樹鼩連接黏附分子A 的基因克隆及初步功能研究

李曉飛, 孫曉梅, 王文廣, 匡德宣, 陸彩霞, 仝品芬, 罕園園, 李 娜, 代解杰

(中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院/北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所樹鼩種質(zhì)資源中心, 昆明 650118)

連接黏附分子A(junctional adhesion molecule A，JAM-A)是具細(xì)胞黏附作用的細(xì)胞免疫球蛋白超家族成員，也稱之為JAM-1、JAM1 和F11R。JAM-A 在胚胎發(fā)育、正常組織結(jié)構(gòu)維持、炎性反應(yīng)與免疫應(yīng)答、創(chuàng)傷修復(fù)、腫瘤轉(zhuǎn)移等多種生理病理過(guò)程中發(fā)揮重要作用[1]。此外，JAM-A 還可作為病毒感染受體，是目前發(fā)現(xiàn)的哺乳動(dòng)物呼腸孤病毒(mammalian reovirus，MRV)建立外周感染的高親和力受體，通過(guò)依賴β1 整合素介導(dǎo)MRV內(nèi)化病毒進(jìn)入細(xì)胞[2]。JAM-A 的膜遠(yuǎn)端免疫球蛋白樣D1結(jié)構(gòu)域的同源二聚化是與MRV結(jié)合所必需[3]。

MRV 是一種雙鏈RNA 病毒，經(jīng)糞口途徑進(jìn)入胃腸道后被黏膜表面唾液酸受體(sialic acid，SA)吸附束縛，經(jīng)消化系統(tǒng)蛋白酶作用轉(zhuǎn)化成感染性亞病毒顆粒后，結(jié)合腸上皮細(xì)胞表面JAM-A受體感染腸道[4]。新生小鼠腸道微絨毛可介導(dǎo)MRV 快速感染，而成年小鼠微絨毛細(xì)胞不感染。MRV 行至小腸隱窩(特別是回腸)，被特化的濾泡相關(guān)上皮細(xì)胞即一種微褶皺膜樣上皮細(xì)胞(membranous/microfold cell, M 細(xì)胞)攝取轉(zhuǎn)吞至Peyer Patches 淋巴結(jié)，被腸相關(guān)淋巴組織捕獲后穿過(guò)基底細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)入血液，與血細(xì)胞表面JAM-A 相互作用介導(dǎo)血行傳播，在次級(jí)復(fù)制點(diǎn)穿過(guò)血管內(nèi)皮細(xì)胞與組織細(xì)胞受體結(jié)合，導(dǎo)致外周組織器官感染。MRV經(jīng)呼吸道進(jìn)入宿主肺部后，經(jīng)蛋白酶降解為感染性亞病毒顆粒，通過(guò)JAM-A 受體感染Ⅰ型肺泡上皮細(xì)胞，造成閉塞型支氣管炎、間質(zhì)性肺炎等。覆蓋于支氣管相關(guān)淋巴組織的M細(xì)胞將MRV攝取并轉(zhuǎn)吞進(jìn)入肺相關(guān)淋巴組織，然后進(jìn)入血液傳播[5]。

已知M R V 的分離宿主物種包括人、鳥、牛、猴、羊、豬、狒狒和蝙蝠等[6]。雖然MRV在多數(shù)情況下僅引起宿主輕微癥狀，但亦有許多研究[7]報(bào)道MRV 導(dǎo)致單一宿主或動(dòng)物種群爆發(fā)呼吸道疾病、胃腸炎、膽道閉鎖、腦水腫或腦脊髓炎等疾病，因此，對(duì)MRV 感染的研究和監(jiān)視仍然是必要的。樹鼩與人類及非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物有較高的遺傳同源性，在病毒感染和臨床前藥物開發(fā)研究中具有獨(dú)特價(jià)值，這種新型實(shí)驗(yàn)動(dòng)物正在成為生命科學(xué)研究的有力工具[8]。先前的研究多次從樹鼩體內(nèi)分離出呼腸孤病毒[9-11]，這些研究為樹鼩可能是呼腸孤病毒易感宿主的觀點(diǎn)提供了有力證據(jù)。但迄今為止，尚無(wú)有關(guān)樹鼩JAM-A分子克隆和JAM-A作為樹鼩感染呼腸孤病毒受體的研究報(bào)道。因此，本研究采用cDNA 末端快速克隆(rapid-amplification of cDNA ends, RACE)技術(shù)獲得樹鼩JAM-A 全長(zhǎng)編碼序列，并對(duì)其序列和分子特征進(jìn)行分析，在樹鼩原代肺細(xì)胞水平驗(yàn)證了JAM-A作為呼腸孤病毒受體入侵樹鼩原代肺泡細(xì)胞(primary tree shrew alveolar epithelial cells,pTAECs)的作用機(jī)制，為今后應(yīng)用樹鼩建立呼腸孤病毒感染模型并研究其感染機(jī)制奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

