基于納米復(fù)合材料直讀顯色檢測養(yǎng)殖水中的孔雀石綠

賴姝毓 王鼎南 宋 健 張宜明 龐林江 柴婷婷

(1浙江農(nóng)林大學(xué)農(nóng)業(yè)與食品科學(xué)學(xué)院，浙江 杭州 311300；2浙江省水產(chǎn)技術(shù)推廣總站，浙江 杭州 310023)

孔雀石綠(malachite green，MG)是一種三苯甲烷類染料，具有高毒素、高殘留、致畸、致癌、致突變等副作用[1]，因其對水霉病具有顯著的治療效果且廉價(jià)易得被養(yǎng)殖者們應(yīng)用于水產(chǎn)養(yǎng)殖中。 MG 進(jìn)入魚體后經(jīng)過代謝會轉(zhuǎn)變?yōu)閷θ梭w具有更大危害的隱性孔雀石綠(leucomalachite green，LMG)[2-3]。 上世紀(jì)90年代開始，美國、日本、英國等國家就禁止MG 應(yīng)用于食用水產(chǎn)動物的養(yǎng)殖，我國也于2002年將其列入禁止檢出清單[4]。 截至目前，MG 濫用的情況已經(jīng)得到好轉(zhuǎn)，但仍有養(yǎng)殖者在水產(chǎn)養(yǎng)殖過程中非法使用MG。 因此，實(shí)現(xiàn)MG 快速檢測以及現(xiàn)場監(jiān)測已成為水產(chǎn)技術(shù)部門急需解決的關(guān)鍵問題。

針對MG 的檢測目前大多采用液相色譜法(high performance liquid chromatography，HPLC)[5-6]、液質(zhì)聯(lián)用法( high performance liquid chromatography-mass spectrum，HPLC-MS)[7-8]等。 近年來還開發(fā)出了一些快速檢測新方法，如基于生物免疫反應(yīng)的酶聯(lián)免疫方法(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)[9]、電化學(xué)發(fā)光結(jié)合分子印記技術(shù)[10]以及表面增強(qiáng)拉曼光譜法(surface-enhanced raman scattering，SERS)[11]。 盡管儀器分析方法具有靈敏度及精度較高等優(yōu)勢[12-13]，但也存在成本較高、耗時(shí)較長、檢測結(jié)果不夠直觀等問題；而直讀顯色具有便捷與低成本的優(yōu)勢，因此，開發(fā)新型的直讀顯色方案仍是食品安全快速檢測不斷追求的目標(biāo)。

薄層色譜法(thin-layer chromatography，TLC)是一種經(jīng)典的顯色檢測方法，兼具紙色譜與柱色譜的優(yōu)勢，至今仍被諸多研究者應(yīng)用于實(shí)際樣品的分析[14]。 雖然通過TLC 與其他儀器進(jìn)行偶聯(lián)，如光密度儀、拉曼光譜儀[15-16]，可以更加有效地實(shí)現(xiàn)快速靈敏檢測，但對于現(xiàn)場快速分析而言，直讀顯色分析仍然具有一定優(yōu)勢。 傳統(tǒng)方法采用展開后噴涂顯色劑[17-18]或直接在展開劑中加入顯色劑[19]以實(shí)現(xiàn)對待測物的檢測，其檢測過程存在以下問題:1)背景信號過高；2)噴霧法依賴個(gè)人操作其顯色結(jié)果難以重現(xiàn)；3)精確定量能力不足等。 本研究在TLC 基礎(chǔ)上結(jié)合納米自顯色技術(shù)，提出了一種可以實(shí)現(xiàn)自顯色的TLC 條帶快速靈敏檢測MG 方案。 依托于TLC 板本身的優(yōu)異分離性能及優(yōu)化后的展開條件，采用單向展開方式將目標(biāo)待測物(LMG)與實(shí)際樣品中的其他干擾物質(zhì)完全分離。 進(jìn)一步基于溶膠-凝膠法將傳統(tǒng)顯色劑構(gòu)建為納米顯色材料，承載了納米材料所獨(dú)有的優(yōu)異性能，以打印方式將其固定在LMG 對應(yīng)比移值(retention factor value，Rf)處，形成一個(gè)自顯色區(qū)，顯色后的斑點(diǎn)更加清晰，提高了信噪比，高度重現(xiàn)的顯色結(jié)果保證其能夠?qū)崿F(xiàn)半定量直讀顯色分析。 本研究針對養(yǎng)殖水體中MG 殘留構(gòu)建的TLC 直讀自顯色方案，在食品安全快速分析領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

