一株產耐高溫蛋白酶蠟樣芽胞桿菌的分子鑒定和酶學性質研究

佘新松 邵建揚 孫春巧 方茹月 儲雅琪 江治萍 代雨婷 柏曉輝

(1黃山學院生命與環(huán)境科學學院，安徽 黃山 245041；2績溪縣林業(yè)局，安徽 宣城 245300)

蛋白酶是能水解蛋白質的一種生物催化劑，其催化反應速度快、條件溫和、環(huán)保無污染，被廣泛應用于制革、食品、醫(yī)藥衛(wèi)生及化妝品等行業(yè)。 在制革工業(yè)中，蛋白酶用于去除原料皮殘肉、膠原間隙蛋白和類粘蛋白，使處理后的皮革柔軟[1]；在食品工業(yè)上，蛋白酶主要用于嫩化肉類、水解蛋白質制備調味液、制作干酪等[1]；在醫(yī)藥衛(wèi)生領域，中性蛋白酶用于水解藏羊血清蛋白來制備抗氧化肽[2]，也可用于制備抗癌藥物中間體[3]等；中性蛋白酶還可用于生產去除老化角質的化妝品[4]。

蛋白酶廣泛存在于動物、植物及微生物組織中[5]。 受動植物資源的限制，目前工業(yè)用蛋白酶主要來源于微生物發(fā)酵[1，6-7]，其所用微生物主要為細菌、霉菌、少量酵母菌和放線菌[8-9]。 已有研究表明，產蛋白酶的細菌菌株主要包括枯草芽孢桿菌屬(Bacillus subtilis)[10-11]、短芽孢菌屬(Brevibacillus)[12-13]和鹽單胞菌屬(Halomonas)[14]。根據(jù)最適反應pH 值，蛋白酶可分為酸性(pH 值2.0～6.0)、中性(pH 值6.0 ～9.0)和堿性(pH 值9.0 以上)三大類[1]，其中中性蛋白酶研究最早，研究得較為清楚[4]；然而，目前還鮮有文獻報道能耐受60℃及以上高溫的中性蛋白酶。

為篩選產耐高溫蛋白酶的菌種，本研究以黃山學院校園林地的根際土壤為材料，采用酪素固體培養(yǎng)基篩選法篩出一株產蛋白酶菌株HSU-2，通過生理生化試驗及16SrDNA 序列測定予以鑒定，并對其酶學性質進行研究，以期為該菌種的工業(yè)化應用和蛋白酶的大規(guī)模生產及應用提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 土壤樣品 土壤采自黃山學院校園內樹林下，距離表層土壤約5 cm 處；用采樣鏟挖開表層土壤后，取出根際土壤放入已滅菌的錐形瓶中，帶回實驗室備用。

1.1.2 試驗儀器 超凈工作臺(ZHJH-C2109B，上海智城)、恒溫培養(yǎng)箱(MQD-B2R，上海旻泉)、高壓滅菌鍋(SQ510C，重慶雅馬拓)、培養(yǎng)箱(ZGP-2050，上海智城)、三孔恒溫電熱水槽(DK-8D，上?？镓悓崢I(yè))、紫外可見分光光度計(UV-765，上海精密科學儀器)、離心機(AvantiJ-E，美國貝克庫爾特公司)。

1.1.3 試劑 胰酶解酪蛋白(trypticase)、干酪素、蛋白胨、葡萄糖、酵母膏、淀粉、甲基紅、草酸銨結晶紫、番紅和碘液、過氧化氫(H2O2)、十二烷基磺酸鈉(sodium dodecyl sulfate，SDS)、聚乙二醇辛基苯基醚(triton X-100)、吐溫80(tween 80)購于上海生工公司；NaCl、ZnCl2、Na2HPO4·7H2O、MgSO4·7H2O、CaCl2、FeSO4、KH2PO4、甘油和95%乙醇等購于上海國藥集團。

1.1.4 培養(yǎng)基 酪素篩選固體培養(yǎng)基配制參照萬文結等[15]的配方，種子活化培養(yǎng)基和發(fā)酵培養(yǎng)基配制參照Cui 等[16]的配方。

