CaCl2對低鹽羅非魚肌球蛋白凝膠持水性和微觀結(jié)構(gòu)的影響

馮 瑞 洪鵬志 楊 萍 周春霞

(1. 廣東海洋大學(xué)食品科技學(xué)院，廣東 湛江 524088；2. 廣東省水產(chǎn)品加工與安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 湛江 524088；3. 廣東省海洋食品工程技術(shù)研究中心，廣東 湛江 524088；4. 南方海洋科學(xué)與工程廣東省實(shí)驗(yàn)室〔湛江〕，廣東 湛江 524025)

肌球蛋白是肌肉蛋白的主要功能成分，占魚肉肌原纖維蛋白的55%～60%[1]，經(jīng)熱處理可以形成凝膠，在魚糜制品加工中起關(guān)鍵作用[2]。肌球蛋白凝膠形成過程涉及蛋白質(zhì)分子的展開、聚集和交聯(lián)，最終通過增強(qiáng)蛋白質(zhì)分子間相互作用形成穩(wěn)定的三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，從而決定產(chǎn)品的持水性和質(zhì)構(gòu)特性[3]。而肌球蛋白是鹽溶性蛋白，在體外低鹽(<0.2 mol/L NaCl)溶液中容易自發(fā)聚集成纖絲[4-5]，熱誘導(dǎo)肌球蛋白分子無法有效解離/展開，由纖絲之間的相互作用形成聚集體，凝膠特性較差[6]。凝膠制作通常需2%～3%的鹽溶解肌球蛋白，促進(jìn)蛋白質(zhì)分子展開，增加分子間相互作用，誘導(dǎo)凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的形成[7]，因此，魚糜制品生產(chǎn)過程中需添加一定量的食鹽(NaCl)來保證產(chǎn)品的安全性，還可以改善其質(zhì)地和風(fēng)味。而膳食中過量攝入鈉會導(dǎo)致血壓升高，增加心血管和腎臟疾病的風(fēng)險(xiǎn)[8]。

目前，常見的改善低鈉條件下魚糜制品凝膠性的方法有：使用與NaCl相似的其他氯化鹽作為替代品，或使用蛋白質(zhì)、水化膠體、轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶等凝膠增強(qiáng)劑[9-11]。研究[12-14]表明，二價(jià)陽離子(Ca2+、Mg2+、Zn2+等)通過與蛋白質(zhì)分子帶負(fù)電的羧基之間的鹽橋作用，誘導(dǎo)蛋白質(zhì)的交聯(lián)，改善魚糜凝膠的功能特性，其效果與離子類型和濃度有關(guān)。Ca2+是霍夫邁斯特序列中使蛋白質(zhì)不穩(wěn)定的陽離子[15]，會促進(jìn)蛋白質(zhì)的展開，增強(qiáng)熱處理過程中相鄰蛋白質(zhì)分子間疏水相互作用和二硫交聯(lián)，進(jìn)一步促進(jìn)鈣橋的形成，從而改變其凝膠性能[16-18]。此外，Ca2+也可能激活內(nèi)源性轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶的活性，催化特定的酰基轉(zhuǎn)移反應(yīng)，通過ε-(γ-谷氨酰)賴氨酸交聯(lián)形成更強(qiáng)的魚糜凝膠網(wǎng)絡(luò)[19]。經(jīng)Ca2+誘導(dǎo)展開的肌球蛋白再進(jìn)行適當(dāng)?shù)母邏禾幚?<300 MPa)會導(dǎo)致分子進(jìn)一步展開，增強(qiáng)分子間共價(jià)和非共價(jià)相互作用，形成致密有序的肌球蛋白凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，但強(qiáng)的高壓處理(500 MPa)會導(dǎo)致肌球蛋白過度變性，破壞蛋白質(zhì)與水的相互作用[20]。

試驗(yàn)擬以羅非魚肌球蛋白為研究對象，在幾種典型鹽濃度(1，50，150，600 mmol/L NaCl)下，考察CaCl2添加量對肌球蛋白熱誘導(dǎo)凝膠持水性和微觀結(jié)構(gòu)的影響，探討適量鈣離子對低鹽肌球蛋白凝膠性能的改善及機(jī)理，為新型低鹽水產(chǎn)蛋白凝膠制品的開發(fā)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鮮活羅非魚：取其背部白肉、分裝、-75 ℃貯藏備用，市售；