三氯甲烷、碘酸鉀、七水合硫酸鋅等，分析純，均購自上海國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；乙腈，色譜純，美國TEDIA 公司；鹽酸羥胺，分析純，杭州源葉生物科技有限公司；碘化鉀，分析純，西隴化工股份有限公司；對甲苯磺酸(純度＞99%)，上海麥克林生化科技有限公司；甲苯，分析純，上海凌峰化學(xué)試劑有限公司；鈦酸四丁酯(純度＞99%)，北京百靈威科技有限公司；MG/LMG 標(biāo)準(zhǔn)品(純度＞99%)，美國aladdin 公司；D5、D6孔雀石綠同位素(純度＞99%)，德國Dr.Ehrensorfer 公司。 0.1 mol·L-1鈦酸四丁酯前驅(qū)體溶液，自制。

樣品提取液:取3 g 鹽酸羥胺和0.24 g 對甲苯磺酸溶于100 mL 水。

MG/LMG 標(biāo)準(zhǔn)儲備液:分別稱取0.1 g MG/LMG標(biāo)準(zhǔn)品用乙腈溶解后定容至10 mL，此為10 mg·mL-1高濃度標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液。 進(jìn)一步用乙腈稀釋濃度為0.060、 0.125、 0.250、 0.500、 1.000、 2.000、 4.000、8.000 μg·mL-1的LMG/MG 梯度工作溶液。

1.2 儀器與設(shè)備

25 μL 微量進(jìn)樣針，寧波鎮(zhèn)海玻璃儀器有限公司；SPDY-1A 平面色譜點(diǎn)樣儀，南京科邁理特科學(xué)儀器有限公司；硅膠G60 薄層層析板，德國默克公司；DLSB-2005 循環(huán)水式多用真空泵，杭州大衛(wèi)科教儀器有限公司；FLUKO FA25 均質(zhì)器，德國費(fèi)魯克公司；XW-80A 渦旋混合器，上海精科實(shí)業(yè)有限公司；2-16KL 高速冷凍離心機(jī)，德國西格瑪公司；NK200 可視化氮吹儀，杭州米歐儀器有限公司；馬爾文粒度儀3000，英國馬爾文儀器有限公司。

1.3 納米顯色劑制備與表征

納米顯色劑制備:將普通定量濾紙裁成圓形，尺寸與抽濾裝置上的砂芯漏斗相匹配。 倒入適量前驅(qū)體溶液，靜置，使濾膜表面充分吸收前驅(qū)體溶液，以無水乙醇充分洗滌后加入5%碘酸鉀溶液，待其水解反應(yīng)1 min 后再以無水乙醇沖洗將濾紙抽濾干燥。 在此過程中，碘酸鉀分子以吸附包裹和交聯(lián)固定的方式構(gòu)筑在納米二氧化鈦結(jié)構(gòu)中。 重復(fù)上述過程最終形成負(fù)載碘酸鉀@二氧化鈦的濾紙。 取下濾紙置于燒杯中，加適量乙醇均質(zhì)即可得到分散均勻的碘酸鉀@二氧化鈦納米復(fù)合材料。

電鏡表征:精確移取10 μL 碘酸鉀@二氧化鈦納米復(fù)合材料乙醇分散液(0.381 g·mL-1)于掃描電鏡觀察碘酸鉀@二氧化鈦的粒子形貌。 取1 mL 納米復(fù)合材料分散液，室溫?fù)]發(fā)干燥后經(jīng)溴化鉀壓片等過程供紅外光譜表征。 另取適量納米復(fù)合材料分散液稀釋后，用馬爾文粒度儀測量其粒徑。

