白及多糖脂質體的制備及對酪氨酸酶活性的影響

孔令悅 向 華 唐克華 董愛文 唐忠海

(1. 湖南農業(yè)大學生物科學技術學院，湖南 長沙 410128；2. 湖南農業(yè)大學食品科學技術學院，湖南 長沙 410128； 3. 吉首大學林產(chǎn)化工工程湖南省重點實驗室，湖南 張家界 427000)

白及多糖(Bettila striata polysaccharde，BSP)為無味白色細纖維狀，易溶于熱水，不溶于高濃度有機溶劑。具有止血[1]、抗腫瘤[2]、抗菌[3]等生物活性。其提取物對光敏感、易氧化、易醇沉。現(xiàn)有的白及多糖修飾方法主要為通過有機酸(膽甾醇琥珀酸、硬脂酸、磷酸、葉酸等)對其進行酯化和醛化等化學修飾法，該方法降低了白及多糖的還原性。酪氨酸酶是一種氧化酶，可通過氧化L-多巴的羥基，調控人體黑色素和瓜果褐變的生成[4]。

脂質體是由與皮膚結構相似的雙親性分子組成[5]，可以使白及多糖更好地透過人體表皮，并在皮膚細胞中積累，達到美白效果。試驗擬采用納米脂質體法制備高含量白及多糖脂質體，并研究其對酪氨酸酶的影響，旨在為白及多糖在美白化妝品、保健食品、食品添加劑等方面的應用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

1.1.1 材料與試劑

白及塊莖：廣州民信藥業(yè)連鎖有限公司；

酪氨酸酶：上海源葉生物科技有限公司；

辛酸/癸酸甘油三酯PEG-8辛酸/癸酸甘油酯類：廣州市衡拓貿易有限公司；

鯨蠟硬脂醇聚醚-25：廣州合孚化工有限公司；

月桂醇聚醚-23：廣州市奧源貿易有限公司；

乙氧基二甘醇：上海蒲恩生化科技有限公司；

PEG-30二聚羥基硬脂酸酯：廣州利美達進出口商貿有限公司；

辛酸/癸酸甘油三酯：美國英狄士公司；

1,2戊二醇：廣州艾比特貿易有限公司；

1,2己二醇：廣州露途化工有限公司；

對羥基苯乙酮：廣州欣浪生物化工有限公司；

生理鹽水：辰欣藥業(yè)股份有限公司。

1.1.2 儀器與設備

中草藥破碎機：1000Y型，天向九太(大連)商貿有限公司；

電子分析天平：FA2204N型，上海力辰儀器有限公司；

旋轉蒸發(fā)儀：RE-52A型，上海亞榮生化儀器廠；

臺式離心機：TGL-16B型，上海圣科儀器設備有限公司；

紫外—可見分光光度計：722S型，上海菁華科技儀器有限公司；

電動攪拌機：GZI20型，江陰科研器械有限公司；

均質機：500W型，北京海福達科技有限公司；

激光粒度儀：3000 HSA型，英國馬爾文儀器公司；

全自動酶標儀：MR-96A型，南京貝登醫(yī)療股份有限公司；

熒光分光光度計：F-380型，天津港東科技發(fā)展股份有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 白及多糖的提取與純化 采用熱水回流提取法提取、醇沉法純化[6]。

1.2.2 白及多糖脂質體的制備 將油相(1%～10%辛酸/癸酸甘油三酯PEG-8辛酸/癸酸甘油酯類、1%～10%鯨蠟硬脂醇聚醚-25、1%～10%月桂醇聚醚-23、1%～10%乙氧基二甘醇、5%～25% PEG-30二聚羥基硬脂酸酯、5%～20%辛酸/癸酸甘油三酯)與水相(水、25%白及多糖)分別加熱至85～90 ℃，12 000 r/min下將油相快速倒入水相中均質3 min；攪拌降溫至70 ℃時加入防腐劑(1, 2戊二醇，1, 2己二醇，對羥基苯乙酮)，冷卻，即制得25%白及多糖脂質體。