氯化鉀、六水合氯化鎂、硫酸銨、乙二胺四乙酸二鈉：分析純，廣州化學(xué)試劑廠；

5-腺苷三磷酸二鈉鹽(ATP)、二硫蘇糖醇(DTT)、馬來酸：廣州齊云生物科技有限公司；

乙二醇-雙-(2-氨基乙醚)四乙酸(EGTA)：分析純，上海源葉生物科技有限公司；

快速Lowry法蛋白含量測定試劑盒：上海荔達(dá)生物科技有限公司；

無水氯化鈣：分析純，廣州市金華大化學(xué)試劑有限公司；

β-巰基乙醇：分析純，上海麥克林生化科技有限公司。

1.2 主要儀器設(shè)備

高速冷凍離心機(jī)：Avanti J-26sxp型，美國貝克曼公司；

紫外分光光度計(jì)：Cary 60型，安捷倫科技(中國)有限公司；

恒溫水浴鍋：TU-20HT型，英國比比科技有限公司；

傅里葉紅外光譜儀：TENSOR27型，德國布魯克公司；

掃描電子顯微鏡：JEM-7610-F型，日本電子株式會社。

1.3 方法

1.3.2 肌球蛋白溶液及其熱誘導(dǎo)凝膠的制備 將提取的肌球蛋白溶液分成4組，分別用不同鹽濃度(1，50，150，600 mmol/L NaCl)的磷酸鹽緩沖液(20 mmol/L Na2HPO4—NaH2PO4，pH 7.0)透析24 h(4 ℃)，采用Lowry法試劑盒檢測其蛋白含量，并用對應(yīng)鹽濃度的透析液調(diào)節(jié)至蛋白濃度為20 mg/mL，即為各離子強(qiáng)度下的肌球蛋白溶液。取上述肌球蛋白溶液20 mL，加入10 mmol/L CaCl2，水浴升溫(20～80 ℃，1 ℃/min)處理，80 ℃保溫30 min，迅速冷卻，4 ℃保存過夜，48 h內(nèi)使用。以不添加CaCl2的肌球蛋白體系為對照組。

1.3.3 濁度的測定 將1.3.2透析后的各肌球蛋白溶液稀釋至1.0 mg/mL，加入10 mmol/L CaCl2，以不添加CaCl2的肌球蛋白體系為對照組。水浴升溫處理(20～80 ℃，1 ℃/min)，每隔10 ℃取樣，參照Hemung等[17]的方法進(jìn)行濁度的檢測。

1.3.4 凝膠持水性的檢測 參照文獻(xiàn)[18]。

1.3.5 掃描電子顯微鏡(SEM)觀察 取制備好的凝膠樣品用刀片切成1 mm厚度的小片，采用戊二醛溶液固定、磷酸鹽緩沖液洗滌，然后依次進(jìn)行乙醇脫水、叔丁醇置換、冷凍干燥和噴金[11]，加速電壓8 kV下放大10 000倍觀察。

1.3.6 凝膠化學(xué)作用力的測定 參照Hwang等[22]的四段溶解法并稍作修改。其4種溶液分別為0.6 mol/L NaCl(S1)、0.6 mol/L NaCl+1.5 mol/L尿素(S2)、0.6 mol/L NaCl+8 mol/L尿素(S3)、0.5 mol/Lβ-巰基乙醇+0.6 mol/L NaCl+8 mol/L尿素(S4)。取制備好的肌球蛋白凝膠樣品2 g，加入20 mL S1，5 000 r/min勻漿2 min，4 ℃放置1 h，10 000 r/min離心25 min，上清液V1于4 ℃保存，所得沉淀1加入20 mL S2，勻漿、靜置、離心處理得上清液V2和沉淀2，沉淀中加入20 mL S3，同上處理得上清液V3和沉淀3，沉淀中加入20 mL S4，同上處理后得上清液V4。上述各步離心所得上清液分別加入等體積的20%三氯乙酸溶液，10 000 r/min離心15 min，去上清液，沉淀分別用2 mL NaOH溶液(1 mol/L)溶解，采用Lowry試劑盒測定其蛋白質(zhì)含量。離子鍵、氫鍵、疏水相互作用和二硫鍵的貢獻(xiàn)分別用溶解于S1、S2、S3、S4的蛋白含量與勻漿的蛋白含量的比值表示。