1.4 基于TLC 法的樣品提取

取20 mL 養(yǎng)殖水用濾紙凈化去除沙石等雜質(zhì)，轉(zhuǎn)移至分液漏斗中，加入2 mL 樣品提取液及20 mL 二氯甲烷，振揺5 min，靜置分層后收集二氯甲烷層于梨形瓶中。 重復(fù)提取1 次，合并二氯甲烷層，30℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至近干。 用乙腈復(fù)溶后，加入0.3 mL 0.2 mol·L-1硼氫化鈉[2]將樣品中的MG 全量轉(zhuǎn)化為LMG，氮吹濃縮至0.2 mL，待上樣。

1.5 納米直讀顯色條帶的制備

取活化完成的層析板(2 cm×4.5 cm)，在距底邊0.5 cm 與4.0 cm 處標(biāo)記，分別為上樣位置與展開劑前沿到達(dá)時(shí)的終止位置，展距為3.5 cm。 打印裝置吸取約10 μL 碘酸鉀@二氧化鈦納米復(fù)合材料乙酸分散液(0.381 g·mL-1)打印在LMG 對應(yīng)Rf值區(qū)域。

1.6 TLC 直讀顯色方法

在TLC 板上樣線均勻標(biāo)注上樣位置，用平面色譜點(diǎn)樣儀以點(diǎn)狀上樣方式打印20 μL MG 標(biāo)準(zhǔn)溶液及已處理的水樣，控制上樣點(diǎn)直徑范圍在0.2 cm 以內(nèi)。 待展開劑溶液(氯仿∶甲醇，4 ∶5)前沿展開至TLC 板上的終止線時(shí)取出，快速浸入KI 顯色支持液中，加熱至顯色。 顯色路線如圖1 所示。

1.7 顯色條件的優(yōu)化

1.7.1 碘酸鉀@二氧化鈦納米復(fù)合材料打印量的優(yōu)化 取活化完成的層析板，做3 組對照，分別打印5、10、15 μL 均質(zhì)碘酸鉀@二氧化鈦鈉米復(fù)合材料乙醇分散液(0.381 g·mL-1)，干燥后待用。 每塊板均上樣32、16 ng·spot-1LMG 2 個(gè)點(diǎn)，對比顯色效果選擇碘酸鉀@二氧化鈦復(fù)合材料最佳打印量。

1.7.2 顯色支持液濃度的優(yōu)化 取3 塊成品顯色板，分別上樣32、16 ng·spot-1LMG 2 個(gè)點(diǎn)，對比1%、5%、10%質(zhì)量濃度KI 顯色支持液的顯色效果，確定最佳濃度。

圖1 直讀顯色路線示意圖Fig.1 Diagram of color rendering principle

1.7.3 顯色支持液pH 值的優(yōu)化 給予一定的酸性環(huán)境，可使本研究所報(bào)道的直讀顯色體系達(dá)到增色效果，因此本研究用硫酸調(diào)節(jié)KI 顯色支持液pH 值為1、2、3、4，對比顯色效果。

1.7.4 顯色增色液濃度的優(yōu)化 試驗(yàn)過程中發(fā)現(xiàn)硫酸鋅水溶液可有效消除背景干擾，對比測試了CK(僅加熱，不另外浸溶液)、水溶液硫酸根離子溶液及鋅離子溶液，確定適當(dāng)濃度的鋅離子可消除TLC 板顯色后殘留的黃色碘化物，選取3 塊直讀顯色板均上樣32、16 ng·spot-1LMG 2 個(gè)點(diǎn)，顯色完全后浸入濃度為0.1、0.5、1.0 mol·L-1鋅離子溶液中，對比3 組顯色效果。

1.8 方法驗(yàn)證

1.8.1 線性范圍和檢出限 LMG 標(biāo)準(zhǔn)品溶液(0.06～8.0 μg·mL-1)上樣20 μL 于直讀顯色TLC 板上，顯色后用Image J 軟件對顯色后條帶進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，探究條帶色度對應(yīng)峰面積與LMG 濃度(ng·spot-1)之間的相關(guān)性，并對校正數(shù)據(jù)進(jìn)行線性回歸分析，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算本方法的肉眼最低檢出限。