1.2 方法

1.2.1 產蛋白酶菌株的分離與純化 稱取1.0 g 采集的土壤，加入到含有活化培養(yǎng)基的錐形瓶中，搖勻后置于80℃水浴鍋中保溫10 min；然后將其放置在28°C、 180 r·min-1振蕩培養(yǎng)箱中恒溫培養(yǎng)24 h。 剩余的土樣密封保存，備用。 將培養(yǎng)24 h 的培養(yǎng)液再次置于80 ℃水浴鍋中保溫10 min，采用10 倍稀釋法將上述增殖后培養(yǎng)液依次稀釋至10-3、10-4和10-5。 分別移取100 μL 稀釋液涂布于酪素固體培養(yǎng)基上，置于28℃恒溫箱中培養(yǎng)24 h，觀察酪素固體培養(yǎng)基上菌落周圍的透明水解圈，測量透明圈直徑(H)和菌落直徑(C)，選取H/C 比值大的菌落進行純化，利用劃線法對上述菌落進行多次純化，直至純化出單菌落，且菌落特征穩(wěn)定。 根據(jù)H/C 比值，對純化后的菌落進行編號，并保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 產蛋白酶菌株的鑒定 取上述步驟純化后H/C 比值最大的編號為HSU-2 菌株進行菌落形態(tài)特征觀察，并參照《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》[17]在牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基中分別添加淀粉、甲基紅溶液及不同濃度NaCl 溶液制備成不同固體培養(yǎng)基，觀察菌株HSU-2生長情況；同時觀察該菌株對H2O2的水解能力，并鑒定其生理生化特征。 提取菌株的基因組DNA，并委托蘇州金唯智(GENEWIZ)公司利用通用測序引物27F:5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′和1492R:5′-TA CGGC T A C C T T G T T A C G A C TT-3′對該菌株的16SrDNA 序列進行擴增和測定。 將測序獲得的16SrDNA序列放入NCBI 數(shù)據(jù)庫中比對，選擇序列一致性在99.43%以上的菌株序列，利用序列比對軟件Clustal X 2.1[18]和進化分析軟件MEGA 6.06[19]構建分子進化樹[20-21]，鑒定該菌株的種類。

1.2.3 酪蛋白標準曲線的繪制 參考柏曉輝等[22]的方法配制酪蛋白標準溶液，并根據(jù)280 nm 波長處吸光值制作酪蛋白標準曲線，重復3 次。 本研究測定的酪蛋白溶液濃度(X)與其吸光值(Y)的回歸方程為:Y=1.164 7X+ 0.006 1(R2=0.999 8)。

1.2.4 蛋白酶粗酶液制備 從-80℃冰箱中取出保存的菌株HSU-2(該菌株的相關研究結果已向國家知識產權局申請專利保護)，用種子活化培養(yǎng)基活化12 h 后，將菌種接種至發(fā)酵培養(yǎng)基中，于28℃、180 r·min-1搖床中恒溫發(fā)酵5 d。 吸取發(fā)酵后培養(yǎng)液，于8 000 r·min-1離心5 min，上清液即為粗酶液。

1.2.5 蛋白酶的最佳反應pH 值 參照柏曉輝等[22]的方法測定蛋白酶的最佳反應pH 值。 分別取pH 值為4、5、6、7、8、9 的緩沖液3.5 mL，加入10 mg·mL-1酪蛋白溶液0.5 mL，再加入1 mL 粗酶液，混合均勻后將反應液置于37℃水浴恒溫反應20 min。 取出反應液，加入1 mL 20% (w/v) 三氯乙酸(trichloroacetic acid，TCA)充分混勻，終止反應。 在加入酪蛋白前，先用TCA 將粗酶液失活，作為對照組。 將TCA 終止反應后的反應液配平，并于12 000 r·min-1離心5 min，小心吸取上清液于280 nm 波長處測定吸光值，重復3 次，取平均值。 將試驗組數(shù)據(jù)減去對照組，并根據(jù)上述酪蛋白標準曲線計算出該蛋白酶的酶活力。 酶活力單位定義為每毫升酶液在一定pH 和溫度下，每分鐘分解酪蛋白產生1 μg 酪氨酸為一個酶活力單位，以U·mL-1或U·g-1表示[23]。

1.2.6 蛋白酶的最佳反應溫度 配制上述步驟中測定的最佳pH 值緩沖液，取52.5 mL 該緩沖液至250 mL 燒杯中，分別向該緩沖液中依次加入10 mg·mL-1酪蛋白溶液7.5 mL，粗酶液15 mL，混合均勻后每試管分裝5 mL，分別放置于30、40、50、60 和70℃恒溫水浴鍋中反應20 min，然后依次加入1 mL 20% TCA 終止反應；配平后12 000 r·min-1離心5 min，吸取上清液于280 nm 波長處測定吸光值，重復3 次，取平均值。