1.3.7 傅里葉變換紅外光譜測定及二級結(jié)構(gòu)分析 將凝膠樣品冷凍干燥后粉碎，稱取約1 mg的樣品與溴化鉀混合壓片，較低空氣濕度下收集紅外光譜(4 000～400 cm-1)，分辨率4 cm-1。使用OMNIC 7.3和Peakfit Version 4.12軟件對酰胺Ⅰ帶(1 700～1 600 cm-1)圖譜進(jìn)行基線校正、平滑、去卷積處理，并通過Gaussian曲線擬合，得到肌球蛋白凝膠樣品的二級結(jié)構(gòu)含量[23]。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

所有試驗(yàn)重復(fù)3次，使用SPSS 22軟件進(jìn)行方差分析(ANOVA)，并通過Duncan的多范圍檢驗(yàn)顯著性差異(P<0.05)。

2 結(jié)果與分析

2.1 CaCl2對熱處理過程中肌球蛋白體系濁度的影響

由圖1可知，肌球蛋白體系的濁度隨鹽濃度的增大逐漸下降(P<0.05)。低離子強(qiáng)度(1，50 mmol/L NaCl)下，肌球蛋白溶解性差，體系明顯渾濁[24]，隨著升溫處理的進(jìn)行，濁度持續(xù)增加(P<0.05)，且升溫至40 ℃時(shí)濁度增加已非常明顯，體系熱穩(wěn)定性差。生理離子強(qiáng)度(150 mmol/L NaCl)下，未經(jīng)熱處理的肌球蛋白溶液已基本澄清，當(dāng)處理溫度≥40 ℃時(shí)，溶液明顯變得渾濁，且變化比50 mmol/L NaCl下的聚集更明顯。這表明生理離子強(qiáng)度下部分解離的肌球蛋白分子比低離子強(qiáng)度下的纖絲結(jié)構(gòu)更容易展開和變性，大量疏水基團(tuán)暴露導(dǎo)致分子間通過疏水相互作用聚集。當(dāng)NaCl濃度為600 mmol/L時(shí)，肌球蛋白溶解，分子以單體或寡聚物形式存在，體系澄清透明，且在升溫處理過程中溶液保持澄清，肌球蛋白分子展開和聚集達(dá)到平衡，肌球蛋白重鏈頭部聚合，分子聚集不明顯。

字母不同表示差異顯著(P<0.05)

添加CaCl2后，不同鹽濃度下肌球蛋白體系濁度增加(P<0.05)，且熱處理過程中濁度增大尤為明顯(P<0.05)，表明適量CaCl2對肌球蛋白體系有較好的交聯(lián)聚集效果，可能與Ca2+存在下肌球蛋白分子間的鹽橋作用及不同鹽濃度下分子的熱變性聚集有關(guān)。低鹽濃度(1，150 mmol/L)下，熱處理升溫至40 ℃時(shí)，肌球蛋白結(jié)構(gòu)伸展并開始變性聚集，Ca2+的鹽橋作用導(dǎo)致分子間熱聚集增強(qiáng)，繼續(xù)升溫至80 ℃時(shí)，變性的肌球蛋白由于分子間共價(jià)和非共價(jià)相互作用進(jìn)一步聚集，體系濁度繼續(xù)增大(P<0.05)。高鹽濃度(600 mmol/L)下，熱誘導(dǎo)肌球蛋白單體分子展開的速度大于聚集速度，Ca2+誘導(dǎo)肌球蛋白聚集不明顯，與低濃度CaCl2對魚肌球蛋白溶液濁度的影響類似[17]。

2.2 CaCl2對肌球蛋白凝膠持水性的影響

由圖2可知，隨著鹽濃度的增加，肌球蛋白熱凝膠形成能力增強(qiáng)，持水性增加(P<0.05)，透明度增大，表明不同鹽濃度下形成的凝膠三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)以及分子聚集方式和聚集體的大小可能不同。低離子強(qiáng)度(1，50 mmol/L NaCl)下，肌球蛋白溶解性差，熱處理過程中分子不能充分展開和相互作用，分子表面疏水性增加不明顯[25]，纖絲迅速聚集形成大的顆粒聚集體，此時(shí)持水性極差，熱誘導(dǎo)肌球蛋白體系呈不透明弱凝膠，具有較強(qiáng)的流動(dòng)性。隨著離子強(qiáng)度的增加，解離的肌球蛋白分子與水分子的相互作用增強(qiáng)，肌球蛋白溶解性增大，受熱后其結(jié)構(gòu)更容易展開，分子表面疏水性增加，體系的熱凝膠形成能力增強(qiáng)。當(dāng)NaCl濃度為150 mmol/L時(shí)，體系可以形成硬凝膠，透明度增加，持水性>60%。當(dāng)NaCl濃度為600 mmol/L時(shí)，低溫?zé)崽幚韺?dǎo)致肌球蛋白重鏈頭部聚合，總巰基含量下降，在高溫條件下肌球蛋白尾部有序聚集，形成規(guī)則的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，截留水分的能力增強(qiáng)，此時(shí)持水性達(dá)94.23%。