1.2.3 透皮滲透行為 豬腹部皮膚(未經(jīng)開水燙，去除毛發(fā))裁剪成適當大小，皮膚角質層朝上，固定于Franz-type擴散池中。用去離子水配制0.50 mg/mL白及多糖溶液和100 mg/mL白及多糖脂質體溶液。取待測樣品100 mL均勻涂布于皮膚上，接受池中加入100 mL生理鹽水，37 ℃恒溫水浴并攪拌。分別于涂布后定時吸取接受液1 mL，采用苯酚—硫酸法測定白及多糖濃度。待測樣品為白及多糖脂質體、白及多糖，去離子水為對照。

1.2.4 酪氨酸酶活力及其抑制率的測定

(1) 白及多糖脂質體溶液的配制：將128 mg白及多糖脂質體溶于10 mL 0.2 mol/L的磷酸緩沖溶液中，再分別稀釋成6.4，3.2，1.6 mg/mL溶液。

(2) 酪氨酸酶抑制率的測定：參照文獻[7]的方法并稍作改動。取3 mL 0.2 mol/L的磷酸緩沖溶液于10 mL試管中，加入0.1 mg/mL酪氨酸酶溶液(用0.2 mol/mL pH 7.5的磷酸緩沖溶液溶解)1 mL。加入濃度為12.8，6.4，3.2，1.6 mg/mL的白及多糖脂質體溶液各1 mL，混勻，以1 mL磷酸緩沖溶液為空白組，37 ℃孵育30 min。用酶標儀測定OD475 nm值，并按式(1)計算抑制率。

(1)

式中：

R——酪氨酸酶抑制率，%；

Fco——白及多糖脂質體的OD475 nm值；

Fob——空白組的OD475 nm值。

(3) 半抑制濃度的測定：以白及多糖脂質體濃度為橫坐標，酪氨酸酶抑制率為縱坐標，繪制回歸曲線，并計算半抑制濃度IC50[8]。

1.2.5 熒光光譜分析 向10 mL試管中加入2 mg/mL的酪氨酸酶溶液1 mL，加入濃度為0.0，1.6，3.2，6.4，12.8 mg/mL的白及多糖脂質體溶液各1 mL，混勻，分別加入20，15，10，5 mg多巴粉末，用3 mL磷酸緩沖溶液(0.2 mol/L)進行溶解。37 ℃孵育30 min，于熒光分光光度計上進行熒光譜掃描和測定。光譜條件：掃描溫度25 ℃，激發(fā)波長295 nm，掃描范圍295～400 nm，激發(fā)狹縫2.5 nm，掃描速度240 nm/min，發(fā)射狹縫2.5 nm。

1.2.6 熒光猝滅機制分析 按式(2)確定熒光猝滅類型。

Fo/Fc=1+Ks[Q]=1+Kqτ0[Q]，

(2)

式中：

Fo——熒光體不含抑制劑時的最大熒光強度；

Fc——熒光體含白及多糖脂質體的最大熒光強度；

Ks——Stern-Volmer猝滅常數(shù)；

[Q]——抑制劑濃度，mg/mL；

Kq——雙分子猝滅過程速率常數(shù)，L/mol；

τ0——生物大分子的熒光壽命，約為10-8s。

當小分子與大分子結合時，其結合位點數(shù)n與結合常數(shù)Ka按式(3)計算。

lg[(Fo-Fc)/Fc]=nlgKa-nlog{1/〔[Qd]-(Fo-Fc)[Qp]/Fo〕}，

(3)