1.2.7 H2O2對蛋白酶酶活力的影響 分別在最佳pH 值緩沖液中加入濃度分別為1%、5%和10% (v/v)的H2O2并定容至3.5 mL，加入1 mL 粗酶液，混勻后將溶液置于冰上分別處理20、40 和60 min；然后分別加入10 mg·mL-1酪蛋白溶液0.5 mL，混勻后將反應液置于最佳反應溫度下水浴20 min，加入1 mL 20% TCA終止反應；配平后12 000 r·min-1離心5 min，吸取上清液于280 nm 波長處測定吸光值，重復3 次。 同時，以不加H2O2的粗酶液為對照，按以上步驟測定其酶活力并將其設為100%，比較H2O2對該蛋白酶酶活力的影響。

1.2.8 去污劑對蛋白酶酶活力的影響 在最佳pH值緩沖液中加入濃度分別為0.5%、1.0%、2.5%和5.0% (w/v)的SDS、Triton X-100 或Tween 80 并定容至3.5 mL，加入1 mL 粗酶液，混勻后將溶液置于冰上分別處理20、40 和60 min；按照1.2.7 方法比較去污劑對該蛋白酶酶活力的影響。

1.2.9 金屬離子對蛋白酶酶活力的影響 按照1.2.6 方法測定加入1 mmol·L-1MgCl2、ZnCl2、KCl、NiCl2和CaCl2處理5 min 后的酶活力，比較金屬離子對蛋白酶酶活力的影響。

2 結果與分析

2.1 菌株HSU-2 的分子鑒定

采用透明圈法從土壤樣品中篩選到一株產耐高溫蛋白酶的菌株HSU-2(圖1)。 該菌株在酪素篩選固體培養(yǎng)基上形成明顯的透明水解圈，且H/C 比值約為4.1。 該菌株在酪素固體培養(yǎng)基上形成的菌落呈圓形且較干燥，菌落中間微白、四周微黃。 部分生理生化指標檢測發(fā)現(xiàn)，該菌株的淀粉水解實驗、接觸酶實驗、甲基紅實驗均為陽性，該菌生長過程不需要NaCl 或僅能在1% NaCl 培養(yǎng)基上生長，而5%或10% 的NaCl 會抑制該菌株的生長(表1)。

表1 菌株HSU-2 的生理生化試驗結果Table 1 Physiological and biochemical results of strain HSU-2

圖1 菌株HSU-2 的菌落特征Fig.1 Colony characteristics of strain HSU-2

利用通用引物27F 和1492R 擴增菌株HSU-2 的16SrDNA 序列用于測序分析，結果顯示，菌株HSU-2的16SrDNA 序列約為1 407 bp。 將獲得的序列放入NCBI 數(shù)據(jù)庫中用BLAST 工具進行同源性分析，比對結果顯示，與菌株HSU-2 序列同源性較高的菌株來源于芽孢桿菌屬(Bacillussp.)。 從比對結果中選擇與菌株HSU-2 序列一致性均為99.43%以上的菌株序列，利用軟件ClustalX 2.1 進行多序列比對，同時參照文獻[20-21]的方法構建分子進化樹(圖2)。 結果表明，菌株HSU-2 與Bacillus cereusstrain JCM 2152 等5 株蠟樣芽孢桿菌位于相同的進化樹分支上。 結合以上菌株的菌落、部分生理生化特征及16SrDNA 進化分析結果，將菌株HSU-2 鑒定為蠟樣芽孢桿菌(Bacillus cereus)。

2.2 pH 值對蛋白酶酶活力的影響

由圖3 可知，酸性(pH 值＜5)條件下菌株HSU-2產蛋白酶酶活力較低；當反應液pH 值升高至7 時，其酶活力明顯升高至最大值(311.85 U·mL-1)；當pH 值繼續(xù)升高至偏堿性(pH 值8 ～9)時，該蛋白酶活力有所降低。 與偏酸性條件相比，該蛋白酶在偏堿性條件仍可維持較高的酶活力。 以上結果表明，菌株HSU-2產蛋白酶的最佳反應pH 值為7，且在一定范圍內具有耐堿性。