人工繁育的健康成年雄性樹鼩1 只，3 月齡，體質(zhì)量90～110 g，來(lái)源于醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所樹鼩種質(zhì)資源中心[SCXK(滇)K2013-0001]。實(shí)驗(yàn)操作在醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所樹鼩種質(zhì)資源中心進(jìn)行[SYXK(滇)K2013-0001]。所有操作均符合實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理學(xué)要求(倫理審批號(hào)DWSP201803034)。

1.2 細(xì)胞和毒株

樹鼩pTAECs 由1～2 日齡的新生樹鼩分離培養(yǎng)獲得。細(xì)胞感染所用病毒株為本實(shí)驗(yàn)室自患病樹鼩糞便中分離純化的呼腸孤病毒株MRV3/TS/2012。

1.3 試劑與儀器

TRIzol 試劑購(gòu)自日本TaKaRa 公司，反轉(zhuǎn)錄合成第一鏈cDNA 試劑盒和PCR 預(yù)混液均購(gòu)自立陶宛Fermentas 公司，RACE 擴(kuò)增試劑盒購(gòu)自美國(guó)Clontech 公司，膠原酶Ⅺ C7657、神經(jīng)氨酸酶(NA)(產(chǎn)氣莢膜梭菌)和抗JAM-A抗體(ab180821)均購(gòu)自英國(guó)Abcam 公司，抗3 型呼腸孤病毒抗體9BG5 購(gòu)自美國(guó)LSBio 公司，F(xiàn)ITC 標(biāo)記的羊抗鼠IgG SA00003-1 購(gòu)自美國(guó)Proteintech 公司，梯度PCR儀購(gòu)自日本TaKaRa公司，實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)儀購(gòu)自美國(guó) Bio-Rad 公司，倒置熒光顯微鏡購(gòu)自日本Nikon 公司。

1.4 方法

1.4.1 組織采集和總RNA 提取 給樹鼩腹腔注射過(guò)量1%戊巴比妥鈉以麻醉后實(shí)施安死術(shù)，無(wú)菌打開腹腔、胸腔和顱腔，取約100 mg 相關(guān)組織塊置于無(wú)菌無(wú)酶1.5 mL 離心管中，加入1 mL TRIzol 試劑，放入DEPC 水處理過(guò)的鋼珠，在高通量組織研磨儀中300 Hz 研磨3 min，獲取組織勻漿。采集心臟抗凝全血200 μL。完成大腦、舌、食道、心、肺、肝、膽囊、胃、脾、十二指腸、空腸、回腸、盲腸、結(jié)腸、直腸、腎、膀胱、睪丸、小腦、海馬、顳葉、額葉、頂葉、枕葉和視交叉 25 個(gè)組織和血液的總 RNA 提取，洗滌后的白色RNA 沉淀用40 μL DEPC 水溶解，用NanoDrop 1000 分光光度計(jì)測(cè)定提取的RNA濃度和純度。