字母不同表示差異顯著(P<0.05)

添加CaCl2后，不同離子強(qiáng)度下肌球蛋白熱誘導(dǎo)凝膠的持水性顯著增大(P<0.05)，表明Ca2+的添加有利于蛋白質(zhì)分子的展開和(或)聚集，肌球蛋白分子間相互作用增強(qiáng)，且低鹽條件下改善尤為明顯。當(dāng)NaCl濃度為1 mmol/L時(shí)，添加CaCl2后肌球蛋白凝膠的持水性提高了26%；當(dāng)NaCl濃度為150 mmol/L時(shí)，添加CaCl2后肌球蛋白凝膠的白度增加，肉眼觀察即可識別出凝膠色差的變化；當(dāng)NaCl濃度為600 mmol/L 時(shí)，添加CaCl2后肌球蛋白凝膠的持水性達(dá)98%。添加CaCl2后不同離子強(qiáng)度下肌球蛋白熱誘導(dǎo)形成不透明凝膠，表明Ca2+存在時(shí)肌球蛋白分子聚集的速度大于展開的速度[26-27]。低鹽條件下，Ca2+存在導(dǎo)致纖絲的肌球蛋白分子部分展開和分子間緊密聚集，分子間通過強(qiáng)的相互作用形成不透明凝膠，硬度較大[28]；高鹽條件下，肌球蛋白分子充分展開，高溫時(shí)的Ca2+誘導(dǎo)肌球蛋白尾部有序聚集，凝膠透明度下降，白度和持水性增加。因此，適量添加CaCl2能明顯改善凝膠的持水性。

2.3 CaCl2對肌球蛋白凝膠微觀結(jié)構(gòu)的影響

由圖3可知，當(dāng)NaCl濃度為1～150 mmol/L時(shí)，肌球蛋白溶解度差，熱誘導(dǎo)肌球蛋白纖絲快速聚集形成粗糙的交聯(lián)鏈，凝膠微觀結(jié)構(gòu)孔徑較大，呈現(xiàn)清晰而不規(guī)則的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，對水分子的截留能力差[29]，其中50 mmol/L NaCl下的凝膠網(wǎng)絡(luò)孔徑最大，與濁度結(jié)果一致；當(dāng)NaCl濃度為600 mmol/L時(shí)，肌球蛋白分子充分展開并有序聚集，熱誘導(dǎo)凝膠呈固態(tài)結(jié)構(gòu)，表面平滑均勻，但仍存在較大的孔洞，與純的魚肌球蛋白熱凝膠微觀結(jié)構(gòu)類似[30]。添加CaCl2后，不同鹽濃度下肌球蛋白熱誘導(dǎo)凝膠微觀結(jié)構(gòu)顯示清晰的緊密交叉連接，細(xì)膩均勻的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)形成，凝膠孔徑極小，因此凝膠的持水性和白度增加，且1，150 mmol/L NaCl下的凝膠微觀結(jié)構(gòu)改善尤為明顯，進(jìn)一步表明適量添加Ca2+能誘導(dǎo)肌球蛋白分子展開和變性。