1.8.2 精密度、準(zhǔn)確度和回收率 選取空白養(yǎng)殖水樣品加入MG 標(biāo)準(zhǔn)品使其濃度分別為20、40 和80 μg·L-1。 基于Image J 軟件在同一天用該方法對每種添加量的混合物進(jìn)行6 次分析，計(jì)算回收率與精密度。

1.9 HPLC-MS 方法

取20 mL 水加入30 μL 1.0 μg·mL-1D5、D6 孔雀石綠同位素內(nèi)標(biāo)溶液，用二氯甲烷與乙腈進(jìn)行提取，具體步驟與儀器條件參考DB 12/T 866-2019[20]。

2 結(jié)果與分析

2.1 碘酸鉀＠二氧化鈦納米復(fù)合材料的表征結(jié)果

通過溶膠-凝膠過程，可以形成不同粒徑的氧化物納米顆粒[21-23]。 本研究經(jīng)過3 層組裝，獲得了均勻分散的碘酸鉀@二氧化鈦納米復(fù)合材料，其掃描電鏡形貌以及分散狀態(tài)如圖2-A 所示。 用馬爾文粒度儀檢測其粒徑主要分布在758 nm 左右。 由圖2-B 可知，碘酸鉀@二氧化鈦納米復(fù)合材料與碘酸鉀單質(zhì)在700 ～820 cm-1光譜區(qū)存在相似的吸收峰，此為IO-3 基團(tuán)所造成的[24]，證實(shí)碘酸鉀被有效地組裝在納米二氧化鈦上，形成了復(fù)合材料。

圖2 碘酸鉀＠二氧化鈦納米復(fù)合材料微觀結(jié)構(gòu)掃描電鏡圖(A)與紅外表征(B)Fig.2 SEM images of potassium iodate＠nano-titanium dioxide nanocomposites(A)infrared absorption spectrum(B) of potassium iodate nanomaterials

2.2 檢測參數(shù)與條件優(yōu)化

2.2.1 展開劑及Rf值的確定 本研究所用展開劑為氯仿∶甲醇=4 ∶5，展開后LMG 斑點(diǎn)集中，不會出現(xiàn)拖尾現(xiàn)象。 其中，LMGRf值為0.914，因此納米顯色材料選擇打印在該Rf處。

2.2.2 碘酸鉀@二氧化鈦納米復(fù)合材料打印量的優(yōu)化 由圖3-A 可知，當(dāng)?shù)馑徕汙二氧化鈦納米復(fù)合材料打印量為10 μL 時(shí)，條帶顏色最明顯，推測是因?yàn)? μL 碘酸鉀@二氧化鈦形成的碘單質(zhì)較少，氧化能力不足因而顯色較淺；而打印量為15 μL 時(shí)二氧化鈦過量對顯色造成了覆蓋。 綜上，碘酸鉀@二氧化鈦納米復(fù)合材料的最佳打印量為10 μL。

2.2.3 顯色支持液濃度的優(yōu)化 圖3-B 為不同濃度KI 顯色支持液顯色對比。 在1% KI 濃度條件下，KI與碘酸鉀@二氧化鈦形成的碘單質(zhì)有限，缺乏氧化能力造成顯色斑點(diǎn)顏色較淺。 對比5%、10%組顯色條帶，10%組顯色未明顯加深，因而KI 顯色支持液最佳濃度為5%。

2.2.4 顯色支持液pH 值的優(yōu)化 KI 在酸性條件下會與碘酸鉀、孔雀石綠形成藍(lán)綠色離子絡(luò)合物[25]，據(jù)此進(jìn)一步對KI 顯色支持液在不同pH 值條件下的顯色效果進(jìn)行比較(圖3-C)，結(jié)果表明KI 顯色支持液pH 值為3 時(shí)可達(dá)到最佳顯色效果。

2.2.5 增色液濃度的優(yōu)化 鋁基薄層板上打印碘酸鉀@二氧化鈦納米材料，與KI 顯色支持液反應(yīng)后會在TLC 板上殘留黃色碘化物，僅靠加熱無法使其完全升華因而會產(chǎn)生顏色干擾。 試驗(yàn)過程中發(fā)現(xiàn)浸硫酸鋅水溶液可有效消除背景顏色，并達(dá)到一定的增色效果。