式中：

n——藥物小分子與生物大分子相互作用的結合位點數(shù)；

Ka——結合常數(shù)，L/(mol·s)；

[Qd]——猝滅劑濃度，mg/mL；

[Qp]——L-多巴濃度，mg/mL。

1.2.7 紫外光譜分析 取濃度為2 mg/mL的酪氨酸酶溶液1 mL，加入濃度為12.8 mg/mL的白及多糖脂質體溶液1 mL，用磷酸緩沖溶液補齊使溶液總體積為5 mL，混勻，37 ℃孵育30 min，空白組為不加白及多糖脂質體，于420～500 nm處進行紫外吸收光譜掃描。

1.2.8 數(shù)據(jù)處理 采用Origin 6.1軟件進行數(shù)據(jù)分析處理和繪圖。

2 結果與分析

2.1 穩(wěn)定性

白及多糖脂質體為半透明液體、無味，3 000 r/min離心30 min未出現(xiàn)分層現(xiàn)象。28 d耐熱/耐寒試驗發(fā)現(xiàn)，白及多糖脂質體未出現(xiàn)變色、變味、分層、渾濁等異?，F(xiàn)象，自然光照條件下連續(xù)放置28 d也未出現(xiàn)變色、變味、分層、渾濁等異?，F(xiàn)象。初步判斷制得的白及多糖脂質體穩(wěn)定性良好。

2.2 粒徑和包封率

由圖1可知，樣品徑粒分布均勻，分布范圍適當。經(jīng)動態(tài)光散射處理，制備的脂質體平均粒徑為5.72 μm。

試驗發(fā)現(xiàn)，脂質體包封率數(shù)據(jù)離散度較小，平均包封率為87.15%，說明該工藝重現(xiàn)性良好。

2.3 透皮吸收情況

顆粒進入皮膚的方式主要有3種：① 粒徑>10 μm的顆粒不能滲入，保留在皮膚表面；② 粒徑為3～10 μm的顆粒適合滲入皮脂腺—毛囊單元；③ 可通過在毛干周圍開口的毛囊漏斗滲入，粒徑<3 μm的顆粒可滲入角蛋白細胞胞間。由圖2可知，當透皮吸收時間為8 h 時，白及多糖達最大透過量，其透皮效果較差。白及多糖脂質體粒徑為3～10 μm，顯著增加了白及多糖的透皮滲透效果，其透過量為白及多糖的3倍，當透皮吸收時間為16 h時接近最大透過量，說明該脂質體已滲入皮脂腺—毛囊中。

圖1 25%白及多糖脂質體的粒徑分布圖

Figure 1 Particle size distribution of 25%Bettilastriatapolysaccharde liposomes

2.4 白及多糖脂質體對酪氨酸酶抑制率的影響

由圖3可知，白及多糖脂質體對酪氨酸酶的抑制率隨脂質體濃度的增加而增大，且具有一定的線性關系，當白及多糖脂質體濃度為2 mg/mL時，抑制率達40%，說明脂質體保留了白及多糖的還原性。白及多糖的IC50為11.56 mg/mL。

圖2 白及多糖及其脂質體透皮吸收效果

Figure 2 Transdermal absorption ofBettilastriatapolysaccharde and their liposomes

圖3 白及多糖脂質體對酪氨酸酶抑制率的影響

Figure 3 Inhibition rates of tyrosinase byBettilastriatapolysaccharde liposomes at different concentrations

2.5 紫外吸收光譜分析

由圖4可知，隨著白及多糖脂質體含量的增加，酪氨酸酶紫外吸收最大波長向右偏移，波峰由282 nm漂移至286 nm，屬于紅移，表明該脂質體與酪氨酸酶位點結合，使酪氨酸酶發(fā)生了變化。282，286 nm處出現(xiàn)新物質，而白及多糖脂質體的位于282 nm處，說明此處為白及多糖和酪氨酸酶的結合物。