1.4.2 PCR 和RACE 首先，擴(kuò)增出JAM-A 基因的中間序列。參照試劑盒使用說(shuō)明書配制反轉(zhuǎn)錄體系，反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA。以該cDNA 為模板，用JAM-A 中間序列特異性引物(表1)，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，克隆測(cè)序獲取JAM-A 的中間序列。其次，應(yīng)用RACE 技術(shù)和PCR 擴(kuò)增JAM-A 基因的3'端和5'端序列。按照J(rèn)AM-A 中間序列設(shè)計(jì)5'端序列特異性引物(GSP)和3'端GSP(表1)。參照反轉(zhuǎn)錄合成第一鏈cDNA 試劑盒說(shuō)明，分別合成5'RACE cDNA 和3'RACE cDNA。以5'RACE cDNA 為模板、5'端GSP 和自帶接頭引物，進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。以3'RACE cDNA 為模板、3'端GSP 和自帶接頭引物，進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。取擴(kuò)增產(chǎn)物于1.5%瓊脂糖凝膠(含0.5 μg/mL 溴化乙錠)進(jìn)行電泳檢測(cè)，膠回收純化PCR 產(chǎn)物，克隆測(cè)序獲取JAM-A 的3'端和5' 端序列。最后，將中間序列和兩端序列進(jìn)行拼接，獲取樹鼩JAM-A 的全長(zhǎng)cDNA 序列。

表1 JAM-A 基因擴(kuò)增引物Table 1 Amplification primers for the junctional adhesion molecule A (JAM-A) gene

1.4.3 qRT-PCR檢測(cè)JAM-A的組織表達(dá)分布 根據(jù)JAM-A 的全長(zhǎng)cDNA 序列，設(shè)計(jì)合成引物和探針(表2)，制備標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒，參照TaKaRa 一步法實(shí)時(shí)定量RT-PCR 試劑盒制備標(biāo)準(zhǔn)曲線。使用1.4.1節(jié)提取的各組織總RNA，以管家基因GAPDH作為內(nèi)參基因，測(cè)定JAM-A mRNA 在樹鼩26 個(gè)組織中的基因拷貝數(shù)。

表2 JAM-A 基因定量探針及引物 Table 2 The probe and primers for quantitative detection of junctional adhesion molecule A (JAM-A) gene

1.4.4 樹鼩JAM-A 基因序列分析 對(duì)拼接后樹鼩J AM-A 基因的c DN A 序列全長(zhǎng)進(jìn)行分析，用Unipro UGENE 軟件分析其編碼氨基酸。與GenBank 數(shù)據(jù)庫(kù)中已有的JAM-A 基因進(jìn)行比對(duì)，使用MEGA6.0 軟件最大似然法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.4.5 樹鼩pTAECs培養(yǎng) 用清洗液[Hank's平衡鹽溶液(不含Mg2+、Ca2+)，添加1%雙抗，0.5 mmol/L二硫蘇糖醇]清洗肺組織數(shù)次至上清液澄清。將肺剪碎成1 mm2大小的組織塊，再用清洗液清洗數(shù)次至上清液澄清，靜置10 min，去除清洗液。加入5 mL 0.125%胰蛋白酶，置于孵箱內(nèi)37 ℃消化0.5 h，每10 min 搖晃一次。加入含5%血清的DMEM 完全培養(yǎng)液終止胰蛋白酶的消化，1 200 r/min 離心5 min，棄上清液，用1 mL 吸頭吸取肺組織塊，均勻分布于細(xì)胞培養(yǎng)瓶底部，倒置培養(yǎng)瓶，加入5 mL 培養(yǎng)液，置于37 ℃、5%CO2條件下倒置培養(yǎng)1 h。正置培養(yǎng)瓶，繼續(xù)培養(yǎng)，每3 d 更換一次培養(yǎng)液。

1.4.6 病毒感染和抗體阻斷 從培養(yǎng)箱中取出用12 孔板培養(yǎng)的80%～90%融合的pTAECs，棄培養(yǎng)液，用PBS 洗3 次，按如下方式進(jìn)行處理：PBS 處理組，加入PBS，與細(xì)胞相互作用1 h；抗JAM-A 處理組，加入JAM-A 抗體(50 μg/mL)，與細(xì)胞相互作用1 h；NA 處理組，加入NA(50 mU/mL)，與細(xì)胞相互作用1 h；抗JAM-A 和NA 共同處理組，加入 JAM-A 抗體(50 μg/mL)與NA(50 mU/mL)，共同與細(xì)胞相互作用1 h。所有實(shí)驗(yàn)孔中，棄去與細(xì)胞表面分子相互作用的處理劑，加入MRV3/TS/2012 病毒液(滴度為106.5TCID50/mL)吸附液，4 ℃吸附1 h(每隔15 min，輕輕振搖1 次)，洗去病毒吸附液，37 ℃繼續(xù)培養(yǎng)24 h。