在這一過程中，由于大部分鋅離子絡(luò)合物是無色的[26]，因此推測是鋅離子與過量的碘離子-元素碘形成了無色絡(luò)合物從而消除了背景干擾色。 而已被氧化顯色的MG 本身是一種絡(luò)合物，鋅離子不會與其反應(yīng)覆蓋顯色信號。 通過試驗(yàn)進(jìn)一步佐證了該推測(圖3-D)，0.5 mol·L-1硫酸根溶液不能消除背景，僅鋅離子溶液消除了背景干擾。 經(jīng)過優(yōu)化，鋅離子溶液濃度優(yōu)選為0.5 mol·L-1。

2.3 孔雀石綠直讀顯色方法的線性范圍、半定量分析及檢出限

圖4-A 為LMG 標(biāo)準(zhǔn)顯色板(1.25～160 ng·spot-1)，用Image J 軟件對顯色后的條帶進(jìn)行灰度分析，將顏色深淺度轉(zhuǎn)化為峰高信號(圖4-C)，采集每個(gè)斑點(diǎn)對應(yīng)的峰面積數(shù)據(jù)(n=3)建立MG 標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖4-D)。 由圖4-D 可知，峰面積與MG 濃度之間存在明確的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)達(dá)到了0.99。

圖3 顯色條件優(yōu)化合圖Fig.3 Optimized combination of color rendering conditions.

圖4 孔雀石綠直讀顯色檢測合圖Fig.4 Malachite green direct reading color development detection map

選取當(dāng)?shù)氐酿B(yǎng)殖水樣品按照前文所述方法進(jìn)行前處理提取，另添加一定量的MG 標(biāo)記為陽性加標(biāo)樣品，基于樣品提取液中雜質(zhì)較多，故采用10 μL 上樣量進(jìn)行顯色分析(圖4-B)。 對照標(biāo)準(zhǔn)曲線圖，用肉眼判斷得出陽性樣品MG 總量濃度約為30 μg·L-1，根據(jù)Image J 軟件分析得出該樣品所對應(yīng)的峰面積，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出陽性樣品中MG 總量為30.48 μg·L-1，與肉眼判斷結(jié)果相符。 該法線性范圍為2.5 ～160 μg·L-1，肉眼最低識別檢出限為1.6 μg·L-1。

2.4 回收率和精密度

根據(jù)加標(biāo)后的檢測結(jié)果，計(jì)算得出本方法回收率為69.5%～78.38%，RSD 在12%左右，作為半定量方法，本方法的精確度在可接受范圍內(nèi)。

2.5 HPLC-MS 驗(yàn)證

將直讀顯色法檢測得出的養(yǎng)殖水陰性樣品與陽性樣品按照DB 12/T 866-2019[20]的液質(zhì)方法進(jìn)行分析，陰性樣品未檢出，陽性樣品中MG 含量為34.65 μg·L-1，顯色分析結(jié)果在可行性范圍內(nèi)。

3 討論

在本研究中，樣品中的MG 首先被全量還原為LMG，這與岑劍偉等[27]報(bào)道的HPLC 法及錢蓓蕾等[28]開發(fā)的免疫試劑盒法類似。 轉(zhuǎn)化后的LMG 溶于有機(jī)相而易被濃縮，為下一步TLC 顯色分析做好了準(zhǔn)備。 條帶上固定的碘酸鉀@二氧化鈦會與KI 加熱形成游離態(tài)Ⅰ2[29-31]，該游離態(tài)碘先將LMG 氧化為MG，在酸性條件下再與Ⅰ3-特異性結(jié)合形成MG(Ⅰ3)2藍(lán)綠色絡(luò)合物[25，32](顯色原理如圖5 所示)。 宋友林等[24]研究指出鋅離子與靛藍(lán)分子的絡(luò)合物在可見光區(qū)沒有吸收峰，據(jù)此推測在本研究中鋅離子與殘留的碘化物形成了無色絡(luò)合物。 而顯色后的MG 本身已是絡(luò)合物，鋅離子不會與其反應(yīng)，由此消除了顏色干擾，增加了信噪比。 上述顯色機(jī)理，為今后研究其他三苯甲烷類染料(結(jié)晶紫等)顯色分析提供了理論基礎(chǔ)。