2.6 熒光光譜分析

由圖5可知，酪氨酸酶的最大熒光峰出現(xiàn)在334 nm處。加入白及多糖脂質體后，酪氨酸酶的熒光強度逐漸降低，說明白及多糖脂質體對酪氨酸酶的熒光具有猝滅作用，且猝滅作用隨酪氨酸酶濃度的增加而變強；同時也表明白及多糖脂質體與酪氨酸酶發(fā)生了相互作用，改變了酪氨酸酶構象。

圖4 紫外吸收光譜

Figure 4 Ultraviolet absorption spectrum ofBettilastriatapolysaccharde liposomes on tyrosinase

圖5 熒光猝滅圖

Figure 5 Fluorescence quenching of tyrosinase byBettilastriatapolysaccharide liposomes

2.7 白及多糖脂質體對酪氨酸酶的熒光猝滅機制

以速度倒數(shù)1/v為縱坐標，底物濃度倒數(shù)1/[s]為橫坐標作LINEWEAVER-BWK雙倒數(shù)法圖如圖6所示。

抑制類型的判斷標準為：① 競爭性，Vmax不變，Km值增加；② 非競爭性，Vmax增加，Km值不變；③ 混合性，Vmax增加，Km值減??；④ 反競爭性：Vmax減小，Km減小。由表1可知，隨著白及多糖脂質體濃度的增加，Vmax基本保持不變，Km值逐漸增大，說明白及多糖脂質體為競爭性抑制。白及多糖類似于底物，可與底物競爭酪氨酸酶活性中心的結合位點，從而抑制酪氨酸酶活性。

圖6 白及多糖脂質體對酪氨酸酶抑制的LINEWEAVER-BWK圖

Figure6 LINEWEAVER-BWK diagram of tyrosinase inhibition byBettilastriatapolysaccharde liposomes

表1 白及多糖脂質體抑制酪氨酸酶活性的動力學參數(shù)

Table 1 Kinetic parameters of the inhibition of tyrosinase activity byBettilastriatapolysaccharide liposomes

濃度/(mg·mL-1)KmVmax0.00.940 50.292 61.61.107 70.307 63.21.270 70.298 46.41.548 30.298 712.81.796 80.289 6

假設抑制劑對酪氨酸酶熒光猝滅機制為動態(tài)猝滅，以Fo/Fc為縱坐標，白及多糖脂質體濃度為橫坐標作圖，分析猝滅機制。

由圖7可知，白及多糖脂質體Kq為5×1012L/(mol·s)，各類猝滅劑對生物大分子的最大擴散常數(shù)為2.0×1010L/(mol·s)；白及多糖脂質體對酪氨酸酶的熒光猝滅可能不是通過擴散進行的動態(tài)猝滅，而是靜態(tài)猝滅，說明白及多糖脂質體與酪氨酸酶的相互作用為非共價反應，形成了特定結構的化合物。

圖7 白及多糖脂質體對酪氨酸酶熒光猝滅的Stern-Volmer圖

Figure 7 Stern-Volmer diagram of tyrosinase fluorescence quenching byBettilastriata polysaccharide liposomes

由圖8可知，線性方程為y=-1.071 1x+5.160 9，R2=0.999 8，斜率即白及多糖脂質體與酪氨酸酶的結合位點數(shù)n=1.071 1，截距即結合常數(shù)Ka=6.58×105L/mol。

3 結論

通過納米脂質體制備技術制備了白及多糖脂質體，其粒徑分布均勻，穩(wěn)定性良好。該脂質體保留了白及多

圖8 白及多糖脂質體對酪氨酸酶的雙倒數(shù)圖

Figure 8 Double reciprocal plot of tyrosinase toBettilastriatapolysaccharide liposomes

糖抑制酪氨酸酶活性的特征，通過競爭酪氨酸酶的結合點(n=1.071 1)，從而抑制酪氨酸酶活性，能有效地滲入皮膚且其輸送能力強于傳統(tǒng)基質介質的。后續(xù)可利用白及多糖打造新型的保健食品或美白功效的化妝品。