1.4.7 病毒抗原的免疫熒光染色 感染后細(xì)胞在37 ℃下條件孵育24 h 以完成病毒的一步生長(zhǎng)復(fù)制，立刻將單層細(xì)胞用1 mL 質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4%的多聚甲醛溶液固定20 min，進(jìn)行病毒抗原σ 1 的免疫熒光染色，一抗為抗3 型呼腸孤病毒抗體9BG5，二抗為FITC 標(biāo)記的山羊抗鼠IgG。鏡下觀察間接免疫熒光，受感染的細(xì)胞質(zhì)顯現(xiàn)強(qiáng)烈的綠色熒光，細(xì)胞核無(wú)病毒抗原熒光。pTAECs 的每個(gè)處理孔隨機(jī)選擇3 個(gè)視野進(jìn)行熒光圖片的采集，使用Image Pro Plus 6.0圖像分析軟件，進(jìn)行吸光度校正，讀取熒光面積和A 值。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用GraphPad Prism 6.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，多組間比較采用單因素方差分析，處理組與PBS 組間比較采用非配對(duì) t 檢驗(yàn)，P ＜0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 基因片段擴(kuò)增結(jié)果

RT-PCR 擴(kuò)增出JAM-A 基因的中間序列片段如電泳圖1A 所示，RACE PCR 擴(kuò)增出JAM-A 基因的5'端和3'端基因片段如電泳圖1B 和圖1C所示。

2.2 JAM-A 基因特征

JAM-A 基因cDNA 全長(zhǎng)2 962 bp，編碼274氨基酸，其氨基酸序列與貓的JAM-A 高度相似(圖2A)。系統(tǒng)發(fā)育樹(圖2B)顯示，樹鼩JAM-A基因序列與犬(Canis lupus familiaris)、貓(Felis catus)、牛(Bos taurus)最為相似，自然聚類在同一分支，之后與人和獼猴(Macaca mulatta)聚類為一支，最后與小鼠(Mus musculus)和褐家鼠(Rattus norvegicus)聚類為一支，而斑馬魚(Danio rerio)則在哺乳動(dòng)物聚類分支以外的分支。

2.3 組織表達(dá)量分布

繪制樹鼩25個(gè)組織和血液中的JAM-A相對(duì)表達(dá)量(以海馬為1)柱狀圖(圖3)。結(jié)果顯示，JAM-A廣泛表達(dá)于樹鼩的外周組織，呼吸道和消化道中表達(dá)水平較高。

2.4 阻斷JAM-A 可抑制呼腸孤病毒對(duì)pTAECs的感染

pTAECs 的病毒抗原免疫熒光染色和綠色熒光A 值統(tǒng)計(jì)結(jié)果(圖4)顯示，pTAECs 是呼腸孤病毒容納細(xì)胞，抗JAM-A 抗體(50 μg/mL)單獨(dú)作用在一定程度上抑制了呼腸孤病毒株MRV3/TS/2012的吸附感染效率(P ＜0.000 1)，NA(50 mU/mL)單獨(dú)作用一定程度上抑制了MRV3/TS/2012病毒的吸附感染效率(P ＜0.000 1)；JAM-A(50 μg/mL)和NA(50 mU/mL)共同作用于pTAECs表面的JAM-A和SA 分子，可最大程度地抑制呼腸孤病毒的感染

圖1 JAM-A 基因片段電泳圖Figure 1 Electrophoresis bands of junctional adhesion molecule A (JAM-A) gene fragments

圖2 JAM-A氨基酸序列分析及基因系統(tǒng)發(fā)育樹(最大似然法; 步長(zhǎng): 1 000 times)Figure 2 Amino acid analysis and phylogenetic tree of junctional adhesion molecule A (JAM-A) gene

圖3 樹鼩25個(gè)組織和血液中JAM-A mRNA 的表達(dá)水平Figure 3 Expression levels of junctional adhesion molecule A (JAM-A) mRNA in 25 tissues and blood of tree shrew