圖5 顯色原理示意圖Fig.5 Diagram of color rendering principle

一般來說，TLC 分析中顯色完成后的顯色斑點(diǎn)顏色深淺度與樣品濃度之間存在相關(guān)關(guān)系，Image J 軟件的分析結(jié)果也驗(yàn)證了這一點(diǎn)。 本研究構(gòu)筑的碘酸鉀@二氧化鈦粒徑遠(yuǎn)小于TLC 板上的固體硅膠顆粒，當(dāng)待測組分轉(zhuǎn)移至顯色區(qū)時(shí)，易被硅膠固相表面負(fù)載的納米顯色材料基于毛細(xì)管力吸附至表面，放大顯色信號。此外，優(yōu)化后的直讀顯色分析方法是一個(gè)可控的體系，表現(xiàn)為良好的重現(xiàn)性及精密度。 基于以上幾點(diǎn)，本研究得以突破常規(guī)TLC 法中肉眼難以實(shí)現(xiàn)半定量分析的局限性，同時(shí)HPLC-MS 法也驗(yàn)證了肉眼判定結(jié)果的可靠性。

目前，MG 的檢測手段以HPLC 為代表的儀器檢測方法為主。 Sun 等[33]報(bào)道的HPLC 法中，MG 的檢出限為0.2 μg·L-1，高于本研究方法的靈敏度，但沒有出現(xiàn)明顯差異。 從成本角度來說，本方法依賴2 cm×4.5 cm 的TLC 條帶及3～4 mL 展開劑即可顯色分析，成本較低。 此外，利用多通道條帶展開裝置，可同時(shí)進(jìn)行大批量樣品的檢測，且樣品提取后完成展開及顯色僅需15 min，這是儀器方法難以實(shí)現(xiàn)的一點(diǎn)。 因此，本研究所報(bào)道的方法在水產(chǎn)安全快速分析領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用前景。 針對養(yǎng)殖水體樣品，通過本研究的顯色策略可實(shí)現(xiàn)MG 的快速定性及半定量分析。 但面對更復(fù)雜的基質(zhì)，如魚、蝦類樣品，其體內(nèi)富含油脂、蛋白質(zhì)，還需進(jìn)一步優(yōu)化展開體系及前處理方法，以期在復(fù)雜基質(zhì)中捕獲目標(biāo)待測物。

4 結(jié)論

本研究基于溶膠-凝膠法構(gòu)筑了碘酸鉀@二氧化鈦納米復(fù)合材料，結(jié)合碘化鉀顯色支持液，首次提出了一種基于TLC 圖像分析法的MG 快速檢測與半定量方法。 采用Image J 軟件對顯色后的條帶進(jìn)行分析，證實(shí)顯色斑點(diǎn)色度與待測物濃度之間存在明確的線性關(guān)系(R2=0.99)，即可用肉眼以色度為指標(biāo)進(jìn)行半定量判別。 同時(shí)，HPLC-MS 法證實(shí)本方法具有良好的特異性及可靠性。 本方法線性范圍為2.5 ～160 μg·L-1，檢出限達(dá)1.6 μg·L-1，RSD 在12%左右，精確度較好。 本研究構(gòu)筑的直讀顯色條帶具有簡單快捷、結(jié)果直觀及成本較低的優(yōu)勢，且操作步驟簡單，即使缺乏相關(guān)基礎(chǔ)的人員也極易入手，在水產(chǎn)品及養(yǎng)殖水體中MG 超標(biāo)檢測領(lǐng)域具有較大的應(yīng)用潛力。 此外，基于本研究提出的顯色機(jī)理，有望在TLC 平臺上實(shí)現(xiàn)其他三苯甲烷類染料(結(jié)晶紫等)的直讀顯色分析，構(gòu)建一個(gè)多組分顯色分析體系。