點的春化基因雖對小麥生育期有決定性的影響，但不能保證品種完全的冬性或春性，尚存在影響小麥冬春性的其它因素，待進一步發(fā)掘。

2.3 不同生活習性小麥品種田間抽穗期鑒定結(jié)果[JP]

田間調(diào)查發(fā)現(xiàn)經(jīng)過冬季低溫春化，供試材料生育期存在明顯差異（表5）。SN0594和中國春兩品種抽穗期分別為206天和208天，抽穗比其他供試材料晚，分析原因可能為：兩品種在Ppd-D1位點上含有光周期基因Ppd-D1b，因此在光照時間無法達到植物從營養(yǎng)生長進入生殖生長的條件時，無法進入抽穗階段。說明除春化基因外，光周期基因?qū)π←溕谝灿幸欢ㄓ绊?。絕大多數(shù)春麥抽穗期在192～197天之間，含有顯性等位基因Vrn-D1的揚輻麥4號、揚輻麥6號等抽穗最早，為192天，較SN0594提前14天;揚麥14在春麥系列中抽穗也較晚，抽穗期203天。經(jīng)過冬季低溫春化的冬性小麥泰山5號、魯麥6號等抽穗期較早，泰山5號抽穗期為192天，魯麥4號和魯麥6號抽穗期為193天;冬麥金鐸1號抽穗較晚，抽穗期為200天。由此可見，在Vrn-1位點的不同顯性等位變異在品種經(jīng)過低溫春化后并沒有表現(xiàn)出與其基因型一致的春性效應(yīng)趨勢。

3 討論

3.1 新種質(zhì)SN0594的利用價值

本實驗室創(chuàng)制的小麥新種質(zhì)SN0594具有在人工氣候室內(nèi)不經(jīng)春化處理的條件下可較早抽穗開花的特性，且抗凍性較好，對其春化基因和光周期基因進行分子水平的檢測，結(jié)果顯示：小麥新種質(zhì)SN0594在春化基因Vrn-A1位點含有顯性等位變異基因Vrn-A1a，在Vrn-2位點為顯性等位變異;在光周期基因位點Ppd-D1上含有對光周期敏感的Ppd-D1b基因。對該材料和不同生育期小麥品種在不同光溫環(huán)境下的生育期鑒定發(fā)現(xiàn)，該材料在滿足長日照條件下不經(jīng)低溫春化可較其他材料更早地進入生殖生長，證明顯性等位變異基因Vrn-A1a賦予該材料較強的春性效應(yīng);且根據(jù)田間的生育期調(diào)查結(jié)果，該材料在經(jīng)過冬季低溫春化后仍能夠進入生殖生長，但生育期延長，證明除了春化基因以外，光周期Ppd-D1b等其他基因?qū)π←溕谝簿哂幸欢ǖ挠绊?，需滿足一定的長日照條件才能促使小麥抽穗開花。因此，該材料在春化和光周期反應(yīng)特性研究上具有重要的利用價值。

3.2 不同春化基因型組合品種光溫反應(yīng)

根據(jù)不同生活習性小麥品種在人工氣候室和田間不同生長條件的生長發(fā)育比較發(fā)現(xiàn)，在人工氣候室不經(jīng)春化的條件下，不同生活習性小麥總體上表現(xiàn)為春性越強的小麥品種抽穗越早，SN0594抽穗期為35天，揚麥14和揚麥15抽穗期也較早。抽穗期差異較大的是在Vrn-1位點上含有顯性等位基因Vrn-D1的品種。根據(jù)田間生育期調(diào)查發(fā)現(xiàn)，不同生活習性的小麥品種在經(jīng)過越冬低溫春化后，生育期與在人工氣候室發(fā)生明顯變化。SN0594和中國春抽穗較其他品種晚，分析原因是兩個品種在Ppd-D1位點上含有對光周期敏感的Ppd-D1b基因，需要滿足一定的長日照條件才能促使小麥抽穗開花。該現(xiàn)象證明除了春化基因以外，光周期基因Ppd-D1b對小麥生育期影響也較大。揚麥14等春性較強的春麥在田間抽穗期反而較煙農(nóng)15等冬麥晚，冬麥泰山5號、煙農(nóng)15等在經(jīng)過冬季低溫春化后，抽穗反而較春麥早，該現(xiàn)象說明在Vrn-1位點含有顯性等位變異基因的春麥在越冬后，春性效應(yīng)減弱甚至消失，也可能存在環(huán)境或其他基因的影響使小麥生育期在田間發(fā)生變化。因此我們認為品種的冬春性與其生育期長短并沒有絕對的關(guān)系，根據(jù)生育期對小麥冬春性的判定可靠性并不高。

綜上，本研究對一些小麥品種的分子檢測結(jié)果與田間表型不完全一致的現(xiàn)象推測原因如下：一是可能還存在其他影響小麥春化基因尚未挖掘，已發(fā)現(xiàn)的一些春化基因其作用機制還待進一步探究（如： Vrn-4）;二是一些光周期基因的表達也會影響小麥的抽穗和開花，且Vrn-2基因的表達易受短日照調(diào)節(jié)，Vrn-3基因的表達易受長日照調(diào)節(jié)。植物中可能存在復雜的春化和光周期基因網(wǎng)絡(luò)通路，對春化作用的時間、強度和作用效果起著極其精細的調(diào)控作用，有待于進一步的發(fā)掘。

4 結(jié)論

分析發(fā)現(xiàn)小麥新種質(zhì)SN0594在Vrn-1位點存在顯性等位變異基因Vrn-A1a，在Ppd-D1位點上存在等位變異Ppd-D1b基因，不需春化即可開花完成生育期，且抗凍性較其他春麥好，在小麥遺傳改良中具有重要的利用價值。

春化基因Vrn-1是控制小麥春化效應(yīng)的主要基因，不同的顯性等位變異基因小麥春性效應(yīng)不同，春性效應(yīng)大小為Vrn-A1a>Vrn-[JP]A1b>Vrn-B1>Vrn-D1;含有同一顯性變異基因的小麥品種抽穗期也具有一定的差別。

參 考 文 獻：

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