2.3 溫度對蛋白酶酶活力的影響

在上述試驗測定的菌株HSU-2 產蛋白酶最佳反應pH 值7 條件下，測定不同溫度(30、40、50、60 和70℃)對該蛋白酶酶活力的影響(圖4)。 結果表明，溫度為30～60℃時，蛋白酶酶活力隨著溫度的升高而升高，且在溫度為60℃時達到最大，為418.10 U·mL-1； 當溫度繼續(xù)升高，蛋白酶酶活力開始下降。 因此，菌株HSU-2 產蛋白酶最佳反應溫度為60℃。

2.4 其他因素對蛋白酶酶活力的影響

圖2 基于16S rDNA 序列比對結果構建菌株HSU-2 的分子進化樹Fig.2 Phylogenetic tree based on 16S rDNA gene sequences of HSU-2 and representatives

圖3 pH 值對酶活力的影響Fig.3 Effect of pH value on enzyme activity

圖4 溫度對酶活力的影響Fig.4 Effect of temperature on enzyme activity

2.4.1 H2O2對蛋白酶酶活力的影響 以pH 值7.0、反應溫度60℃時的蛋白酶酶活力為100%，檢測不同濃度H2O2對菌株HSU-2 產蛋白酶酶活力的影響，結果如圖5。 1% H2O2可提高菌株HSU-2 產蛋白酶的酶活力，而5%或10% H2O2可降低菌株HSU-2 產蛋白酶的酶活力。 同時，隨著H2O2處理時間的延長，1%、5%和10% H2O2均會不同程度地降低菌株HSU-2 產蛋白酶的酶活力。

圖5 過氧化氫對酶活力的影響Fig.5 Effect of H2O2 on enzyme activity

2.4.2 3 種去污劑對蛋白酶酶活力的影響 以pH 值7.0、反應溫度60℃時的蛋白酶酶活力為100%，檢測3種不同種類及濃度的去污劑對菌株HSU-2 產蛋白酶酶活力的影響。 由圖6-A 可知，當去污劑SDS 濃度分別為0.5%、1.0%和2.5%時，處理該蛋白酶20 min 對其酶活力無顯著影響；隨著處理時間延長至40、60 min，3 種濃度的SDS 仍對該蛋白酶的酶活力無顯著影響。 而當SDS 濃度升高至5.0%時，處理不同時間后使得該蛋白酶的酶活力略有降低，但酶活力仍維持在95%以上。

由圖6-B 可知，去污劑Triton X-100 濃度分別為0.5%、1.0%和5.0%時，菌株HSU-2 產蛋白酶的酶活力略微提高；且隨著處理時間延長至40、60 min，該蛋白酶的酶活力均可維持在100%以上。

由圖6-C 可知，當去污劑Tween 80 濃度分別為0.5%、1.0%和5.0%時處理該蛋白酶20 min，該蛋白酶的酶活力可提高至115.8%～122.7%；處理40 min，該蛋白酶的酶活力提高至123.3%～133.6%；處理60 min，該蛋白酶的酶活力仍維持在119.6%～126.6%。

圖6 去污劑十二烷基磺酸鈉(A)、聚乙二醇辛基苯基醚X-100(A)和吐溫80(C)對酶活力的影響Fig.6 Effects of detergents sodium dodecyl sulfonate(A)，Triton X-100(B)，and Tween 80(C) on enzyme activity

2.4.3 金屬離子對蛋白酶酶活力的影響 以pH 值7.0、反應溫度60℃時的蛋白酶酶活力為100%，檢測終濃度為1 mmol·L-1的Mg2+、Zn2+、K+、Ni2+等對該蛋白酶酶活力的影響(圖7)。 結果表明，Mg2+、Zn2+、K+、Ni2+和Cu2+5 種金屬離子可明顯降低該蛋白酶的酶活力，其中Zn2+抑制作用最強，酶活力降低至34.0%；Ni2+和Cu2+抑制作用次之，酶活力分別降至50.5%和45.2%；Mg2+和K+抑制作用較弱，酶活力分別降至85.8%和81.0%。 相反，Ca2+可提高該蛋白酶的酶活力至116.5%。