2.4 CaCl2對肌球蛋白凝膠化學(xué)作用力的影響

由圖4可知，0.6 mol/L NaCl—8 mol/L尿素溶液(S3)中肌球蛋白凝膠溶解度最高(P<0.05)，其次為二硫鍵，離子鍵和氫鍵所占比例較小，表明分子間疏水相互作用和二硫鍵是維持肌球蛋白熱誘導(dǎo)凝膠的主要化學(xué)作用力。低鹽濃度(1～150 mmol/L NaCl)下，肌球蛋白熱誘導(dǎo)凝膠二硫鍵比例隨鹽濃度的增加顯著升高(P<0.05)，主要是由于鹽離子的作用加快了肌球蛋白分子結(jié)構(gòu)的部分展開，熱誘導(dǎo)分子內(nèi)部疏水基團(tuán)和巰基逐漸暴露，分子間疏水相互作用增強(qiáng)，分子明顯聚集；隨著熱處理溫度的升高，巰基氧化成二硫鍵，導(dǎo)致不可逆的凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)形成。高鹽濃度(600 mmol/L NaCl)下，肌球蛋白呈單體，α-螺旋含量較高，相應(yīng)的熱凝膠中離子鍵和氫鍵含量高，二硫鍵含量降低，體系呈透明軟凝膠，彈性模量和凝膠硬度下降，與微觀結(jié)構(gòu)結(jié)果基本一致。添加CaCl2后，肌球蛋白熱凝膠的主要化學(xué)作用力仍為疏水相互作用和二硫交聯(lián)，但二硫鍵所占比例明顯升高(P<0.05)，疏水相互作用比例下降(P<0.05)，離子鍵和氫鍵所占比例降低，且1 mmol/L NaCl下的二硫鍵含量增加最明顯。因此，適量添加Ca2+能促進(jìn)熱處理過程中肌球蛋白分子結(jié)構(gòu)及化學(xué)作用力的變化，其改進(jìn)效果與凝膠持水性和微觀結(jié)構(gòu)一致。

圖3 CaCl2對羅非魚肌球蛋白熱誘導(dǎo)凝膠掃描電鏡圖的影響

S1. 離子鍵 S2. 氫鍵 S3. 疏水相互作用 S4. 二硫鍵

2.5 肌球蛋白二級結(jié)構(gòu)的變化分析

研究[31]表明，α-螺旋是魚糜蛋白質(zhì)的主要構(gòu)象，魚糜凝膠中肌球蛋白的α-螺旋結(jié)構(gòu)部分轉(zhuǎn)化為β-折疊、β-轉(zhuǎn)角和無規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)，其中β-折疊和無規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)是維持魚糜凝膠的主要蛋白質(zhì)構(gòu)象，且β-折疊結(jié)構(gòu)對凝膠強(qiáng)度的貢獻(xiàn)最大。由圖5可知，肌球蛋白分子包含棒狀尾部和球狀頭部，棒狀尾部由α-螺旋構(gòu)成。未經(jīng)熱處理的肌球蛋白分子以α-螺旋結(jié)構(gòu)為主，且隨鹽濃度的增加(1～600 mmol/L NaCl)肌球蛋白α-螺旋含量增加。添加CaCl2后，凝膠中肌球蛋白α-螺旋結(jié)構(gòu)含量降低，而β-折疊和無規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)含量增大，且低鹽條件下變化更加明顯。1 mmol/L NaCl條件下添加CaCl2后，凝膠肌球蛋白α-螺旋比例從17.51%下降到13.72%，β-折疊比例從31.06%增加到36.70%，表明CaCl2的作用有利于低鹽條件下肌球蛋白凝膠的形成，與Ca2+誘導(dǎo)肌球蛋白凝膠二級結(jié)構(gòu)的變化結(jié)果類似[17]。因此，適量添加CaCl2可誘導(dǎo)熱處理過程中肌球蛋白分子結(jié)構(gòu)展開，α-螺旋結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)化成β-折疊結(jié)構(gòu)，分子間相互作用增強(qiáng)，明顯改善低鹽條件下肌球蛋白凝膠的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)及持水性。

3 結(jié)論

試驗(yàn)表明，不同鹽濃度(1，50，150，600 mmol/L NaCl)下，肌球蛋白熱誘導(dǎo)凝膠的微觀結(jié)構(gòu)和持水性能存在差異。但適量添加Ca2+可誘導(dǎo)不同鹽濃度下肌球蛋白分子部分展開和變性，熱處理過程中更多的疏水基團(tuán)和交聯(lián)位點(diǎn)暴露，肌球蛋白分子α-螺旋結(jié)構(gòu)部分轉(zhuǎn)化成β-折疊結(jié)構(gòu)，進(jìn)一步促進(jìn)鈣橋及分子間疏水相互作用和二硫鍵的形成，肌球蛋白分子有序交聯(lián)形成致密均勻的三維凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，凝膠持水性顯著提高(P<0.05)，且低鹽條件下改善更明顯。

1～8分別為1 mmol/L NaCl、1 mmol/L NaCl + CaCl2、50 mmol/L NaCl、50 mmol/L NaCl + CaCl2、150 mmol/L NaCl、150 mmol/L NaCl + CaCl2、600 mmol/L NaCl、600 mmol/L NaCl + CaCl2

圖5 CaCl2對熱誘導(dǎo)凝膠中肌球蛋白二級結(jié)構(gòu)的影響

Figure 5 Effect of CaCl2addition on the secondary structure of myosin in heat-induced gel