圖4 阻斷JAM-A可抑制呼腸孤病毒株MRV3/TS/2012對(duì)樹鼩原代肺泡細(xì)胞(pTAECs)的感染 Figure 4 Blocking of junctional adhesion molecule A (JAM-A) inhibits reovirus MRV3/TS/2012 infection of tree shrew pTAECs

(P ＜0.000 1)。

3 討論

樹鼩作為一種新型實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，已成為研究多種人類疾病如抑郁癥、近視、乙型肝炎和丙型肝炎病毒感染等的良好模型[12]。本課題組多次從樹鼩體內(nèi)分離到呼腸孤病毒，認(rèn)為樹鼩可能是研究呼腸孤病毒感染機(jī)制的良好模型。已知呼腸孤病毒入侵宿主細(xì)胞的受體有SA、JAM-A 和NgR1，但該病毒的致病機(jī)制和感染嗜性仍有待深入研究。研究人員已于2013 年完成了中緬樹鼩全基因組序列的注釋[12]，此研究對(duì)了解樹鼩的遺傳基礎(chǔ)具有重大意義。但以往發(fā)表的JAM-A 序列殘缺不全。本研究首次克隆JAM-A 基因的完整序列，對(duì)其分子特征進(jìn)行全面詳細(xì)的解析，為今后研究JAM-A 分子及功能奠定了基礎(chǔ)；同時(shí)采用抗細(xì)胞受體法初步驗(yàn)證了JAM-A作為呼腸孤病毒入侵樹鼩細(xì)胞受體的功能。

呼腸孤病毒σ1 與靶細(xì)胞表面SA 結(jié)合，病毒顆粒在細(xì)胞表面橫向擴(kuò)散，促進(jìn)與JAM-A 高親和力結(jié)合，在低pH 微環(huán)境下依賴細(xì)胞膜上微管蛋白和Src 激酶協(xié)助內(nèi)吞進(jìn)入細(xì)胞[13-15]。本研究應(yīng)用NA 消解表面的SA，用抗JAM-A 抗體封閉細(xì)胞表面的JAM-A，在pTAECs 水平驗(yàn)證了JAM-A對(duì)呼腸孤病毒感染的介導(dǎo)作用。單獨(dú)使用抗JAM-A 抗體或NA 對(duì)細(xì)胞保護(hù)效果遠(yuǎn)低于同時(shí)阻斷JAM-A 和SA，說(shuō)明JAM-A 和SA 在介導(dǎo)呼腸孤病毒感染的功能上具有協(xié)同作用[16]。樹鼩JAM-A mRNA 主要在器官組織表達(dá)，其中肺部表達(dá)量最高，膽囊和直腸次之，在血液細(xì)胞中也有表達(dá)。樹鼩JAM-A 基因和氨基酸序列與貓相似性最高。值得注意的是，2015 年在貓科動(dòng)物果子貍體內(nèi)分離到一株Ⅲ型呼腸孤病毒[17]，鼻內(nèi)感染雌性BALB/c小鼠引起致命性的呼吸系統(tǒng)損傷，在肺組織中具有較其他組織更高的病毒滴度。Ⅲ型呼腸孤病毒在樹鼩肺部的病毒滴度可能更高，并造成對(duì)肺部的健康威脅，這是值得高度警惕的。

綜上所述，本研究首次克隆并分析了JAM-A分子的基因序列全長(zhǎng)，分析了JAM-A 的分子遺傳進(jìn)化關(guān)系，進(jìn)一步說(shuō)明了樹鼩較其他實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有更高的遺傳分類學(xué)地位。JAM-A 在樹鼩體內(nèi)主要組織器官的受體分布為研究呼腸孤病毒感染樹鼩的靶器官親嗜性提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)，細(xì)胞水平抗體阻斷可抑制呼腸孤病毒感染，進(jìn)一步驗(yàn)證了JAM-A 是介導(dǎo)呼腸孤病毒感染受體?？梢钥闯觯裟c孤病毒對(duì)樹鼩不同組織感染可依賴于不同的受體分子，體現(xiàn)了呼腸孤病毒的高度進(jìn)化和環(huán)境適應(yīng)性。這項(xiàng)研究為了解呼腸孤病毒和宿主之間的相互作用關(guān)系提供了基礎(chǔ)資料。