圖7 金屬離子對酶活力的影響Fig.7 Effects of metal ions on enzyme activity

3 討論

微生物來源的蛋白酶在造紙、皮革加工、液體洗滌劑制備、食品加工和醫(yī)療等工業(yè)領域具有重要應用價值。 尤其堿性和熱穩(wěn)定性蛋白酶是較為重要的一類[24]。 耐高溫蛋白酶具有耐熱性，可廣泛用于食品加工、皮革加工和洗滌劑制備等工業(yè)，已成為國內外酶研究的熱點[25]。 然而，目前可用于較苛刻環(huán)境下的高溫蛋白酶和菌株資源非常稀少，篩選高溫蛋白酶高產菌株、優(yōu)化發(fā)酵條件并獲得大量蛋白酶是急需解決的問題[26]。

蠟樣芽胞桿菌(Bacillus cereus)可產生具有工業(yè)應用價值的蛋白酶，如于平等[27]篩選到一株高產新型中性蛋白酶的蠟樣芽孢桿菌；劉麗莉等[28]篩選到一株膠原蛋白酶高產菌株B. cereusMBL13；楊姍等[29]篩選出一株產脫毛蛋白酶的菌株B. cereusSZ-4；但菌株B.cereusMBL13 和B. cereusSZ-4 所產蛋白酶對50℃以上的熱穩(wěn)定性較差[28-29]，不具備耐熱性。 本研究篩選到1 株產蛋白酶菌株B. cereusHSU-2，酶活參數(shù)測定結果表明該蛋白酶最適pH 值為7.0、最適反應溫度為60℃，且在最適條件下酶活力可達418.10 U·mL-1，遠高于菌株B. cereusMBL13 產蛋白酶的酶活力(36.80 U·mL-1)[28]。 該蛋白酶的耐受溫度為60℃，遠高于菌株MBL13 所產膠原蛋白酶(最適酶活溫度為40℃)能耐受的溫度；且該蛋白酶的最適pH 低于菌株SZ-4 產脫毛蛋白酶的最適pH 值10.0。 同時，劉麗莉等[28]和楊姍等[29]報道Mg2+、Zn2+、Ca2+對菌株B. cereusMBL13產膠原蛋白酶和菌株B. cereusSZ-4 產脫毛蛋白酶酶活力有促進作用，Cu2+可顯著抑制這些酶的活性；而本研究發(fā)現(xiàn)Mg2+、Zn2+、Cu2+可抑制菌株HSU-2 產蛋白酶的酶活力，Ca2+可促進其酶活力，這與以上2 種蛋白酶的特征有明顯差別，表明菌株HSU-2 產蛋白酶是一種新型中性蛋白酶。 中性蛋白酶可在中性pH 下將動植物蛋白水解為小分子多肽，是釀造、食品、飼料、醫(yī)藥及生物降解等行業(yè)中不可或缺的酶[30]，具有潛在重要工業(yè)開發(fā)價值。

蛋白酶的最大應用領域是洗滌劑工業(yè)[1]。 研究表明日化洗滌品如洗潔精、洗衣液、洗衣粉等pH 值為7.0 ～10.2[31]。 而歐洲使用加酶洗衣粉的比列高達85%，且歐洲人習慣于在洗衣前先用40 ～60℃熱水浸泡[1]。 本研究還發(fā)現(xiàn)，盡管菌株HSU-2 產蛋白酶最適pH 值為7.0，但在pH 值8.0～9.0 范圍內其酶活仍能維持在最大酶活力的90.6%以上；尤為重要的是該蛋白酶能耐受60℃高溫和5.0% SDS 的作用。 因此，菌株HSU-2 產蛋白酶也可用于洗滌產品的開發(fā)，較為適合研發(fā)用于出口歐洲地區(qū)使用的加酶洗衣粉。

4 結論

本研究利用酪素培養(yǎng)基篩選法篩選出一株產蛋白酶B. cereus菌株HSU-2，其產蛋白酶的最適反應pH值和溫度分別是7.0 和60℃，是一種耐高溫的中性蛋白酶；在最適pH 和溫度下，菌株HSU-2 產蛋白酶發(fā)酵液的酶活力達418.10 U·mL-1。 該蛋白酶可耐受5.0% H2O2、5.0% SDS 和5.0% Triton X-100 作用，而5.0% Tween 80 可明顯提高該蛋白酶的酶活力。Mg2+、Zn2+、K+、Ni2+和Cu2+可明顯抑制該蛋白酶酶活力，而Ca2+可提高其酶活力。 本研究結果為菌株HSU-2 的工業(yè)化應用開發(fā)奠定了研究基礎。